Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Общая характеристика и эпидемиология хобл 10
1.2 Иммунно-биохимические маркеры хобл 18
1.3 Патогенез и генетические факторы формирования хобл 20
1.3.1 Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков 22
1.3.2 Гены цитокиновой сети 32
1.3.3 Гены ферментов протеолиза-антипротеолиза 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы 46
2.1 Объект исследования 46
2.2 Выделение днк 48
2.3 Проведение полимеразной цепной реакции и пдрф-анализа 49
2.4 Проведение электрофореза и визуализация результатов 56
2.5 Статистические методы обработки результатов исследования 57
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 59
3.1 Анализ ассоциаций полиморфных днк-локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к хобл 59
3.1.1 Полиморфизм генов цитохромов Р450 1А1 и 2Е1 у больных ХОБЛ 60
3.1.2 Пол иморфизм гена микросомалъной эпоксидгидролазы у больных ХОБЛ. 65
3.1.3 Полиморфизм генов глутатион-Б-трансфераз у больных ХОБЛ 72
3.1.4 Полиморфизм гена ариламин-Ы-ацетилтрансферазы 2 у больных ХОБЛ 77
3.1.5 Анализ ассоциаций сочетаний генотипов генов ФБКс предрасположенностью к ХОБЛ 86
3.2 Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов цитокинов с предрасположенностью к хобл 98
3.2.1 Полиморфизм генов фактора некроза опухоли а и яимфотоксина а у больных ХОБЛ 99
3.2.2 Полиморфизм генов семейства интерлейкина 1 у больных ХОБЛ 707
3.2.3 Полиморфизм гена интерлейкина б у больных хобл 113
3.2.4 Полиморфизм гена интерлейкина 10 у больных хобл 116
3.3 Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов ферментов протеолиза антипротеолиза с предрасположенностью к хобл 119
3.3.1 Полиморфизм гена аі-антитрипсина у больных ХОБЛ 120
3.3.2 Полиморфизм гена щ-антихимотрипсина у больных ХОБЛ 125
3.3.3 Полиморфизм гена интерстициальной коллагеназы у больных ХОБЛ 127
Заключение 131
Выводы 138
Практические рекомендации 140
Список литературы 141
Приложение 171
- Патогенез и генетические факторы формирования хобл
- Проведение полимеразной цепной реакции и пдрф-анализа
- Полиморфизм гена ариламин-Ы-ацетилтрансферазы 2 у больных ХОБЛ
- Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов ферментов протеолиза антипротеолиза с предрасположенностью к хобл
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) - заболевание дыхательной системы, характеризующееся ограничением скорости воздушного потока, которое необратимо или не полностью обратимо. (Pauwels R. et al., 2001). Основными клиническими признаками заболевания являются симптомы хронического кашля, отделение мокроты, экспираторная одышка. Заболевание сопровождается прогрессирующим нарушением вентиляции и газообмена легких по обструктивному типу с формированием эмфиземы, легочной гипертензии и хронического легочного сердца (Чучалин А., 1999, GOLD Workshop Report, 2003). Эпидемиологические исследования показывают, что 4-10% взрослого населения страдают от ХОБЛ (European Lung White Book, 2003, World Health Report, 2000). В России количество людей с признаками заболевания составляет около 11 миллионов человек (Хронические обструктивные болезни легких. Федеральная программа, 1999).
ХОБЛ является классическим примером многофакторного заболевания, в развитии которого важную роль играют как внешнесредовые (курение, экспозиция профессиональных и бытовых поллютантов), так и генетические факторы. Традиционно главным фактором риска формирования ХОБЛ считается курение. Однако, ХОБЛ развивается только у 15-20% курильщиков (Fletcher С, Peto R., 1977, Beck G., Doyle С, Schachter E., 1981, Sandford A., Silverman E., 2002). Многочисленные генетико-эпидемиологические исследования установили важную роль наследственности в детерминации показателей функции внешнего дыхания и накоплении случаев ХОБЛ в семьях (Tager I. et al., 1978). У монозиготных близнецов конкордантность функции внешнего дыхания составляет 72%. Кроме того, обнаружено преобладание случаев ХОБЛ в группе родственников пробандов, страдающих ХОБЛ, по сравнению с группой
родственников контрольных лиц и снижение степени корреляции показателей функциональных исследований легких с увеличением генетической дистанции (Higgins М., Keller J., 1975, Speizer F,, Rosner В., Tager I., 1976, Kueppers F. et al., 1977, Redline S. et al., 1989, Silverman E. et al., 1996).
Для выяснения роли конкретных генов, задействованных в развитии ХОБЛ, в современной генетике многофакторных заболеваний широко используется метод, основанный на исследовании ассоциации полиморфных вариантов генов, продукты которых потенциально задействованы в развитии и регуляции тех или иных звеньев патогенеза заболевания (Silverman Е., Palmer L., 2000, Lomas D., Silverman E., 2001, Hall I., 2002). ХОБЛ характеризуется хроническим персистирующим воспалением всех отделов дыхательных путей, паренхимы и сосудов легких. Под влиянием различных факторов риска (курение, атмосферные и бытовые поллютанты) активируются и участвуют в воспалительной реакции практически все клеточные элементы респираторной системы (нейтрофилы, макрофаги, фибробласты, Т-лимфоциты и др.). Активированные клетки выделяют большие количества активных форм кислорода (АФК), что приводит к сдигу равновесия в системе оксиданты-антиоксиданты; АФК инактивируют ингибиторы протеаз, что, влечет за собой нарушение баланса между процессами протеолиза и антипртеолиза в легких. Повышенная активность протеазного пула (эластазы нейтрофилов, металлопротеиназ) способствует деградации белков экстрацеллюлярноЙ мембраны, что вызывает разрушение легочной ткани и формирование эмфиземы (Чучалин А., 1999, Chung К., 2001, GOLD Workshop Report, 2003). Нейтрофилы наряду с выделением ряда провоспалительных медиаторов (фактор некроза опухоли, интерлейкин-8, лейкотриен В4 и др.), секретируют целый спектр протеолитических ферментов (эластаза, катепсины, металлопротеиназы). В комплексе все эти процессы приводят к нарушению мукоцилиарного клиренса, бактериальной колонизации дыхательных путей, хронической гиперсекреции слизи,
7 отделению мокроты, хроническому воспалению и развитию эмфиземы легких.
Персистенция воспаления и снижение ФВД в результате обструкции дыхательных путей является гипертрофией нормального протективного воспалительного ответа на воздействие патогенных частиц, которая может быть следствием генетических дефектов ферментов детоксикации, эндогенных противовоспалительных и антипротеазных механизмов (Barnes Р., 2000, GOLD Workshop Report, 2003). Поэтому, для анализа генетических ассоциаций, исходя из звеньев патогенеза, нами были выбраны гены, белковые продукты которых относятся к системам ферментов биотрансформации ксенобиотиков, антипротеолиза-протеолиза и цитокиновой сети.
Ранее показано, что генетические факторы риска ХОБЛ представляют собой совокупность нескольких генов, каждый из которых вносит незначительный вклад в развитие симптомов заболевания (Devor Е., Crawford М., 1984, Silverman Е. et al., 1996, Joos L., Pare P., Sanford A., 2002).
Поскольку в патологическом повреждении легочной ткани, развитии
хронического воспаления и обструкции дыхательных путей участвуют
разнообразные медиаторы и ферменты, программа молекулярно-
генетических исследований природы ХОБЛ является наиболее полной и всесторонней, когда в анализ включается множество генов, эффект которых во многом определяется- внешнесредовыми факторами, в том числе курением.
Цель исследования:
Оценка роли полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, протеолиза-антипротеолиза и цитокиновой сети в формирование наследственной предрасположенности к ХОБЛ.
8 Задачи:
Изучить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных локусов системы ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2E1, ЕРЯХ, GSTM1, GSTT1, GSTP1, NAT2) у больных ХОБЛ и у практически здоровых индивидов.
Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных локусов цитокиновой сети (TNF, LTA, IL1, 1L1RN, 1L6, 1L10) у больных ХОБЛ и у практически здоровых индивидов.
Провести анализ полиморфизма генов ферментов протеолиза-антипротеолиза (PI, АЛСТ, ММР1) у больных ХОБЛ и у практически здоровых индивидов.
Исследовать ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов и их сочетаний с предрасположенностью к ХОБЛ, клиническими стадиями заболевания, а также со статусом курения больного.
Охарактеризовать патогенетическую значимость полиморфных вариантов генов-кандидатов в развитии ХОБЛ.
Научная новизна
Впервые у больных ХОБЛ изучена взаимосвязь сочетаний генотипов
полиморфных локусов генов, кодирующих ферменты биотрансформации
ксенобиотиков, протеолиза-антипротеолиза и цитокинов, с
предрасположенностью к ХОБЛ, тяжестью клинического течения и со статусом курения. Впервые оценена роль полиморфизмов G590A, С481Т и G857A гена NAT2, С3539Т гена /LIB, G-174C гена 116 и С-627А гена IL10 в развитии предрасположенности к ХОБЛ.
Практическая значимость
На основании полученных результатов показана целесообразность определения полиморфных вариантов генов ЕРНХ1 и NAT2, TNF, LTA, 1L1RN и ММР1 с целью профилактики развития ХОБЛ в группах риска (злостные
9 курильщики, рабочие вредных производств и др.) и прогнозирования вариантов клинического течения ХОБЛ на ранних стадиях заболевания.
Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов, а также на курсах последипломного образования врачей.
Положения, выносимые на защиту:
Выборка больнь^ ХОБЛ статистически достоверно отличается по распределению частот генотипов генов ЕРНХ1 и NAT2, LTA и IL1RN и ММР1 от контрольной группы практически здоровых индивидов.
Полиморфные варианты генов ЕРИХ1, ILIRN, LTA, ММР1, а также сочетания генотипов по генам NAT2, CYP1A1/EPHX1/GSTP1 и EPHX1/NAT2 являются генетическими маркерами предрасположенности к ХОБЛ.
Аллельные варианты генов ЕРНХ1, LTA и комбинации генотипов по генам EPHX/NAT2 и TNF/LTA вносят вклад в развитие тяжелой и крайне тяжелой стадий ХОБЛ.
Только у курящих больных ХОБЛ выявлена комбинация генотипов глутатион-8-трансфераз, характеризующаяся отсутствием фермента GSTM1, нормальной активностью GSTT1 и пониженной активностью GSTP1 (делеция гена GSTMI, нормальный генотип GSTT1, гетерозиготный генотип GSTP1).
Установлено, что полиморфные варианты генов CYPJAI, ЕРНХ1, GSTM1, GSTP1, NAT2, ILIRN, TNF, LTA, ММР1 являются важной составной частью генетической структуры подверженности к ХОБЛ.
Патогенез и генетические факторы формирования хобл
ХОБЛ характеризуется хроническим персистирующим воспалением всех отделов дыхательных путей, легочной паренхимы, а также сосудов легких (Чучалин А., 1999, GOLD Workshop report, 2003). Пусковым механизмом развития воспаления служит воздействие факторов внешней среды (курение, экспозиция вредных бытовых и производственных поллютантов). Все клеточные элементы респираторной системы под влиянием названных факторов активируются и участвуют в воспалительной реакции. Воспалительные клетки (макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты и др.) выделяют большое количество активированных форм кислорода (АФК) и реактантов, способных повреждать структуру легких и поддерживать нейтрофильное воспаление (Stockley R., 2002). Нейтрофилы, проникая в межклеточное пространство, наряду с выделением ряда провоспалительных медиаторов (фактор некроза опухоли а, интерлейкин-8 , лейкотриен В4), секретируют протеолитические ферменты (эластаза, катепсины, металолротеиназы), вызывая паренхиматозную деструкцию легочной ткани и хроническую гиперсекрецию слизи. АФК, продуцируемые активированными клетками, способны разрушать белки, липиды и нуклеиновые кислоты, что приводит к апоптозу клеток и сдвигу равновесия в системе оксиданты-антиоксиданы, вызывая оксидативный стресс (Barnes P., Shapiro S., Pauwels R., 2003).
Угнетение антиоксидантной системы приводит к истощению запасов глутатиона в легких и повышению уровня перекисного окисления липидов, а также к транскрипции провоспалительных цитокинов. Кроме того, свободные радикалы и АФК инактивируют ингибиторы протеаз, что, в свою очередь, усугубляет локальный дефицит антипротеаз. Это влечет за собой нарушение баланса между процессами протеолиза и антипротеолиза. Повышенная активность пула протеаз (эластазы нейтрофилов, металлопротеиназ) способствует разрушению эластина, коллагена и других белков экстрацеллюлярной мембраны, что вызывает разрушение легочной ткани и слияние альвеолярных пространств в более крупные эмфизематозные полости (Mahadeva R., Lomas D., 1998, Halpin D., 2001).
Воспаление присутствует в легких курильщиков без диагноза ХОБЛ, однако, в меньшей степени, чем при ХОБЛ (Keatings V. et al., 1996). Это наблюдение наводит на предположение, что персистенция воспаления и снижение ФВД в результате обструкции является гипертрофией нормального протективного воспалительного ответа на воздействие патогенных частиц, которая может быть следствием либо повышенной продукции воспалительных медиаторов и протеаз либо дефектами эндогенных противовоспалительных и антипротеазных механизмов. Эти различия в воспалительном ответе могут быть объяснены наличием аллельных вариантов генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), протеолиза-антипротеолиза и цитокиновой сети (Barnes Р., 2000, GOLD Workshop Report, 2003).
Важную роль в защите легких от токсичных продуктов, содержащихся в табачном дыме, атмосфере крупных промышленных городов и воздухе вредных производств, играют ферменты системы биотрансформации ксенобиотиков и антиоксидантной защиты. Способность обезвреживать чужеродные вещества в нетоксичные метаболиты может считаться первой линией защиты организма в процессах их элиминации. Биотрансформация ксенобиотиков состоит в модификации их физических свойств от липофильных к гидофильным, что облегчает их выведение из организма (Раис Р., Гуляева Л., 2003). Если бы процесса битрансформации не существовало, то липофкльные чужеродные вещества накапливались бы, почти не выделяясь из организма, что привело бы к его нежизнеспособности. Дисбаланс между способностью организма детоксицировать ксенобиотики и их поступлением в организм также может привести к нежелательным последствиям, таким как нарушение гомеостаза и накопление токсических веществ (Баранов В. и соавт., 2000, Hatagima А., 2002).
В классическом варианте система метаболизма ксенобиотиков включает три последовательных этапа: активация (фаза I), детоксикация (фаза II) и выведение (фаза III) (Hatagima А., 2002). Обычно первые две фазы при совместном действии приводят к превращению многих тысяч ксенобиотиков в гидрофильные и менее токсичные метаболиты (Раис Р., Гуляева Л., 2003) (рис. 1.2). Основные фазы обезвреживания ксенобиотиков индуцибельны. Они функционируют как единый четко скоординированный комплекс, любые качественные или количественные отклонения в работе которого сопровождаются нарушением процессов обезвреживания с непредсказуемыми, а иногда и вредными последствиями для организма (Баранов B.C. и соавт., 2000). Наличие у индивидуума того или иного полиморфного варианта может определять как значительные индивидуальные различия в метаболизме экзогенных соединений, так и рассматриваться в качестве фактора предрасположенности к некоторым заболеваниям (Баранов B.C. и соавт., 2000). Полиморфизм генов биотрансформации также может оказывать влияние не только на предрасположенность к ХОБЛ и детерминировать ее клинические стадии, но и объяснить индивидуальный ответ на лечение у больных ХОБЛ, поскольку лекарства метаболизируются теми же ферментами, что и любые другие ксенобиотики (Яковлева О. и соавт., 2000, Hall I., 2002).
Проведение полимеразной цепной реакции и пдрф-анализа
Анализ полиморфных локусов генов CYP1A1, CYP2E1, ЕРНХ1, GSTM1, GSTT1, GSTP1, NAT2, PI, ААСТ, ММР1, TNF, LTA, III, URN, 116, 1110 проводили методом полимеразнои цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на термоциклере «Терцик» в автоматическом режиме. Перечень исследованных локусов, последовательности локусспецифических олигонуклеотидных праймеров, способы детекции мутаций и полиморфизмов, а также номенклатура аллелей представлены в табл. 2.2. Общая схема ПЦР была следующей. Реакционная смесь содержала 2.5 мкл 10 х ПЦР-буфера (60 мМ Tris-HCl, рН 8.5, 1.5 mM MgCI2, 25 тМ КС1, 10 тМ 2-меркаптоэтанол, 0.1% тритон Х-100), 1.0 мкл смеси 5 мМ dNTP («Сибэнзим»), примерно 200 нг геномной ДНК, 1 ед Taq-полимеразы («Сибэнзим»), необходимое количество деионизированной воды до объема 25 мкл, а также по 1.0 мкл соответствующих праймеров, разбавленных до концентрации 1 ОЕ/мл либо определенное количество концентрированных праймеров, рассчитанное по формуле на 25 мкл ПЦР-смеси: с_ 0.114 1. Сисх где L - длина олигонуклотида, Сисх - исходная концентрация синтезированного олигонеуклеотида, в ОЕ/мл. В случае необходимости для некоторых локусов с целью оптимизации в состав реакционной смеси вводились вспомогательные реагенты. Так, для локусов генов CYP1AV, GSTP1, GSTM1, PI, ММР1 дополнительно использовался 25 mM MgCI2 («Promega»), а для локусов генов NAT2, GSTT1, ЕРНХ1- бычий сывороточный альбумин (10Х) («Promega»). Режим амплификации был следующим: предварительная денатурация (94С, 5-7 мин), 30-32 цикла амплификации: денатурация - 94С, 40 сек; отжиг - 55С , 40 сек; синтез - 72С, 1 мин, завершающий синтез (72С, 7-10 мин). Как известно, самым вариабельным параметром режима амплификации является температура отжига праймеров, зависящая от их качественного и количественного нуклеотидного состава. В табл. 2.2 приведены конкретные показатели этого параметра для каждого из исследованных локусов, рассчитанные по формуле:
Тотжига, с =[(А+Т) х 2C]+[(G+C) х 4С], где А, С, А, Т- нуклеотиды, входящие в состав олигопраймера. Для изучения полиморфизма генов GSTMJ (целеция), GSTTJ(делеция), ILRN (VNTR), применяли метод ПЦР. Анализ генов GSTM1 и GSTT1 был выполнен в стандартных условиях по ранее описанной методике (el-Zein R et al., 1997). При отсутствии делеции формировались фрагменты размером 271 пн и 480 пн соответственно, при наличии делеции фрагмент отсутствовал. В качестве внутреннего контроля дополнительно амплифицировали фрагмент экзона гена CYP1A1. Амплификация VNTR-полиморфизма гена IL1RN проводилась в страндартных условиях. Интрон 2 гена IL1RN содержит вариабельное число тандемных повторов длиной 86 пн. Размеры аллелей определяли путем одновременного электрофореза с маркером молекулярного веса ДНК «100 bp DNA ladder» фирмы "Сибэнзим". Полиморфизм локусов генов CYP1A1, CYP2E1, ЕРНХ, GSTP1, NAT2 PI, ААСТ, TNF, LTA, IL1, IL6, IL10 иследовался методом ПДРФ-анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов).
После амплификации ПЦР-продукты всех локусов подвергались гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции (табл. 2.2). Для этого 5 мкл амплификата смешивали с 5 ед фермента в соответствующем буфере, смесь выдерживали при определенной температуре, согласно рекомендациям производителей («Сибэнзим», «Fermentas», «Promega») в течение ночи.
Далее описаны особенности молекулярно-генетического анализа локусов, условия амплификации и последующего анализа которых отличались от вышеприведенных.
Анализ миссенс-мутаций Tyrll3His и Hisl39Arg гена ЕРНХ1 проводился по Smith С, Harrison D. (1997). Амплификация и ПДРФ-анализ каждого полиморфного локуса проводилась независимо в стандартных условиях. По результатам исследования двух мутаций определяли предполагаемый фенотип (табл. 2.3).
Амплификация фрагмента гена NAT2 была выполнена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 2.5 мкл 10х ПЦР-буфера, 2.5 мкл BSA (10мг/мл), 400 мМ каждого dNTP, 1.5 ед Taq-полимеразы и соответствующие праймеры по 15 нМ каждого. После денатурации (94С, 7 мин) проводили 32 циклов амплификации в режиме: 94 С — 1 мин, 59С — 40 сек , 72 С - 1 мин с заключительным синтезом в течение 7 мин при 72С.
Полиморфизм гена ариламин-Ы-ацетилтрансферазы 2 у больных ХОБЛ
Ариламин-Ы-ацетилтрансфераза 2 - главный фермент биотрансформации соединений, содержащих гидразогруппу (ариламины, гидразины, гетероцикличесеие амины и некоторые другие канцерогены). В кодирующей области гена NAT2 обнаружено множество точковых мутаций, в результате которых значительно снижается стабильность и активность фермента, а также изменяется субстратная специфичность (Райе Р., Гуляева Л., 2003, Cascorbi I. et al, 1995). Мы исследовали три наиболее важных полиморфизма, в сумме влияющих на фенотип ацетилирования (Cascorbi I. et al., 1995) (табл. 3.7. приложение, табл. 1). Это транзиции С481Т, G590A G857A, которые соответствуют следующей номенклатуре аллелей - NAT2 5, NAT2 6 и NAT2 7. Отсутствие замен в гене NAT2 соответствует генотипу дикого типа NAT2 4 4 (Vatsis К. et al., 1995). Каждый полиморфизм был проанализирован отдельно, при их сочетании были получены комбинации генотипов гена NAT2 и фенотипы ацетилирования.
«Медленный» аллель NAT2 6 впервые описан Vatsis К., Martell К., Weber W. (1991). Полиморфизм G590A приводит к замене аминокислоты аргинин на глутамин в 197 положении NAT2 (Argl97Glu). Мутирующий гуанин является частью GpG-островка (так называемая «горячая точка мутирования», «hot spot») Показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса G590A достоверно не отличалось между общей выборкой больных ХОБЛ и контролем (% =0.5321, р=0.4663 и % =0.5321, р=0.4663, соответственно).
Для выявления ассоциации полиморфизма G590A гена NAT2 с тяжестью течения ХОБЛ было проведено изучение частот генотипов с учетом клинических стадий ХОБЛ. Отмечена тенденция увеличения доли генотипа 4 4 у больных с IV стадией ХОБЛ до 59,8% по сравнению со стадиями II и Ш, где его частота составила 50.0% и 43.1% соответственно. Одновременно наблюдалось снижение частоты гомозиготного генотипа 6 6 от 12.0% у больных стадией II до 5.7% у больных стадией IV. Тем не менее, уровня статистической значимости различия не достигали {% =4.9264, р=0.2870) (рис. 3.8, приложение, табл. 2).
NAT2 5 - это «медленный» аллель, характеризующийся нейтральной заменой С481Т гена NAT2, которая не влияет на структуру белка (Vatsis К., Martell К., Weber W., 1991). При изучении распределения частот генотипов полиморфизма С481Т гена NAT2 у больных ХОБЛ и в контрольной группе установлено, что в группе больных частота аллеля дикого типа NAT2 4 превышает таковую в кон грольной группе (61.6% против 54.8%, х2=3.1892, р=0.0741). Генотип 4 5 преобладал как в группе больных, так и в контрольной группе (50.7% и 47.7%, соответственно).
Также показано, что в группе больных ХОБЛ существенно реже встречался гомозиготный генотип 5 5, что связано с равномерным увеличением доли гомозигот 4 4 и гетерозигот 4 5 (13.1% против 21.2% в контроле, X =3.9437, р=0.0471). Предположительно, генотип 5 5 является маркером устойчивости к развитию ХОБЛ (OR=0.56, 95% СІ 0.31-0.99). При изучении распределения частот генотипов полиморфизма С481Т гена NAT2 в зависимости от стадии ХОБЛ существенных различий не выявлено (%2=2.5194, р=0.6450) (рис. 3.9, приложение, табл. 2). Транзиция G857A приводит к замене глицина на глутаминовую кислоту в позиции 286 белка NAT2 (Gly286Glu) (Lin Н. et al., 1993). Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса G857A гена NAT2 достоверных различий между группами больных ХОБЛ и контролем не обнаружил (х2=0.2057, р=0.6505 и %2=4.9360, р=0.0660, соответственно). В обеих группах наиболее высокая частота выявлена для генотипа 4 4 (85.2% и 81.0%, соответственно). Однако, среди больных ХОБЛ отмечена тенденция к увеличению частоты генотипа 7 7 (1.7%), он идентифицирован у 4 больных и не встречался в контрольной группе (Х2=2.6389,р=0.1044).
Среди больных ХОБЛ III стадией показано увеличение частоты генотипа 7 7 до 5.9% по сравнению с другими группами больных ХОБЛ (Х =1.1541, р=0.2837). Различия не достигали статистической значимости, что, вероятно, обусловлено редкой встречаемостью этого генотипа, и случайным распределением трех из четырех гомозигот 7 7 в группу больных с наименее репрезентативной выборкой (п=54 для стадии IU) (рис. 3.10, приложение, табл. 2). Сравнительный анализ распределения генотипов трех полиморфных локусов гена NAT2 у курящих и некурящих больных также не выявил достоверных различий между группами ни для одного из полиморфизмов {% =1.3364, р=0.5450) (приложение, табл.3).
Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов ферментов протеолиза антипротеолиза с предрасположенностью к хобл
Во второй половине XX века широкое распространение получила концепция нарушения баланса в системе протеолиз-антипротеолиз как одна из причин развития эмфиземы легких (ЭЛ) с ранней манифестацией (в 20-30 лет). В 1963 году Laurell и Eriksson показали, что у людей с экстремально низким уровнем а г антитрипсина в плазме, ЭЛ развивается чаще, чем у других (Laurell С, Eriksson S., 1963). Дальнейшее изучение взаимодействия ферментов с протеолитическими и антипротеолитическими функциями значительно расширило знания о генетически детеминированнои предрасположенности к ХОБЛ (Mahadeva R., Lomas D., 1998, DeMeo D., Silverman E., 2004). Показано, что нарушение равновесия, обусловленное врожденным дефицитом антипротеаз (ингибиторов протеаз) может, при определенных условиях, привести к избыточному действию протеолитических ферментов, которые способны разрушать тончайшие межальвеолярные перегородки (Hogg J., Senior R., 2002). Следствием этого патологического процесса является слияние отдельных альвеол в более крупные эмфизематозные полости с постепенным уменьшением общей дыхательной поверхности легких. Вместе с тем, гиперпродукция протеолитических ферментов может повлечь еще более интенсивное разрушение коллагенов, эластина и других компонентов внеклеточного матрикса, усугубляя деструкцию легочной ткани (Parks W., Shapiro S., 2001, Shapiro S.( 2003).
С целью выявления аллелей и генотипов, ассоциированных с предрасположенностью к формированию ХОБЛ, развитию тяжелой и крайне тяжелой стадий заболевания (для которых характерны значительные эмфизематозные изменения легочной ткани) и совместного влияния курения и генетических особенностей проанализирован ряд мутаций и полиморфизмов генов, кодирующих антипротеолитические (PI и A ACT) и протеолитические (ММР1) ферменты в общей выборке больных ХОБЛ, у больных разных стадий, с различным статусом курения, а также в контрольной группе. Распределение частот аллелей и генотипов ферментов протеолиза-антипротеолиза в различных группах больных ХОБЛ и контроле представлено в приложении, табл. 7-9. антитрипсин (а і-A AT) синтезируется главным образом клетками печени, но также частичгэ и альвеолярными макрофагами. Этот фермент является основным ингибитором нейтрофильной эластазы, трипсина, химотрипсина и коллагеназы (WHO Report. Alpha-1-antitrypsin deficiency, 1996). В гене PI, кодирующем arантитрипсин, описано 2 распространенных дефицитных аллеля Z и S и аллель дикой формы М. В Z варианте о -ААТ в 342 положении молекулі? белка остаток глутаминовой кислоты замещен лизином (GIu342Lys) в результате точко вой мутации G/A в 5 экзоне гена. Другой дефицитный аллель S является следствием транзиции А/Т в 3 экзоне гена РІ, которая приводит к замене глутаминовой кислоты на валин в 264 положении белковой молекулы (Glu264Val). У индивидов, гомозиготных по вышеописанным мутациям, уровень сывороточного i\- ААТ снижен до 15% (ZZ) и до 60% (SS) от нормы (Brantly М. et al., 1991).
Распределение частот аллелей и генотипов мутаций Glu342Lys и Glu264Val у больных ХОБЛ и в контрольной группе показано в табл. В выборке больных ХОБЛ, как и в группе контроля преобладающим по частоте были генотип ММ и аллель М. Ни в одной из выборок не было обнаружено индивидов, гомозиготных по мутациям, приводящим к тяжелому дефициту oti-AAT. Это гомозиготы 342Lys/342Lys (ZZ), 264Val/264VaI (SS) либо компаунд-гетерозиготы 342Glu/342Lys-264Glu/264Val (SZ). Частота гетерозиготных носителей дефицитного аллеля Z (генотип 342GIu/342Lys или MZ по традиционной номенклатуре аллелей гена РГ) составила 0.8% среди больных ХОБЛ и 2.3% среди лиц контрольной группы. Аллель S в гетерозиготном состоянии встречался только у больных ХОБЛ с частотой 1.7% и не был обнаружен в контрольной группе. Однако, достоверных различий частот генотипов ни по одному из исследованных локусов гена PI по сравнению с контрольной группой не выявлено (х =1.7024, р=0.2830 для Z-мутации, % =3.6135, р=0.1400 для S-мутации). Тем не менее, в группе больных ХОБЛ отмечено достоверноое увеличение частоты аллеля S по сравнению с контрольной группой (0.8% против 0.0%, % =4.1956, р=0.0407). Это является, прежде всего, следствием отсутствия данного аллеля в контрольной группе.
