Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Краткая характеристика оз. Байкал 9
1.2. История изучения таксономии байкальских губок і о
1.3. История изучения происхождения пресноводной спонгиофауны 14
1.4. Современная систематика и характеристика губок Байкала 20
1.5. Молекулярно-генетические исследования губок 23
1.6. Функции и особенности эволюции исследованных генов Зз
2. Материалы и методы 36
3. Результаты и обсуждение 44
3.1. Анализ нуклеотпдных последовательностей фрагментов гена 18S рРНК 49
3.2. Анализ нуклеотпдных последовательностей ITS1 и ITS2 районов рибосомной РНК 54
3.3. Разработка способа видовой идентификации губок с неопределенными морфологическими признаками 60
3.4. Анализ нуклеотпдных последовательностей фрагментов гена бета-тубулина
3.5. Анализ нуклеотпдных последовательностей фрагментов гена гена первой субъединицы митохондриальной цитохром соксидазы
3.6. Оценка времени дивергенции байкальских губок 9
Заключение 74
Выводы 77
Список литературы
- Краткая характеристика оз. Байкал
- История изучения происхождения пресноводной спонгиофауны
- Анализ нуклеотпдных последовательностей фрагментов гена 18S рРНК
- Разработка способа видовой идентификации губок с неопределенными морфологическими признаками
Введение к работе
Актуальность проблемы. Баґжал является древнейшим и самым глубоким пресноводным озером Земли. По видовому разнообразию и уровню эндемизма Байкал занимает первое место среди всех озер и является уникальной моделью для изучения процессов видообразования и эволюции (Тимошкин, 1995).
Байкальские губки (семейства Lubomirskiidae и Spongillidae)
являются одним из главных компонентов литоральных экосистем озера.
Семейство Lubomirskiidae является эндемиком озера Байкал.
Распределение, таксономия и филогенетические связи этого семейства с другими не ясны (Ефремова, 2001 а, б). Нерешенным является вопрос и о происхождении губок Байкала наряду с другими семействами пресноводных губок, обитающими в древних озерах (Танганьика и Охрид), Проблема полифилетического или монофилетического происхождения мировой пресноводной фауны губок неоднократно привлекала внимание исследователей (Marshall, 1885; Brien, 1970; Volkmer-Ribeiro, De Rosa-Barbosa, 1978) и остается актуальной и в настоящее время.
Губки обладают низким уровнем целостности организма и исключительной морфологической пластичностью (Колтун, 1988). Морфологическая пластичность губок отражается в широкой внутривидовой вариабельности и межвидовом сходстве. Поэтому применение методов морфологии для систематики и филогении губок в ряде случаев ограничено отсутствием четких морфологических критериев. Для уточнения классификации и филогении губок актуальным является применение методов молекулярной биологии. Так, анализ ряда генов у морских семейств губок позволил прояснить их филогенетические взаимоотношения (Kelly-Borges, Pomponi, 1994; Shombard et al., 1997;
Borchiellini e t a 1., 2004). Поэтому необходимо было провести подобные исследования и на пресноводных губках Байкала. Развитие методов, основанных на сравнении нуклеотидных последовательностей ДНК организмов, привело в последнее время к большому прогрессу в области систематики и эволюции. Использование в качестве анализируемых признаков последовательностей ДНК обладает важными преимуществами перед использованием морфологических признаков, На основе гипотезы молекулярных часов (Zuckerkandel, Pauling, 1962), анализ последовательностей ДНК позволяет не только установить филогенетические связи между видами, но и определить примерное время дивергенции видов от общего предка.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение эволюционных взаимоотношений и происхождения эндемичных байкальских и космополитпых пресноводных семейств губок на основе сравнения нескольких генов.
Задачи исследования:
Определить нуклеотидные последовательности фрагментов генов 18S рРНК, цитохром с оксидазы субъединицы I, бета-тубулина, а также ITS1 и ITS2 районов рибосомной РНК исследуемых видов губок.
Провести анализ полученных нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических схем, отражающих эволюционные взаимоотношения между видами.
Сопоставить полученные результаты с имеющимися схемами и классификациями, а также данными палеонтологических исследований.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые для анализа филогении пресноводных губок были применены молекулярные методы исследования. Проведена оценка филогенетических отношений между видами семейств Lubomirskiidae и Spongillidae, а также их эволюционных связей с морской спонгиофауной на основе анализа фрагментов
нескольких генов: 18S рРНК, цитохром с оксидазы субъединицы I, бета-тубулина и ITS района рибосомной РНК. Проведенный анализ нитронов генов является новым подходом в изучении молекулярной филогении эндемичных организмов Байкала. Анализ митохондриального гена был проведен впервые не только для пресноводных губок, но и для всей фауны Ро rife га.
В настоящей работе впервые показано, что семейства Lubomirskiidae и Spongillidae являются монофилетичнымн и имеют общее происхождение с третьим семейством пресноводных губок - Potamolepidae. Определены участки генов, которые являются генетическими маркерами видов и могут использоваться для целей геносистематики губок.
Практическая значимость работы. Губки, являющиеся биофильтраторами и играющие большую роль в процессах естественной очистки байкальской воды, являются важным объектом экологических исследований. Проведенные исследования филогении байкальских губок на основе анализа ряда генов важны для получения наиболее полной информации о видовом составе данной группы организмов, распределении по Байкалу, а также путях ее эволюции и ходе видообразования. Полученные данные помогут спланировать мероприятия по охране и рациональному использованию природных ресурсов Байкала. Учитывая, что губюі являются продуцентами биологически активных веществ, большое практическое значение имеет также разработка методов геносистематики губок.
Внедрение в практику. Полученные нуклеотидные последовательности генов депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank.
Основные положения, выносимые на защиту7:
Семейства пресноводных губок Lubomirskiidac и Spongillidae являются монофил етичними.
Пресноводные семейства губок Lubomirskiidac, Spongillidae и Potamolepidae имеют общее происхождение.
Приблизительная оценка времени дивергенции семейства Lubomirskiidae не превышает геологического возраста озера Байкал.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на V международном симпозиуме по губкам ("5 International Sponge Symposium", Сидней, 1998); на VI международной конференции по губкам ("VI International Sponge Conference", Генуя, 2002); на Конференции по древним озерам ("Conference on Ancient Lakes: their Biological and Cultural Diversities (ICAL)", Иркутск, 1997); на Международном симпозиуме по озеру Байкал ("Joint International Symposium on Lake Baikal", Иркутск, 1998); на III международном симпозиуме "Видообразование в древних озерах (Third International Symposium "Ancient Lakes: Speciation, Development in Time and Space, Natural History", Иркутск, 2002); на Международной конференции "Живые клетки диатомей" ("The living diatom cells", Иркутск, 2004).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 18 работ, из них четыре статьи в реферируемых журналах. Одна статья находится в печати.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы и 4 приложений. Работа изложена на 112 страницах, иллюстрирована 10 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 129 наименований, в том числе 96 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает благодарность своему руководителю д. б. н. С. И. Беликову и директору ЛИН СО РАН академику
РАН М. А. Грачеву за всестороннюю помощь и поддержку в работе. Автор глубоко признателен к. б. н, С. М, Ефремовой за неоценимое содействие в выполнении работы и важные замечания по тексту диссертации. Автор выражает особую благодарность И. Масуда, Е. В. Вейнберг и О. 10. Глызиной за творческое сотрудничество и помощь в сборе образцов. Автор искренне благодарен д. б. н. Д. Ю. Щербакову за помощь в математической обработке данных, к. б. н. Т. А. Щербаковой, к. б. н. С. В. Кирильчик, д. б. н. О. А. Тимошкину за ценные замечания и полезную критику. Автор искренне благодарит всех сотрудников лаборатории аналитической биоорганической химии Лимнологического института СО РАН за содействие в выполнении работы. Автор выражает благодарность команде НИС «Обручев» за помощь в проведении экспедиций по озеру Байкал.
Работа выполнена при финансовой поддержке фонда РФФИ (01-04-97229, 97-04-96172), INTAS (96-1787, INTAS-YSF 2002-0382), DFG (436 RUS/17/20/01) и японско-российского центра молодежных обменов (Obuchi fellowship).
Краткая характеристика оз. Байкал
Несмотря на то, что губки Байкала привлекали к себе внимание исследователей с середины 18 века, исследования спонгиофауны Байкала носили эпизодический характер.
Впервые описал в Байкале губок Паллас в 1771 г. (Pallas, 1771). Он назвал описанный им вид Spongia baicalcnsis Pallas.
В 1870 г. Миклухо-Маклай описал байкальскую губку как разновидность морской формы Veluspa polymorpha (Miklucho-Maclay, 1870).
Большой вклад в изучение систематики губок Байкала внес Дыбовский. В 1880 г. вышла первая монография по губкам Байкала, которую следует считать краеугольным камнем в истории их изучения (Dybowski, 1882). В этой работе Дыбовский выделил байкальских губок из рода Veluspa в самостоятельный род, названный им Litbomirskia и описал новые виды: Litbomirskia baicalcnsis Pallas, Baikahspongia bacilli/era Dybowski, Baikahspongia intermedia Dybowski, Swartschewskia papyracea Dybowski.
Позднее Эннандейл (Annandale, 1913) указал, что губки Байкала заслуживают выделения в отдельное семейство Lubomirskiidae. Этот вывод был сделан на основании существенных отличий в строении водоносной системы эндемичных байкальских губок от космополитных представителей семейства Spongillidae. У спонгиллид отводящие каналы сходятся под дермальной мембраной к оскулярному отверстию, образуя субдермальную полость, от которой отходит оскулярная трубка длинной до I см. Тогда как у байкальских губок субдермальные полости отсутствуют, а оскулярные трубки не развиты. Скелет Lubomirskiidae также отличается некоторыми особенностями: пучки спикул заключены в большее по сравнению со спонгиллидами количество спонгина, образуя спонпшовое волокно, что обуславливает прочность скелета. Скелетные пучки Lubomirskiidae имеют более упорядоченную структуру, чем скелет представителей космополитного семейства Spongillidae. Annandale также выделил в дополнение к роду Litbomirskia Dybowski новый род -Baikalospongia Annandale, поместив туда виды Baikalospongia baciUifera Dybowski и Baikalospongia intermedia Dybowski (Annandale, 1914). В 1895 г. вышла небольшая работа Сукачева (1895), в которой он описывает новый интересный вид - Lubomirskia fusifera Soukatschoff.
Сварчевский (1902, 1923) описал фауну спонгиллид, встречающихся в Байкале. Им были отмечены некоторые морфологические особенности байкальских спонгиллид, которые выражаются в редукции защитного слоя геммул, и сделан вывод о связи этого процесса с условиями обитания губок в Байкале. Он обратил внимание на такие особенности обитания губок в Байкале, как отсутствие колебаний уровня воды и относительно постоянный температурный режим. Мелкие водоемы, которые служат средой обычного обитания Spongillidae, в отличие от Байкала, нередко высыхают летом и промерзают зимой, что обуславливает необходимость формирования геммул с толстым защитным слоем. В условиях же Байкала эта необходимость отпадает. Кроме исследований по морфологии и систематике байкальских губок, Сварчевским описано строение ооцитов и развитие личинки у Baikalospongia bacilli/era (СварчевскиП, 1902, 1923).
В 1925-1927 гг. исследованием спонгиофауны Байкала занимался Макушок. Им были установлены два новых рода: Swartschewskia Makushok и Baicalolepis Makushok. Большое внимание в своих работах Макушок уделял проблеме происхождения байкальской спонгиофауны. Им впервые было высказано мнение о близком родстве эндемичного семейства Lubomirskiidae и космополитного семейства Spongillidae. Он разделил всех встречающихся в Байкале губок на пять групп по степени их отличия от космополитных спонпшлид. В первую группу вошли типичные спонгиллиды, встречающиеся в заливах и сорах Байкала. Во вторую Макушок объединил виды, названные им спонгиллидами открытого Байкала, которые отличались редукцией защитного слоя геммул. К третьей им были отнесены виды промежуточные между Spongillidae и Lubomirskiidae, отличающиеся полным отсутствием геммул. В четвертую группу обьединены байкальские виды семейства Lubomirskiidae за исключением Labomirskia baicalensis Pallas. В пятую вошел вид L. baicalensis Pallas по своим признакам наиболее далеко ушедший от типичных представителей Spongillidae (Макушок, 1925, 1927 а, б).
В 1936 г. вышел определитель пресноводных губок, составленный Резвым (Резвой, 1936). В этой работе автором были обобщены и систематизированы данные по систематике семейства Lubomirskiidae, рассмотрена филогения родов байкальских губок. Все описанные виды эндемичных байкальских губок были отнесены Резвым к 3 родам {Labomirskia, Baikalospongia и Swartschewskia), 7 видам и 2 подвидам. Долгое время эта работа была наиболее полным описанием систематики губок Байкала.
История изучения происхождения пресноводной спонгиофауны
История изучения происхождения эндемичного семейства Lubomirskiidae демонстрирует ряд сменявших друг друга противоположных мнений.
Одним из главных вопросов в изучении происхождения байкальской фауны является вопрос о том, имеет ли она пресноводные или же морские корни. Так, Берг (1900) придерживался мнения о исконно пресноводном происхождении фауны Байкала. Верещагин (1935, 1940) же считал, что большая часть фауны Байкала является морскими реликтами. По мнению
Мартинсона (1958, 1967), фауна Байкала, несомненно, имеет гетерогенное происхождение и состоит из палеолимнических, мезолимнических и неолимнических элементов. Палеолимнические формы были широко распространены по всей Азии и сейчас представляют собой сибирский элемент, представители которого обитают в заливах и сорах озера. Представители мезолимнической фауны обитали в верхнем мезозое в озерах Китая, Монголии и Юго-Восточной Азии, т.е. сформировались значительно позднее палеолимнической. К неолимническому элементу Мартинсон (1958, 1967) относил нерпу и омуля, считая их вселенцами с севера. Очевидно, что решение вопроса происхождения байкальской фауны невозможно без понимания геологической истории озера, основанного на данных по палеогеографии и палеонтологии.
Первые исследователи Байкала (Миклухо-Маклай, Дыбовский, Эннандейл) считали байкальских губок близкими морским и даже помещали их в морские семейства (Miklucho-Maclay, 1870; Dybowsky, 1882; Annandale, 1913).
Сварчевский (1902, 1923) считал, что Lubomirskiidae и Spongillidae имеют различное происхождение. По его мнению, эндемичные байкальские виды губок связаны в своем происхождении со спонгиофауной северных морей, а именно Берингова моря. Космополитные виды, относящиеся к семейству Spongillidae, он считал пришлыми для Байкала материковыми формами.
Новое понимание вопроса происхождения байкальских губок было предложено Макушком (1925, 1927 а, б). В отличии от Сварчевского, он рассматривал всю спонгиофауну Байкала как совокупность видов, единых в своем происхождении. Предками байкальских губок Макушок считал современных спонгиллид, которые, попадая в Байкал с его необычными условиями глубоководного озера, дали широкую видовую радиацию. В подтверждение своей точки зрения он ссылался на наличие в Байкале видов, частично утративших характерные для спонгиллид черты, а также на сходство в строении эндемичной В. intermedia Dybowski, которую он считал промежуточной формой, с типичными спонгиллидами.
Дальнейшее изучение семейства Lubomirskiidae заставило по-новому взглянуть на возможные пути его эволюции и филогении. Резвой (1936) считал маловероятным, что семейства Lubomirskiidae и Spongillidae имеют общее происхождение, и рассматривал байкальских губок как независимых выходцев из моря, более поздних, чем остальные пресноводные губки. Резвым описан вид из озера Джегатаи-Куль, относящийся к семейству Lubomirskiidae (Резвой, 1936). На основании этих данных, указывающих на то, что семейство Lubomirskiidae свойственно не одному Байкалу, Резвой подверг сомнению точку зрения Макушка. Однако позднее, по данным М.М. Кожова (1972), губка из озера Джегатай-Куль была отнесена к космополитному семейству Spongillidae.
По мнению Резвого (1936), формирование байкальской спонгиофауны нельзя объяснить только своеобразием экологических условий Байкала. Резвой первым отметил, что для выяснения вопроса о генезисе эндемичной байкальской спонгиофауны необходимо подробное изучение геологической истории байкальского региона.
Мартинсон, основываясь на данных палеонтологических исследований, предложил свою теорию происхождения байкальской фауны, в том числе эндемичных байкальских губок. В миоценовых и плиоценовых отложениях Прибайкалья и Приморья Мартинсон (1958, 1967) обнаружил спикулы, сходные со спикулами представителей семейств Lubomirskiidae и Spongillidae. Кроме того, раковины байкальских моллюсков Baicaliidae и Benedictia были обнаружены в отложениях Долины озер и Нилгинской впадины в Монголии (Мартинсон, 1958). Раковины байкальских моллюсков и спикулы байкальских губок обнаружены также в третичных террасах Южного Байкала. Основываясь
на этих данных, Мартинсон (1967) и Старобогатов (1970) разработали следующую гипотезу происхождения эндемичной фауны Байкала. Согласно этой гипотезе, эндемичные байкальские губки относятся к мезолимническому комплексу байкальской фауны. Данный комплекс возник в конце нижнего и начале верхнего мела в крупных водоемах Центральной и Юго-Восточной Азии. Космополитное же семейство Spongillidae, представители которого населяют в настоящее время соры и заливы Байкала, было отнесено к палеолнмническому комплексу, возникшему в континентальных водоемах триасского и юрского периодов. Кожов (1947) также считал, что семейство Lubomirskiidae сформировалось в обширных водоемах существовавших на месте современной впадины озера Байкал в прошлом.
Однако данные палеобиогеографии указывают лишь на географическую распространенность семейства Lubomirskiidae в прошлом, но не решают вопрос о происхождении эндемичной байкальской спонгиофауны. Результаты исследований гаметогенеза, эмбрионального развития, личиночных стадий и процессов метаморфоза у эндемичных байкальских губок позволили по-новому подойти к оценке родственных связей между спонпшлидами и любомирскиидами (Гуреева, 1968, 1969). На основании данных, свидетельствующих о большом сходстве процессов эмбриогенеза у Lubomirskiidae и Spongillidae, Гуреева сделала вывод о наличии общих предков у эндемичного и космополита о го семейств. Отсутствие субдермальных полостей у любомирскиид рассматривалось Гуреевой как примитивная черта их организации. По мнению Гуреевой, именно Spongillidae произошли от древних форм, близких к Lubomirskiidae.
Анализ нуклеотпдных последовательностей фрагментов гена 18S рРНК
Были получены нуклеотидные последовательности ITS1 и ITS2 районов рибосомной РНК большинства видов пресноводных губок, встречающихся в Байкале. Было проанализировано 14 видов семейства Spongillidae и 13 видов семейства Lubomirskiidae. Также в анализ был включен ряд видов космополитного семейства Spongillidae, не встречающихся в Байкале, для установления филогенетических отношений между видами семейств Spongillidae и Lubomirskiidae.
Данный участок генома включает 3 конец 18S рРНК, внутренний транскрибируемый спейсер 1, 5S рРНК, внутренний транскрибируемый спейсер 2 и 5 конец 28S рРНК (рис. 2).
Длина полученных структур составила около 1060 пар нуклеотидов (Приложение 2). Длина 3 конца 18S рРНК составила 77 пар нуклеотидов. Длина 5 конца 28S рРНК составила 114 пар нуклеотидов. Длины ITS1 и ITS2 районов варьируют у разных видов. Так, длина 1TS1 варьирует у разных видов пресноводных губок от 215 до 260 пар нуклеотидов, ITS2 от 237 до 294 п.н. Наибольшие отличия имеются в ITS1 и ITS2 районах рРНК, в то время как участки 18S и 28S рРНК являются консервативными. Для проверки на внутривидовую вариабельность по данному фрагменту гена исследовались по нескольку образцов каждого вида. Исходя из полученных данных, процент гомологии колеблется в пределах одного вида от 97 до 100%, рода - от 80 до 85%. Процент гомологии между видами внутри семейства SpongiUidae равен 69. Среди видов семейства Lubomirskiidae процент гомологии по данному участку генома является чрезвычайно высоким, по сравнению со SpongiUidae, и составляет 95%. Низкий процент вариабельности между видами Lubomirskiidae показывает, что дивергенция между видами внутри семейства эндемичных байкальских губок произошла много позже, чем внутри семейства SpongiUidae
На основании выравненных нуклеотидных последовательностей с использованием пакетов программ MEGA 1,01 (Kumar et а]., 1993), PHYLIP (Felsenstein, 1995), PUZZLE 4.0 (Strimmer, Haeseler, 1997) и MrBayes v3.0 (Huelsenbeck, 2000) были построены филогенетические деревья. В качестве аутгруппы была использована последовательность морской Demospongiae отряда Halichondrida Hymeniacidon hcliophila (номер в GenBank U65485).
Дендрограммы, полученные методами объединения ближайших соседей, максимальной экономии и максимального правдоподобия, имеют сходную топологию (рис, 3, 4, 5). Незначительные отличия в топологии отражаются в кластеризации близкородственных видов внутри семейства Lubomirskiidae. На всех филогенетических деревьях все пресноводные губки имеют общего предка. Семейства Lubomirskiidae и SpongiUidae монофилетичны. Дивергенция пресноводных семейств губок от общего предка согласно топологии полученных филогенетических деревьев происходила в следующем порядке: Potamolepidae, Spongillidae, Lubomirskiidae.
На полученных филогенетических деревьях все виды Lubomirskiidae с высокой степенью бутстреп-поддержки (99 - 100%) образуют одну монофилетическую группу. Внутри данной группы ветвление разрешено недостаточно из-за низкого уровня дивергенции между последовательностями ITS районов. Почти все ветви внутри группы байкальских эндемичных видов имеют низкий уровень бутстреп-поддержки. Распределение видов по существующим четырем родам не поддержано топологией полученных деревьев. Так, представители рода Baikahspongia распределились по разным группам, однако это распределение слабо поддержано. Однозначно хорошо поддержана кластеризация образца, идентифицированного по морфологическим признакам как спонгиллида открытого Байкала рода Trochospongiila (Ефремова, 2001), вместе с видом семейства Lubomirskiidae Baikahspongia sp. Такое расположение на филогенетическом древе показывает, что этот образец вероятно относится к семейству Lubomirskiidae, а не Spongillidae. Единственным поддержанным кластером является кластер, содержащий Baikahspongia robusta, Lubomirskia fusifera, Rezinkovia arbuscitla (61% бутстреп-поддержки на дереве, полученном методом максимального правдоподобия) (рис. 5). Однако на дендрограммах, полученных методами объединения ближайших соседей и максимальной экономии, вид Rezinkovia echinata располагается отдельно (рис. 3, 4). Все виды семейства Lubomirskiidae характеризуются крайне высокой степенью генетического родства и поэтому филогенетические отношения между ними на полученных деревьях не разрешены.
Кластеризация видов внутри семейства Spongillidae является сходной на деревьях, полученных разными методами. Имеется две хорошо поддержанных монофилетических группы среди космополитных пресноводных губок семейства SpongilHdae. Первая группа включает виды рода Radiospongilla, вторая - родов Eimapius и Spongilla. Монофилетическая группа Eimapius состоит из видов Eimapius coniferus, Eimapius ry item is, Eimapius sinensis, Eunapius spl. и Eimapius sp2. Три вида образуют группу Radiospongilla: R. scndai, R. ccrebellata, R. crater if or mis. Два вида рода Ephydatia - Ephydatia fluviatill s и Ephydatia muelleri, а также вид Heterorotula multidentata или образуют отдельную от остальных видов группу (рис. 5), или находятся у основания древа, и их отношения с другими видами SpongilHdae не разрешены (рис. 3, 4), Кластеризация вида Heterorotula multidentata вместе с видами рода Ephydatia говорит о родстве родов Ephydatia и Heterorotula, Вид Spongilla lacustris ответвляется от основания группы, включающей представителей рода Eunapius, что указывает на наличие общего предка родов Eimapius и Spongilla. Согласно топологии дерева, род Spongilla является более древним, чем Eimapius. Полученные данные показали монофилию родов Eimapius и Radiospongilla, что согласуется с данными систематики по морфологическим признакам (Penney, Racek, 1968; Masuda, 1998; Pronzato, Mancony, 2001). Среди изученных пресноводных родов наиболее базально расположен род Ephydatia, что указывает на его большую близость к общему предку пресноводных губок как семейства Lubomirskiidae, так и семейства SpongilHdae.
Разработка способа видовой идентификации губок с неопределенными морфологическими признаками
Гипотезы о времени возникновения эндемичного семейства Lubomirskiidae можно разделить на три группы. Согласно первой из них, байкальские губки являются реликтами древней морской или пресноводной фауны и их возраст значительно превосходит возраст Байкала (Берг, 1900; Верещагин, 1935). Вторая группа исследователей (Мартинсон 1958, 1967; Старобогатов, 1970) считала байкальских губок представителями мезолимнической фауны, сформировавшейся в палеогене. Наконец, согласно третьей точке зрения, выраженной в исследованиях Макушка (1925), процесс формирования байкальских видов губок происходит в течение нескольких поколений через ряд переходных
Для приблизительной оценки времени дивергенции байкальских губок от космополитных пресноводных нами был использован ген первой субъединицы цитохром с оксидазы, эволюция которого более соответствует гипотезе молекулярных часов (Saccone et al., 1999), чем эволюция исследованных нами генов рибосомной РНК и интронных последовательностей.
Для оценки постоянства скорости нуклеотидных замен был применен двухкластерный тест и тест на отношение длин ветвей (Takezaki et al,, 1995). Тест был применен для выравненных последовательностей СОХІ гена длиной 676 п.н. Книдария Metridium senile использовалась как аутгруппа. Проведенная оценка равномерности эволюции гена СОХІ у байкальских и морских губок показала, что для многих ветвей филогенетического древа скорость эволюции не является постоянной (значение Z 1), при этом в некоторых случаях уровень достоверности достигает 5%. Поэтому проведенные нами оценки времени дивергенции пресноводных губок являются приблизительными.
Затем с использованием программы MEGA (Kumar et al., 1993) был проведен подсчет генетических дистанций по двух-параметровому методу Кимура для всех видов, входящих в анализ (Табл. 4). В заключение были подсчитаны средние генетические расстояния между кластерами близкородственных видов. Средняя генетическая дистанция между семействами Lubomirskiidae и Spongillidae составила 0,5 % нуклеотидных замен, между видами семейства Lubomirskiidae - 0,2%, между пресноводными и морскими Porifera- 19 %.
Согласно палеонтологическим данным, возраст первых пресноводных губок оценивается в интервале от 50 до 150 млн. лет (Mancony, Pronzato, 2002). Учитывая это, а также полученные генетические дистанции между морскими и пресноводными губками, мы получили скорость накопления замен, равную около 0,1-0,4 % пуклеотидных замен за 1 млн. лет.
Стандартная скорость эволюции митохондриального генома многоклеточных равна 1-2% пуклеотидных замен за 1 млн. лет (Wolstenholme, 1992), Полученные нами данные показали замедленную скорость эволюции митохондриального генома у губок по сравнению со стандартными значениями. Основываясь на полученных результатах, мы получили следующие временные интервалы: для дивергенции между семействами Lubomirskiidae и Spongillidae - 1,3-3,8 млн. лет, для дивергенции видов внутри Lubomirskiidae — 0,5—1,5 млн. лет.
Известно, что скорость эволюции гена COXI варьирует у разных групп организмов (Wolstenholme, 1992, Capaldi et al, 1983). Замедленная скорость эволюции митохондриальных генов у низших беспозвоночных отмечается также в недавно опубликованных работах других авторов (Shearer et al., 2002), В настоящее время отсеквенирована только часть митохондриального генома губок, включая фрагмент COXI гена (Watkins et al., 1999; Erpenbeck et al., 2002). В первых работах такого рода, сделанных на губках, отмечалось, что у губок наряду с другими двуслойными, похоже, имеется более высокий уровень консерватизма митохондриальной ДНК, чем у трехслойных животных. Согласно мнению Уоткннса (Watkins, не опубл. данные, цит. по: Shearer et al., 2002), скорость эволюции митохондриального генома у губок в 2-8 раз меньше, чем у других беспозвоночных.
Скорость эволюции митохондриальной ДНК у других примитивных многоклеточных - Anthozoa (Коралловые полипы) - также является в 10-20 раз более медленной по сравнению с другими морскими беспозвоночными. Среди возможных причин высокого консерватизма митохондриальной ДНК у губок и книдарий называют существование у примитивных многоклеточных особой системы репарации неспарсиных оснований, сходной__с имеющейся у бактерий (Shearer et al., 2002). Предположение, что низкая степень дивергенции внутри класса Anthozoa связана с эффектом бутылочного горлышка, а не с медленной скоростью накопления мутаций, представляется маловероятным, так как это явление обнаружено среди многих линий Anthozoa. По-видимому, скорость эволюции митохондриального генома у всех ранних многоклеточных была медленной, и увеличение этой скорости произошло в период появления двусторонне-симметричных животных (Shearer et al., 2002). Поэтому стандартные калибровки скорости нуклеотидных замен, применяемые для других организмов в частности для беспозвоночных, не подходят для применения на губках.
