Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Роль цитокинов в регуляции межклеточного гомеостаза 10
1.1.1. Классификация цитокинов иммунной системы: структурно-молекулярная, биофункциональная, рецепторная 12
1.2. Молекулярно-генетические аспекты гуморального и клеточного иммунного ответа 15
1.2.1. Исследование роли генов, кодирующих цитокины противовоспалительного ряда (IL-1, IL6, aNF) 18
1.2.2. Исследование роли генов, кодирующих цитокины противовоспалительного ряда (IL4, IL10) 26
1.3. Определение содержания цитокинов в биологических жидкостях человека как метод оценки иммунного статуса 28
1.4. Молекулярно-генетические и биохимические аспекты изучения системы биотрансформации ксенобиотиков 30
1.4.1. Гены подсемейства СУР1А1 35
1.4.2. Гены подсемейства СУР2Е1 37
1.4.3. Гены микросомальной эпоксидгидролазы-1 39
1.4.4. КАВ(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1 39
1.5. Основные положения генетического механизма иммунного ответа на ксенобиотики 42
1.6. Влияние иммунокорегирующих препаратов на показатели иммунного статуса 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1.Объект исследования 46
2.2. Материалы исследования 46
2.3. Методы исследования
2.3.1. Генетические методы 49
2.3.1.1. Семейный анализ 50
2.3.2. Молекулярные методы
2.3.2.1. Выделение геномной ДНК методом фенольно-хлорофомной экстракции 51
2.3.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 51
2.3.2.3. Электрофорез в полиакриламидном геле 51
2.3.2.4. ПДРФ-анализ 56
2.3.3. Определение продукции цитокинов клетками цельной крови ех vivo и на фоне приема иммуномодулятора in vivo 57
2.3.4. Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови иммуноферментным методом 2.3.4.1. Определение содержания IL-1(3, IL6, IL10 и aNF 58
2.3.4.2 Определение содержания IL1RA 60
2.3.4.3 Определение содержания IL2, IL4 61
2.3.5. Методы лабораторных исследований 62
2.3.5.1. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Метод Панченкова 63
2.5. Методы статистического анализа результатов исследования 64
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови иммуноферментным методом 66
3.1.1. Корреляционные взаимосвязи между показателями цитокинов у здоровых индивидов и онкологических больных 71
3.1.2. Анализ корреляционной взаимосвязи между продукцией цитокинов и аллельным состоянием полиморфных маркеров генов цитокинового каскада у здоровых индивидов 73
3.2. Анализ наследование аллелей генов, регулирующих цитокиновый каскад. Семейный анализ 76
3.3. Анализ сочетаний генотипов генов семейства IL-1 и их влияния на концентрацию цитокинов в сыворотке крови 84
3.4. Анализ продукции цитокинов у практически здоровых людей в сыворотке крови на фоне стимуляции клеток крови митогеном и после приема иммуномодулятора 86
3.5. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокиновой системы у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией 89
3.6. Исследование роли межгенных взаимодействий 93
3.7. Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией 95
3.7.1. Анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 с геном биотрансформации ксенобиотиков НА1Э(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1 у онкобольных 104
3.8. Анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 и гене клеточного цикла ТР53 107
3.8.1. Анализ ассоциаций гаплотипов 112
Заключение 117
Выводы 118
Список цитированной литературы 120
- Исследование роли генов, кодирующих цитокины противовоспалительного ряда (IL4, IL10)
- Молекулярные методы
- Анализ корреляционной взаимосвязи между продукцией цитокинов и аллельным состоянием полиморфных маркеров генов цитокинового каскада у здоровых индивидов
- Анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 с геном биотрансформации ксенобиотиков НА1Э(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1 у онкобольных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитокиновая система относится к центральным регуляторам гомеостаза, так как обладает широким спектром биологических эффектов (Симбирцев, 2008; Баранов, 2010). Одной из важнейших функций цитокинов является обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем (Mosmann 1986; Belardelli, 1999), при котором происходит модуляция как локальных, так и глобальных механизмов защиты. Образование и высвобождение этих высокоактивных молекул жестко регулируется генетическими механизмами (Симбирцев, 2002; Сенников, 2004). Генетически детерминированная дисрегуляция цитокинов ведет к инициации не только хронических воспалительных процессов, но и к генерализированным нарушениям. Показано, что дисбаланс в продукции белков семейства IL-1 (IL-lpVILlRA/ILlRI) влияет на характер протекания воспалительных заболеваний и является одним из пусковых механизмов патологических процессов (Громова, Симбирцев, 2005). В последние десятилетия активно изучается роль цитокинов в регуляции состояний, связанных с развитием иммунопатологии: острых и хронических воспалительных процессов инфекционной природы, аутоиммунных реакций и различных проявлений аллергии (Карунас, Хуснутдинова, 2007). Особый интерес вызывает вопрос о влиянии цитокинов на процесс неопластической трансформации клеток. Имеется достаточно подтверждений тому, что хроническое воспаление является фактором риска развития опухоли, ее прогрессирования и метастазирования (Coussens, 2002; Tan, 2007; Porta, 2007; Lee et al., 2008; Fidler, 2008; Mantovani, 2008). Согласно современным исследованиям, наиболее перспективными в качестве маркеров опухолевого роста и прогностических факторов при злокачественных новообразованиях являются такие цитокины, как IL-ip, IL-2, IL-4, IL-6, a-TNF и др. Для ряда онкологических заболеваний показана взаимосвязь между концентрацией цитокинов в сыворотке крови и агрессивностью течения, метастатическим потенциалом и риском развития рецидивов (Sivaparvathi et al.,1995; Glas et al., 2004).
На функционирование системы цитокинов могут влиять ксенобиотики, образующие реактивные метаболиты в ходе биотрансформации, которые могут выступать в роли аутоантигенов, вызывающих клеточный или гуморальный иммунный ответ (Ляхович и др., 2000).
В настоящее время, для определения степени напряженности регуляторных механизмов иммунного ответа в клинической практике проводится оценка концентрации цитокинов в сыворотке крови, что лишь констатирует сам факт её повышения или понижения у данного индивида, без учета его генетической конституции. В связи с этим, возрастает необходимость исследования индивидуального генетического профиля, соответствующего его иммунному статусу, что определит направление превентивной и предиктивной корректировки образа жизни каждого человека. Поэтому имеется настоятельная необходимость изучения функционирования полиморфных вариантов генов цитокинового каскада не только семейства интерлейкина-1, но и других цитокинов про- и противовоспалительного ряда, а также генов, регулирующих систему биотрансформации ксенобиотиков в норме и при патологических состояниях.
Цель настоящего исследования заключается в комплексном анализе содержания цитокинов в сыворотке крови при различных сочетаниях аллелей генов цитокинового каскада и системы биотрансформации ксенобиотиков в норме и онкопатологии.
Задачи исследования.
Изучить содержание цитокинов IL-lp\ IL1RA, IL2, IL4, IL-6, ILIO, a-TNF, и CRP в сыворотке крови у здоровых индивидов и онкобольных.
Провести генетический анализ наследования аллелей генов семейства интерлейкин-1, локализованных на 2 хромосоме и аллелей генов микросомальной эпоксидгидролазы-1 и интерлейкина-10, локализованных на хромосоме 1.
Изучить динамику изменения показателей цитокинового профиля при: активации клеток цельной крови митогеном ex vivo и действии иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея» у здоровых индивидов с различной генетической конституцией.
Проанализировать распределение полиморфных вариантов генов цитокинового профиля {IL-lp (rs!143634, 39530Т), IL1RA(VNTR во 2 интроне), ILlRl(rs2287047, -976Т>С), IL4(VNTR в 3 интроне), IL6 (rsl800796, -5720С), ILIO (rs 1800872, -6270А), a-TNF (rs 1800629, -308OA)) и биотрансфорации ксенобиотиков (CYP1A1 (rs 1048943, 4889A>Gj, CYP2E1 Ins 96 bp., EPHX1 {rsl051740, 337T>C и rs2234922, 4156A>G); NQOl {rsl800566, 609OT; rsl 131341, 465C>T)) у здоровых индивидов и в группе с онкопатологией.
Проанализировать распределение частот сочетаний генотипов и оценить роль межгенных взаимодействий полиморфных локусов в изученных генах.
Выявить особенности функционирования генов цитокинового ряда и биотрансформации ксенобиотиков у онкологических больных, носителей «рисковых» аллелей в гене онкосупрессора ТР53.
Научная новизна исследования. Установлена взаимосвязь полиморфных локусов генов цитокинового профиля с показателями спонтанной продукции цитокинов. Выявлены сочетания генотипов семейства интерлейкин-1, имеющих функциональную и адаптивную значимость. Выявлены межгенные взаимодействия полиморфных локусов в генах (IL-lfi (rs1143634), ILIRa (VNTR), ILIRI (rs2287047), влияющие на функционирование генов семейства интерлейкин-1. Показано, что лица, являющиеся носителями сочетаний генотипов семейства интерлейкин-1 {IL-lp (rsl 143634), ILIRa (VNTR), ILIRI (rs2287047): E1E1//I/I//TT, E1E1//I/II/TT, E1E1//I/II/CC, E1E2//I/II/TC, более отзывчивы на действие эндогенного иммуномодулятора, чем индивиды с сочетаниями генотипов E1E1//I/I//TC, E1E1//I/II/TC. Генеалогическим анализом впервые установлено неполное сцепление между генами IL-ip и IL1RA семейства интерлейкин-1, расположенными на 2 хромосоме, генетическое расстояние между которыми составляет 3,3 сМ. Показано, что вследствие кроссинговера образуются новые гаплотипы у потомков. Впервые выявлено что «непротективные» аллели (*Е2/*П/*С) в генах семейства интерлейкина-1 достоверно чаще встречаются у онкологических больных с «рисковыми» аллелями в гене ТР53. Научно-практическая значимость. Основные положения работы включены в лекционный материал к дисциплинам биологического цикла: «Общая генетика», «Биохимия», «Иммунология», «Генетика человека», «Экологическая генетика». Разработан спецкурс «Генетические основы здоровья» и лабораторные практикумы для специальности «Генетика», в рамках которых определяется степень напряженности цитокинового звена иммунитета как прогностического критерия диагностики состояния здоровья студентов. Результаты работы внедрены на кафедре онкологии и хирургии Башкирского государственного медицинского университета и в Республиканском клиническом онкологическом диспансере МЗ РБ при проведении ранней диагностики и организации превентивных мероприятий. В «Центре молекулярно-генетических исследований» кафедры
генетики БГПУ им. М.Акмуллы результаты используются при сравнительном исследовании состояния здоровья студентов и спортсменов. Проводятся совместные мероприятия с кафедрой охраны здоровья и безопасности жизнедеятельности БГПУ им. М.Акмуллы, направленные на развитие осознанного отношения к здоровью и формирование здорового образа жизни молодежи и студентов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на
ежегодных международных конференциях Европейского общества генетиков
человека (Амстердам, 2007; Ґетеборг, 2010), II Международной школе молодых
ученых «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Уфа, 2007), на
республиканской молодежной научно-практической конференции
«Инновационный потенциал молодежной науки» (Уфа, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС, Москва, 2009), IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на Дону, 2010), II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2011), на международном Конгрессе нанотехнологий (круглый стол «Нанотехнологии в медицине», (Уфа, 2011); I Международной Школе-конференции молодых учёных «Спорт: медицина, генетика, физиология, биохимия, педагогика, психология и социология» (Уфа, 2011). Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе, 3 в журналах из Перечня ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 листах машинописного текста, включает обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 26 рисунками. Список цитируемой литературы включает 247 источников, в том числе - 172 иностранных авторов.
Исследование роли генов, кодирующих цитокины противовоспалительного ряда (IL4, IL10)
На сегодняшний день известно, что межклеточные взаимодействия играют ключевую роль в регуляции клеточного гомеостаза и определяют направление пролиферации и дифференцировки, а также осуществление многих эффекторных клеточных функций (Иванов, 2005). Регуляция этих процессов осуществляется путем прямых и обратных связей при участии различных дистантных и локальных механизмов, результатом реализации которых является модификация функциональной активности различных типов клеток (Ярилин, 1999). Существенную роль в становлении и стабилизации контактов между взаимодействующими клетками принадлежит цитокиновой сети (Симбирцев, 2002).
В настоящее время сформированы и теоретически обоснованы принципы ее функционирования, согласно которым цитокины представляют собой универсальную полиморфную регуляторную сеть медиаторов, предназначенных для контроля процессов клеточного гомеостаза кроветворной, иммунной и других систем организма (Иванов, 2005; Сенников, 2004). Для ее правильного функционирования необходимо строгое соблюдение баланса как самих цитокинов, так и их рецепторов, содержание которых подвергается существенным изменениям в зависимости от состояния участвующих во взаимодействиях клеток.
Важно отметить, что экспрессия генов цитокинов является индуцибельным процессом, т.е. большинство цитокинов не синтезируется клетками вне воспалительной реакции и иммунного ответа. При физиологическом состоянии, принятым за норму, спектр детектируемых мРНК цитокинов узок и уровень экспрессии соответствующих генов невысок. При повреждении тканей, воспалении, опухолеобразовании и во многих других физиологических и патологических ситуациях спектр экспрессирующихся генов цитокинов, обладающих как местной, так и дистантной активностью, значительно расширяется, а уровень экспрессии генов, обладающих базальной активностью, многократно возрастает (Rose-John, Schooltink, 2007).
Цитокины синтезируются в ответ на стимуляцию продуцирующих их клеток через короткий промежуток времени. Синтез прекращается в результате действия отрицательных обратных связей, опосредуемых простагландинами, кортикостероидными гормонами и другими факторами, а также за счет механизмов саморегуляции. В основе «выключения» синтеза лежат, как правило, события, ведущие к блокаде транскрипции или/и сокращению времени жизни мРНК. Действие цитокинов инициируется в результате их взаимодействия со специфическими клеточными рецепторными комплексами на поверхностях клеток-мишеней. Количество рецепторов для разных медиаторов значительно варьирует (от 100 до 100 000) (Fischereder, 2007). Рецепторные комплексы связывают свои лиганды-цитокины с очень высокой аффинностью, причем отдельные цитокины способны использовать общие субъединицы рецепторов (Allen et al., 2007; Alves et al., 2007).
Нормальная работа цитокиновой сети во многом базируется на механизмах, лежащих в основе регуляции экспрессии генов цитокинов. Однако эти механизмы изучены далеко не достаточно, что существенно затрудняет понимание закономерностей взаимодействия клеток различных типов, отдельных систем организма и формирования его реакций (Бережная, 2000). Иными словами, многие общие и частные проблемы физиологии, иммунологии и других биологических дисциплин требуют исследования механизмов регуляции экспрессии генов цитокинов. Вместе с тем вызываемые разными причинами нарушения в процессе синтеза цитокинов (гипо- или гиперсинтез, продукция неполноценных форм, нарушения клеточной рецепции и др.) могут быть причиной патологических симптомов и даже причиной заболевания. 1.1.1. Классификация цитокинов иммунной системы: структурно-молекулярная, биофункциональная, рецепторная
В настоящее время классификация цитокинов в основном проводится по их биологическим свойствам: Цитокины в первую очередь регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителиев. Гиперпродукция цитокинов ведет к развитию системной воспалительной реакции и может служить причиной развития ряда патологических состояний, в частности, септического шока. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом, действуя в обоих направлениях (Симбирцев, 2000).
Молекулярные методы
Молекулы гликопротеидов IL-1/3, IL1RA, IL1RI кодируются генами, локализованными кластерно на хромосоме 2 в локусе ql2-14, что позволяет предположить их сцепленное наследование. Для оценки сцепления каждой пары полиморфных локусов использовался коэффициент D (Lewontin, 1984), рассчитанный в программе 2LD. При наличии сцепления между генами, значение коэффициента D должен превышать 0,3.
При анализе сцепления полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 в исследованной выборке практически здоровых индивидов выявлено неравновесие по сцеплению. Так, между полиморфными вариантами генов IL-lfi{rsl 143634)/IL1RA{VNTR) имеется значительное сцепление (D-0,99). Коэффициент D для генов IL-1B (rsll43634)/ILlRI(rs2287047) составил 0,74. Сила сцепления генов IL1RA (VNTR)/ILlRI(rs2287047) равна 0,46. (рис. 16). iblRI(2qU)I_
Расположение генов семейства интерлейкин-1 на 2 хромосоме Таким образом, полиморфные варианты генов семейства интерлейкин-1, расположенные на одной хромосоме, образуют группу сцепления и совместно передаются потомству, что позволяет проведение гаплотипного анализа для определения типа наследования генов данного семейства. Проанализировано 18 семей, включающих 60 человек. Генеалогический анализ двух семей выявил наличие кроссинговера, при котором меняется комбинация аллелей, приводящая к возникновению новых гаплотипов.
Семья №1 состоит из 5 человек (3 мужчины и 2 женщины). У пробанда И.4 (рис. 17) возможно два варианта наследования аллелей генов: 1 вариант. Одна хромосома, несущая гаплотип ( Т/ Е1/ Г) унаследована от отца (1.1) а другая, с гаплотип ом Т/ Е1/ П- от матери (1.2). Возможно, что в этом случае между рецепторным антагонистом интерлейкина-1 и интерлейкином-ір произошел кроссинговер у матери (1.2) в мейозе I её внутриутробного развития; 2 вариант. Одна хромосома, несущая гаплотип Т/ Е1/ 1 унаследована от матери (1.2), а другая с гаплотипом Т/ Е1/ П - от отца. При данном виде наследования можно предположить, что у отца (1.1) произошел кроссинговер при гаметогенезе, способствующий образованию нового гаплотипа. г ш
Генотип дочери (III.5) пробанда (П.4) гомозиготен по «протективным» сочетаниям аллелей, что определяет нормальное функционирование всей цитокиновой системы. Один гаплотип ( Т/ Е1/ 1) унаследован от отца (П.З), а другой набор сочетаний аллелей Т/ Е1/ 1 - от матери (П.4).
У сына (III. 6) пробанда однозначного ответа типа наследования аллелей от родителей, как в случае с дочерью, невозможно. Если предположить, что аллели С/ Е1/ П сцепленно унаследованы от отца (П.З), то сочетание аллелей Т/ Е1/ Н - от матери (П.4). В этом случае, у пробанда (П.4) в профазе мейоза I произошел кроссинговер, и аллели сцепленной группы разобщились, и этот кроссоверный участок унаследовал сын. У П.4 возможны 4 варианта сочетания аллелей в гаплотипах: Т/ Е1/ 1, С/ Е2/% С/ Е2/ 11 , Т/ Е1/ П. Последний гаплотип наследуется индивидом III. 6.
Таким образом, при кроссинговере комбинация аллелей меняется, что приводит к возникновению новых гаплотипов у пробанда П.4. it Наследование генов семейства IL-1 в семье №2 Анализ наследования состава гаплотипа, образованного из аллелей генов семейства интерлейкина-1 в 18 семьях у 60 человек позволяет рассчитать расстояние между генами IL-lfi и IL1RA, расположенными на 2 хромосоме. Генетический анализ показывает, что расстояние между ними равняется 3,3 сМ.
В семье №2, помимо ДНК-типирования, были определены концентрации цитокинов методом ИФА, в котором измерены: спонтанная выработка цитокинов, митоген-индуцированная продукция цитокинов клетками цельной крови и в сыворотке после приема иммуномодулятора растительного происхождения «Эхинацея» (табл.7).
Индивид II.3 (63 года) - носитель сочетаний генотипов {E1E1//I/II//TC) по полиморфным вариантам генов семейства интерлейкин-1 (IL-lfi {rs 1143634), ILlRa (VNTR), ILIRI (rs2287047). Выявлено повышение концентрации интерлейкина-ip (IL-ip) в сыворотке крови относительно нормы в 3 раза (в норме концентрация не превышает 11пг/мл рис. 19). В иммунно-воспалительной реакции важную роль играет повышенная продукция антагониста интерлейкина - 1 (наличие высокопродуцирующего аллеля IL1RA II) и измененная конформация белка рецептора ( С). Видоизмененный рецептор полностью занимает антагонист, препятствуя связыванию его с интерлейкином-lp, вследствие чего интерлейкин-1 р, продуцируемый иммунокомпетентными клетками в ответ на раздражитель, остается в виде растворимой формы и секретируется во внеклеточное пространство в активной форме (Пальцев, 2003; Кетлинский, 2008). Таким образом, интерлейкин-1 Р из-за выше описанных процессов не связывается с клеточным рецептором и не способен передать сигнал от рецептора внутрь клетки, в результате чего не происходит запуска цитокинового каскада, что подтверждается отсутствием интерлейкина - 2 в сыворотке крови. В ответ на индукцию митогеном у данного индивида наблюдается прирост данного
Анализ корреляционной взаимосвязи между продукцией цитокинов и аллельным состоянием полиморфных маркеров генов цитокинового каскада у здоровых индивидов
Среди всех изученных генов биотрансформации ксенобиотиков ген, определяющий функцию фермента НАВ(Р)Н-хиноноксидоредуктазы-1, вызывает особый интерес тем, что обладает двойной функцией. Во-первых, он участвует во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков, преобразуя активные метаболиты в водорастворимые нетоксичные компоненты, предотвращая образование свободных радикалов и активных кислородных молекул, таким образом защищая клетку от окислительного стресса (Perou, 2000; Pineda-Molina, 2001). Во-вторых, NQOl взаимодействует с белком супресором опухоли р53 и предотвращает его разрушение в 20S протеасомах. Стрессы, приводящие к повреждениям ДНК, способны усиливать взаимодействие NQOl с р53, вызывая накопление последнего. Перечисленные процессы проходят при условии, если оба белка полностью функциональны (Asher, 2005).
Известно, что полиморфный вариант rsl800566 в гене NQOl характеризуется практически полным отсутствием ферментативной активности, а полиморфный вариант rs 1131341 - со снижением активности фермента на 25 % (Moran J.L., 1999). В результате снижения ферментативной активности происходит накопление метаболитов, проявляющих себя в качестве иммунотоксикантов.
Исходя из этого, нами проанализированы сочетания аллелей генов семейства интерлейкин-1 (IL-1J3 (rs 1143634), ILlRa (VNTR), ILIRI (rs2287047)) в группе больных РМЖ, являющихся носителями «непротективных» аллелей по полиморфным вариантам (rsl800566; rsl 131341) гена NQOl (рис.25).
У онкобольных с «непротективным» генотипом ТТ {rsl800566) выявлено 4 сочетания генотипов по локусам IL-lf3 {rsl 143634), IL1RA{VNTR), IL1RI {rs2287047) из 27 возможных. Сочетание E1E2//I/II//TC встречается с частотой 40%, на долю сочетаний Е1Е2//П/П//ТС, E2E2//I/II//TC, E1E1//I/II//TT приходится по 20%.
У носителей «непротективного» генотипа ТТ (rsll31341), достоверно чаще встречающегося в изученной группе онкобольных (р=0,001, %2=\2,2Ъ, табл. 12), обнаружено 6 сочетаний из 27 возможных. На долю сочетания E1E1//I/II//CC приходится 29%, E1E1//I/I//TC - 15%. С частотой по 14% встречаются сочетания: E1E2//I/I//TC, E2E2//I/II//TT, E1E1//1/II//CC, E2E2//I/II/CC.
Таким образом, выявлено, что у большинства онкобольных в генотипе сочетаются «непротективные» аллели как в гене NQOl, так и в изученных генах семейства интерлейкин-1. Белок р53 является продуктом гена-супрессора опухоли ТР53 и активируется при повреждениях генетического аппарата.
Известно, что белок р53 экспрессируется во всех клетках организма и его высокий уровень вызывает временную задержку или остановку клеточного цикла в двух критических точках: на границе Gi/S-перехода и на границе G2/M ( Di Leonardo, 1994; Agarwal M.L., Agarwal A., 1995; Чумаков, 2007, 2010). Первая задержка на Gj/S-переходе обеспечивает возможность репарации ДНК, а вторая - на границе G2/M, предотвращает вхождение в митоз при незавершенной репликации (Kastan, 1992; Di Leonardo, 1994; Agarwal M.L., Agarwal A., 1995; Белоусова, 1996; Копнин, 2008; Желтухин, 2010). Если же повреждения существенны и не могут быть репарированы, то ТР53 индуцирует экспрессию белков, приводящих к гибели клетки -апоптозу (Owen-Schaub, 1995; Evan, 1995). Именно поэтому ген ТР53 рассматривают в качестве «молекулярного стража» генома ( Lane, 1992).
В популяциях активность белка р53 в значительной степени модифицирована генетическим полиморфизмом. Наиболее значимыми и хорошо изученными являются три полиморфных варианта гена ТР53: точечная замена гуанина на цитозин в 119-м кодоне 4-го экзона (rs 1042522, p.Arg72Pro), Белок р53 с остатком Arg в положении 72 более эффективно вызывает индукцию апоптоза, чем белок, содержащий остаток Pro (Dumont et al., 2003; Bourdon, 2005); полиморфный локус в 6-м интроне {rsl625895) и инсерция/делеция 16 п.н. в 3-м интроне изменяют «дозу» гена, таким образом, влияя на активность белка р53 (Whibley et al., 2009).
В лаборатории молекулярно-генетических исследований кафедры генетики БГПУ им. М, Акмуллы были изучены эти три полиморфных варианта гена ТР53 и было показано, что у онкобольных достоверно чаще, чем у здоровых, встречаются «рисковые» аллели гена ТР53, что согласуется с литературными данными (Kinzler, 1996; Weinberg, 1996; Денисов, 2008, 2009; Галикеева и соавт., 2009).
В работе R.E. Ellis с соавторами (2002) показано, что при некоторых солидных новообразованиях интерлейкины (IL) способны влиять на рост опухолевых клеток, изменяя экспрессию белков про- и антиапоптотического действия, различных онкогенов и маркеров пролиферативной активности клеток. В свою очередь, гены семейства IL-1 играют важную роль в регуляции механизмов опухолевого роста и противоопухолевого иммунитета, так, IL-ip — это полифункциональный цитокин, участвующий в процессах злокачественной трансформации, роста опухоли, инвазии и метастазировании (Чердынцева, 2007; Жовмер, 2008; Генинг, 2009).
Из группы онкобольных были выделены индивиды, которые являются носителями «рисковых» аллелей по полиморфным локусам ( Рго (rs1042522), w (rs 1625895), 196 (Ins 16bp) по гену ТР53 (п=164, табл.15). В группу сравнения вошли здоровые индивиды без онкологического анамнеза, являющиеся носителями нормальных аллелей по гену ТР53 (п=180). Группа контроля формировалась, таким образом, не случайно, так как доказано, что «рисковые» аллели гена ТР53 обнаруживаются с частотой от 53 до 86% при различных онкопатологиях (Olivier, Hainaut, 2001; Dimitrakakis et al., 2002; Feki, Irminger-Finger, 2004; Olivier, 2004; Petitjean et al., 2007; Brosh, Rotter, 2009; Денисов, 2009).
Анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов в генах семейства интерлейкин-1 с геном биотрансформации ксенобиотиков НА1Э(Р)Н-хиноноксидоредуктаза-1 у онкобольных
Сочетание генотипов E1E1//II/II//TC генов семейства интерлейкин-1 (IL-lp (rsll43634), ILIRa (VNTR), IL1RI (rs2287047)) среди онкобольных встречалось достоверно чаще (с частотой 9,21%, х2 -3,76, р=0,05), при том что у здоровых индивидов, являющихся носителями «нормальных» аллелей полиморфных вариантов в гене ТР53, данное сочетание не встречалось.
Известно, что при носительстве аллеля IL1RA II наблюдается повышенный уровень циркулирующего рецепторного антагониста IL-1 (Громова, 2005). IL1RA является эндогенным ингибитором интерлейкина-1 и препятствует его взаимодействию с соответствующими клеточными рецепторами, расположенными на поверхности иммунокомпетентных клеток. Накоплению интерлейкина-1 способствует и нарушение сигнальной трансдукции, запускаемая аллелем II renalLlRA. Даный феномен возможен из-за нарушения обратной связи в цитокиновой сети, связанный с недостатком IL-ip в функционирующих клетках, хотя в сыворотке крови и межклеточном пространстве циркулирует большое его количество. Несвязавшийся с рецептором IL-ip, концентрация которого повышена за счет наличия высокопродуцирующего аллеля Е2 {rs 1143634), может накапливаться в межклеточном пространстве в активной форме (Громова, 2005). Большое количество IL-ip способно блокировать апоптоз, который не позволил бы изменненой клетке вступать в S-фазу клеточного цикла (Deuel., 1987; Stoker, Gherardi, 1991).
С другой стороны, увеличение в межклеточном пространстве несвязавшегося интерлейкина увеличивает пролиферацию клеток и может стимулировать у онкологических больных развитие метастазов (Хабаров, 2004; Бережная, 2009).
К локальным проявлениям действия IL-1 относят его про-воспалительный эффект и способность к формированию определенного микроокружения опухоли, играющего существенную роль в развитии ее химиорезистентности и метастазировании, а также образование de novo сосудов в зоне опухолевого роста, расширение и нарушение проницаемости этих сосудов, стимуляция пролиферации и блокирование апоптоза опухолевых клеток (Norman, 1996; Fidler, 1997, 2008).
Известно, что носительство аллеля Pro (rsl042522) гена ТР53 ассоциировано с более тяжелым течением заболевания и опухолевой прогрессией (Thomas et al., 1999; Dumont et al., 2003; Денисов, 2009). Исходя из этого, мы проанализировали характер распределения частот генотипов трех изученных генов семейства интерлейкин-1 в группе больных РМЖ, являющихся носителями генотипа Pro/Pro гена ТР53 (rs 1042522, p.Arg72Pro). Было обнаружено 7 сочетаний из 27 возможных (рис. 26).
На долю сочетания генотипов с 3-мя «непротективными» аллелями E1E2//I/II//TC приходилось 25%, сочетания генотипов E1E1//I/II//TC, E1E1//II/II//TC и E1E2//I/I//TC встречались с частотой 16% каждый, и с частотой по 9% сочетания - E1E1//I/II//CC, 1. Анализ ассоциаций гаплотипов При анализе гаплотипов мы рассматривали онкологических больных, являющихся носителями хотя бы одного «непротективного» аллеля из 6 возможных аллелей по изученным полиморфным вариантам (rs 1042522, rs!625895, rs 17878362) гена ТР53 (п=164). В группу сравнения вошли здоровые индивиды без онкологического анамнеза являющиеся носителями «протективных» аллелей полиморфных вариантов гена ТР53 (п=180, табл. 18). Анализ распределения частот гаплотипов по аллелям генов IL-10, ILIRA, IL1RI в группе практически здоровых индивидов и онкобольных выявил достоверное повышение (р=0,004, х 8,71) частоты гаплотипа,
несущего «благоприятные» сочетания аллелей Е1/ 1/ Т у практически здоровых индивидов. Носительство «протективных» вариантов этих генов определяет адекватную продукцию соответствующих белков, и как следствие 112 - регуляцию физиологически, корректного функционирования цитокиновой системы. Таблица 18 Сравнительный анализ распределение частот гаплотипов на основе анализа локусов IL-ip (rs 1143634), ILIRa (VNTR), ILlRI{rs2287047) в группах онкобольных и здоровых индивидов, в %. Гаплотипы Частота % х2 Р Онкобольные(с «рисковыми»аллелями в гене р53)п=164 Здоровые(с «нормальными»аллелями в гене р53)п=180 Е1/ 1/ Т 10,58 25,69 8,71 0,004
Гаплотип Е2/ І/ Т, в состав которых входит один аллель с измененной функцией ( Е2 гена IL-1/3 ассоциирован с высокой выработкой интерлейкина-1, Громова, 2005), в группе онкобольных встречается достоверно чаще, чем у здоровых индивидов (р=0,02, у=4,1Ъ). У онкобольных гаплотип, несущий три «непротективных» аллеля Е2/ П/ С встречается достоверно чаще (р=0,0034, %2=9,14), чем у здоровых индивидов. В наших исследованиях выявлено, что у лиц с данным сочетанием аллелей отмечаются наиболее высокие показатели продукции интерлейкина-1 р и содержания в сыворотке крови рецепторного антагониста интерлейкина-1.
