Содержание к диссертации
Глава 1. Л И Т Е Р А Т У Р Н Ы Й О Б З О Р1.1. Общая характеристика озера Байкал
1.2. Теории происхождения и формирования байкальской малакофауны
1.5. Морфологические особенности моллюсков рода Baicalia
1.3. Экологические особенности распределения моллюсков в озере Байкал
1.3.1. Взаимосвязь между филогенетическим положением видов сем. Baicaliidae и их экологическими нишами
1.4. Филогенетическое положение вида В. carinata и его близкородственных видов рода Baicalia '
1.6. Эволюционные процессы в популяциях
1.7. Методы оценки степени разобщенности популяций
1.7.1. ^-критерий
1.7.2. Критерий Манна-Уитни
1.8. Пространственная структура популяций
1.9. Механизмы микроэволюции v 1.10. Применение молекулярно-филогенетического подхода для исследования популяционнои структуры видов
1.12. Оценка времени видовой-дивергенции
1.12.1. Гипотеза молекулярных часов '
1.12.2. Тест на относительную скорость эволюции (Relative rate test)
1.12.3. Двухкластерный тест
1.12.3. Тест длин ветвей (branch-length test)
1.13. Молекулярно-филогенетический анализ, основанный на нуклеотидных последовательностях ДНК
1.13.1. Бутстреп-анализ
1.13.2. Баесовский анализ
1.13.3. Применение сетчатых деревьев для исследования популяционнои структуры видов и восстановления истории расселения
1.14. Выбор молекулярно-филогенетического маркера
1.14.1. Митохондриальные маркеры
1.14.2. Гены рибосомных РНК как генетические маркеры
1.15. Коалесценция митохондриальной ДНК Г л а в а 2. М А Т Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
2.1. Сбор материала
2.2. Морфометрия
2.3. Экстракция ДНК
2.4. Амплификация ДНК
2.5. Методы очистки амплифицированных фрагментов
2.5.1. Очистка амплифицированных фрагментов в геле легкоплавкой агарозы
2.5.2. Очистка амплифицированных фрагментов с помощью силики и гуанидин тиоцианата
2.5.3. Очистка амплифицированных фрагментов электроэлюцией
2.6. Определение нуклеотидной последовательности
2.7. Выравнивание нуклеотидных последовательностей
2.8. Филогенетический анализ
2.9. Простирающиеся древа
2.10. Ранговый критерий Манна-Уитни
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И О Б С У Ж Д Е Н И Е
3.1. Определение нуклеотидных последовательностей
3.2. Исследование нуклеотидного состава молекулярно-филогенетических маркеров
3.2.1. Нуклеотидный состав и первичное исследование нуклеотидных последовательностей фрагмента С
3.2.2. Нуклеотидный состав и первичное исследование нуклеотидных последовательностей фрагмента ITS
3.3. Исследование популяционной структуры Baicalia carinata
3.3.1. Изучение популяционного полиморфизма В. carinata по митохондриальному маркеру
3.3.2. Изучение популяционного полиморфизма В. carinata по ядерному маркеру
3.4. Оценка достоверности генетической неоднородности Baicalia carinata
3.5. Филогенетические взаимоотношения внутри рода Baicalia
3.6. Морфологическая дифференциация В. carinata по пластическим признакам
3.7. Таксономический статус Baicalia carinata rugosa, Lindh
Введение к работе
Актуальность работы Методы молекулярной биологии и популяционной генетики, включающие сравнительный анализ гомологичных нуклеотидных последовательностей уже более десяти лет применяют для исследования, внутривидового полиморфизма. В настоящее время достаточно мало известно о механизмах видообразования и репродуктивной изоляции, несмотря на простоту оценки внутри- и межпопуляционного полиморфизма на молекулярном уровне (Avise, 1994). При использовании филогенетических подходов для анализа генетического полиморфизма популяций появилась возможность изучения их эволюционных историй (Vigilant et al., 1991). Относительная легкость определения нуклеотидных последовательностей ДНК дала возможность отдельно анализировать синонимический и несинонимический полиморфизм, и, таким образом, изучать как адаптивную, так и неадаптивную эволюцию на молекулярном, уровне. В качестве объекта исследования выбрали группу эндемичных видов моллюсков рода Baicalia Martens, 1876 из сем. Baicaliidae. Биологическая^и-экологическая изученность этих моллюсков, а также их широкое распространение и низкая скорость перемещения по периметру водоема, дают уникальную возможность для изучения сценариев видообразования» в оз. Байкал.
В.Байкале к настоящему времени обнаружено 179 видов^моллюсков, из которых 41 принадлежат эндемичному семейству Baicaliidae (Sitnikova, 1994). На протяжении более чем столетней истории изучения байкальских моллюсков их таксономия неоднократно пересматривалась. Современная классификация построена на таких морфологических признаках, как -особенности строения раковины и радулы и анатомии женской половой системы (Dybowski, 1875; Lindholm, 1909, 1924; Кожов, 1951; Ситникова, 1991). Для семейства Baicaliidae характерно большое разнообразие форм и, скульптуры раковин, многим видам свойственна высокая степень морфологического внутривидового полиморфизма (Кожов, 1936). Большой размах внутривидовой изменчивости серьезно затрудняет и видовую идентификацию, и, следовательно, систематику этой группы. Сравнение нуклеотидных последовательностей митохондриального гена, кодирующего СО 1, свидетельствует об исключительно быстром процессе видообразования при адаптивной радиации от общего предка, существовавшего, предположительно, 3,0-3,5 млн. лет назад (Зубаков и др:, 1997; Щербаков, 2003).
Наличие множества, переходных форм* особенно ярко выражено^ у представителей рода Baicalia. Из всех видов этого рода наиболее изменчивым оказался вид Baicalia carinata W. Dyb., 1875, который, в,то же время, является одним из наиболее широко распространенных в озере (Кожов, 1936). Представители этого вида обитают как в открытых частях Байкала, так и в бухтах на глубинах от 5 до 100 м и населяют песчаные или песчано-илистые грунты. Самки этого вида откладывают яйца на раковины других моллюсков своего вида.
В 1914 году Ж. Грохмалицкий и Б. Дыбовский (Dybowski, Grochmalicki-, 1914) описали 10 внутривидовых форм В. carinata. М.М. Кожов (Кожов, 1936) считал выделенные предыдущими авторами- вариететы экологическими формами одного вида. Только для одной из форм, отличающейся от других наличием слабо выраженных поперечных складок на раковине, М.М. Кожов предложил сохранить подвидовое название Baicalia carinata rugosa, данное В.А. Линдгольмом (Lindholm, 1909).
Описанные выше особенности каринат делают их исключительно интересным объектом исследования микроэволюционных процессов. В-этом качестве каринаты обладают рядом преимуществ даже по сравнению с цихловыми рыбами Великих африканских озер, которые относятся к наиболее популярным объектам для исследования моделей микроэволюции.
Каринаты также принадлежат к букету видов (Brooks, 1950), населяют почти непрерывную зону по периметру озера Байкал, образуя систему популяций, которые в первом приближении можно считать одномерными, но, в отличие от рыб, моллюски никогда не отрываются от дна, что очень сильно ограничивает их латеральную относительно шельфа миграцию.
Настоящая работа посвящена систематическому исследованию генетического разнообразия Baicalia carinata по всему периметру оз. Байкал с помощью сравнения нуклеотидных последовательностей двух локусов, одного - ядерного, и одного - митохондриального, и изучению филогенетических взаимоотношений между В. carinata и его близкородственными видами рода Baicalia.
Цель и задачи исследования: Цель настоящего исследования состояла в изучении генетической дифференциации видов рода Baicalia по периметру оз. Байкал и анализе микроэволюционных процессов, обеспечивающих высокое видовое разнообразие байкалий. Согласно поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1) Исследование генетического полиморфизма видов рода Baicalia по фрагментам митохондриальных и ядерных ДНК.
2) Установление филогенетических взаимоотношений вида В. carinata с другими видами рода Baicalia по результатам сравнения последовательностей митохондриального1 гена С01 и ядерного спейсера -ITS1.
3) Определение пространственно-генетической неоднородности в рамках вида В. carinata в зависимости от районов озера.
4) Сравнение характера молекулярной эволюции у сестринских видов рода Baicalia по митохондриальному и ядерному молекулярным маркерам.
5) Сравнение морфологической и генетической изменчивости В. carinata.
Научная новизна Впервые в результате проведенной работы с помощью методов молекулярного анализа подробно исследована пространственно-генетическая неоднородность эндемичного байкальского вида В. carinata. Установлено подразделение вида как минимум на две популяции: Юго-Западную и Восточную.
Использование рангового критерия Манна и Уитни подтвердило статистическую достоверность различий между выделенными популяциями по молекулярно-генетическим данным.
Исследованы филогенетические взаимоотношения внутри рода Baicalia.
Установлено, что В. carinata является предковым видом по отношению к остальным видам этого рода.
Проведено сравнение характера молекулярной эволюции у сестринских видов рода Baicalia по митохондриальному и ядерному молекулярным маркерам. Выявлено различие по скоростям накопления замен между сестринскими видами в митохондриальной ДНК. Практическое значение работы Полученные результаты могут быть использованы для моделирования. макро- и микроэволюционных процессов формирования репродуктивной изоляции и видового разнообразия. Наработанные-данные могут помочь в развитии общей теории видообразования эндемичных брюхоногих моллюсков озера Байкал.
Нуклеотидные последовательности* фрагмента гена С01 мтДНК депонированы в GenBank с номерами доступа: DQ436347-DQ436441.
Материалы диссертационной работы должны быть привлечены при проведении таксономической ревизии семейства Baicaliidae.
Результаты проведенных исследований используют в курсе лекций по генетике на биолого-почвенном факультете Иркутского Государственного Университета.
Апробация работы Материалы диссертации докладывались на Международной конференции «Mollusks of the Northeastern Asia and Northern Pacific: Biodiversity, Ecology, Biogeography and Faunal History». Владивосток, 2004.
На Четвертой Верещагинской Байкальской конференции. Иркутск, 2005. На пятой международной конференции «International conference on Bioinformatics of Genome regulation and Structure». Новосибирск, 2006. Ha всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений». Иркутск, 2006. На четвертой международной конференции «Speciation in Ancient Lakes, SIAL IV» Берлин, Германия, 2006. На Международном Малакологическом Конгрессе, Антверпен, Бельгия, 2007.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 3 в отечественных рецензируемых журналах.
1. Самсонова Т.Е., Щербаков Д.Ю., Ситникова Т.Я. Популяционногенетическое исследование комплекса видов Baicalia carinata (Mollusca, Pectinibranchia). Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2003; (7): 136-138.
2. Peretolchina Т.Е., Sitnikova T.Ya., Sherbakov D.Yu. Genetic polymorphism in the Baicalia carinata species complex. Международная конференция «Mollusks of the Northeastern Asia and Northern Pacific: Biodiversity, Ecology, Biogeography and Faunal History». Vladivostok: Dalnauka, 2004. P. 134-135.
3. Перетолчина Т.Е., Букин Ю.С., Ситникова Т.Я., Щербаков Д.Ю. Внутривидовой генетический полиморфизм комплекса видов Baicalia carinata. Четвертая Верещагинская Байкальская конференция. Иркутск. 2005.
4. Peretolchina Т.Е., Bukin Yu.S., Sitnikova T.Ya. Sherbakov D.Yu. Population genetic polymorphism of endemic mollusks Baicalia carinata (Mollusca, Caenogastropoda). «Fifth International conference on Bioinformatics of Genome regulation and Structure». Novosibirsk, 2006. P. 203-206.
5. Перетолчина Т.Е., Щербаков Д.Ю. Исследование генетического полиморфизма вида Baicalia carinata (Mollusca, Caenogastropoda) на основе сравнения двух генетических маркеров: фрагментов митохондриального гена COl и ядерного некодирующего региона ITS1. Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома^ растений». Иркутск, 2006. 83-84.
6. Peretolchina Т., Sitnikova Т., Riedel F., Sherbakov D. Intraspecific structure of two species of Baikaliidae (Caenogastropoda, Rissooidea) fromXake Baikal. International conference «Speciation in Ancient Lakes, SIAL IV». Berlin, 2006. P. 49.
7. Перетолчина Т.Е., Ситникова Т.Я., Щербаков Д.Ю. Исследование популяционного генетического полиморфизма эндемичного байкальского моллюска Baicalia carinata (Mollusca, Caenogastropoda). Ruthenica; 2006; 16(2): 105-111.
8. Перетолчина Т.Е., Щербаков Д.Ю. Популяции байкальских эндемичных гастропод Baicalia carinata (Mollusca: Caenogastropoda) и их эволюционные связи с сестринскими видами. // Материалы конференции Современные проблемы биологической эволюции. К 100-летию Дарвиновского музея. 17-20 сентября 2007г. Москва, Россия; 2007. 187-188.
9. Peretolchina Т.Е., Sherbakov D.Yu., Sitnikova T.Ya. Populations of baikalian endemic mollusks Baicalia carinata (Mollusca, Caenogastropoda) end evolution relation with close related species. World Malacological Congress. Antwerpen, Belgium. P. 167.
10. Перетолчина Т.Е., Букин Ю.С., Ситникова Т.Я., Щербаков Д.Ю. Генетическая дифференциация эндемичного байкальского моллюска Baicalia carinata (Mollusca, Caenogastropoda). Генетика; 2007; 43(12): 1667-1675.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю - д.б.н. Щербакову Д.Ю., а также к.б.н. Букину Ю.С., к.б.н.
Кравцовой Л.С. за ценные консультации и поддержку на всех этапах подготовки диссертационной работы.
Огромную благодарность автор выражает д.б.н. Ситниковой Т.Я. за помощь в систематике моллюсков и консультации при выполнении и оформлении диссертации, за сотрудничество в написании совместных статей и всестороннюю поддержку.
Исследование выполнялось при частичной поддержке гранта РФФИ, проекты №№ 02-04-630976, 03-04-631026, 04-04-48549-а, №№ 05-04-97246, 05-04-97258 и совместным российско-голландским проектом "Information system 'Simulation and Analysis of Complex Histories of Evolution (SACHE)", Ref. 047.016.013, а также гранта научной школы (НШ-2195.2003.4). ' Структура и объем диссертации. Работа включает следующие разделы: введение, литературный обзор, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список используемой литературы (185 ссылок). Диссертация изложена на 116 страницах, содержит 39 рисунков и 6 таблиц.
