Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Биологические особенности сосен подрода Strobus рода Pinus 7
1.2. Систематика и межвидовая гибридизация сосен секции Strobus 20
1.3. Использование генетических маркеров в популяционной генетике хвойных 24
1.4. Уровни белкового полиморфизма и внутривидовая дифференциация сосен 28
1.5. Исследования филогенетических связей видов подрода Strobus с помощью молекулярно-генетических маркеров 35
2. Материалы и методы 39
2.1. Растительный материал. Видовой состав.
Характеристика и локализация выборок 39
2.2. Хранение материала и подготовка образцов для анализов 43
2.3. Условия электрофореза 43
2.4. Изученные изоферментные системы 44
2.5. Анализ наследования и система обозначений 45
2.6. Статистические методы 46
3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Аллозимная изменчивость 49
3.2. Анализ аллельных частот 85
3.3. Внутрипопуляционная генетическая изменчивость 91
3.4. Динамика индивидуальной гетерозиготности в популяциях корейской сосны на разных стадиях жизненного цикла 98
3.5. Межпопуляционная гетерогенность и пространственная дифференциация 103
3.6. Родственные связи и генетическая дифференциация сосенсекции Strobus 115
Заключение 125
Выводы 127
Литература
- Систематика и межвидовая гибридизация сосен секции Strobus
- Уровни белкового полиморфизма и внутривидовая дифференциация сосен
- Хранение материала и подготовка образцов для анализов
- Динамика индивидуальной гетерозиготности в популяциях корейской сосны на разных стадиях жизненного цикла
Введение к работе
За последние сто лет антропогенное давление на биосферу достигло огромных масштабов, что привело к гибели многих видов организмов и исчезновению целых экосистем. Популяционная структура многих видов была нарушена такими процессами, как сокращение численности, фрагментация ареалов, искусственное изменение возрастной и половой структуры популяций, что поставило их на грань вымирания (Алтухов, 1995, 2004). В связи с этим была сформулирована главная задача рационального использования природных ресурсов, состоящая, прежде всего, в сохранении биологического разнообразия через сохранение отдельных видов и их среды обитания.
Леса северного полушария на 70 - 80% состоят из хвойных пород. Хвойные растения, являясь в большинстве своем хозяйственно ценными видами, подвергаются значительному влиянию со стороны человека, что обуславливает необходимость сохранения и восстановления их популяций. Решение этой задачи невозможно без применения знаний о популяционно-генетической структуре видов и основах их адаптивного генетического разнообразия.
Развитие генетики лесных древесных видов за последние десятилетия внесло огромный вклад в селекционную работу, осуществление программ воспроизводства и восстановления природных популяций лесных пород. Охарактеризована генетическая изменчивость множества хозяйственно-ценных видов, а также видов, находящихся под угрозой полного исчезновения. Таким прогрессом генетика лесных древесных растений во многом обязана развитию методов выявления полиморфизма белков и ДНК. Генетические маркеры используются для различных целей, таких как: описание и мониторинг генетического разнообразия в пространстве, включающего как адаптивные, так и нейтральные признаки; выявление ключевых факторов, определяющих динамику генетического разнообразия, например, изучение системы скрещивания, потока генов, истории формирования природных ареалов; исследование родственных связей между различными таксонами; генетическое картирование, поиск локусов контролирующих количественные признаки (QTL) и селекция с помощью маркеров (marker assisted selection, MAS); сертификация и контроль посадочного материала и древесины.
Хвойные растения характеризуются богатым видовым составом, большой протяженностью ареалов, высокой приспособленностью к различным условиям окружающей среды и высокой степенью генетического разнообразия. Благодаря уникальной системе размножения, позволяющей устанавливать наследование и сцепление генных локусов без применения длительных и трудоемких скрещиваний, и возможности одновременного анализа двух поколений (гаплоидные мегагаметофиты и диплоидные зародыши), подробно изучена генетическая изменчивость и процессы, происходящие в популяциях многих видов хвойных.
Актуальность темы. Мониторинг внутривидового разнообразия является одной из наиболее актуальных проблем современной популяционной и природоохранной генетики. Изучение популяций лесных древесных растений представляет не только теоретический, но и прикладной интерес. С применением методов выявления полиморфизма белков и ДНК было показано, что на формирование популяционной структуры сосен влияет ряд факторов, таких как история формирования ареала, система скрещивания, миграция и генные потоки, изоляция и дрейф генов, естественный отбор, а также усиливающееся антропогенное влияние. Несмотря на определенные успехи и практические достижения в этой области, процессы формирования и динамики генофондов экосистемно-образующих видов кедровых сосен, имеющих экономическую ценность, по настоящее время остаются неисследованными. Кроме того, интерес представляет изучение родственных отношений видов секции Strobus рода Pinus. Предпринимавшиеся филогенетические исследования, как традиционные морфологические, так и с применением молекулярно-генетических маркеров, внутри рода Pinus показали однозначную дифференциацию на подроды и секции. Однако, до сих пор не сформировались однозначные взгляды на систематику внутри секции Strobus, поскольку исследования включали небольшое число образцов и давали противоречивые результаты.
Учитывая большую экологическую и хозяйственную ценность сосны корейской и сосны кедровой европейской, а также сложившуюся в последнее время угрозу их генофондам, возникла необходимость исследовать популяционно-генетическую структуру этих видов с различными типами ареалов и историей их формирования, а также проанализировать родственные связи этих видов с другими представителями секции Strobus рода Pinus.
Целью работы явилось изучение аллозимного полиморфизма и дифференциации популяций сосны корейской, Pinus koraiensis Sieb. et Zucc, и сосны кедровой европейской, Pinus cembra L., а также определение их родственных связей с другими видами секции Strobus. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- исследовать аллозимную изменчивость двух видов кедровых сосен, сосны корейской и сосны кедровой европейской;
- оценить параметры внутрипопуляционной и межпопуляционной изменчивости для этих двух видов с контрастными типами ареалов;
- сравнить показатели аллозимной изменчивости на разных стадиях жизненного цикла растений (взрослые деревья и зародыши их семян);
- исследовать родственные связи этих сосен с другими представителями секции Strobus.
Научная новизна. Впервые выполнено сравнительное популяционно-генетическое исследование европейской и корейской кедровых сосен на большом количестве популяций из разных частей ареалов с применением большого числа универсальных аллозимных маркеров. Исследованы их связи с пятнадцатью родственными видами - представителями подрода Strobus.
Практическое значение. Данные, представленные в работе, имеют практическую ценность для организаций, занимающихся воспроизводством и охраной генофондов древесных растений. Полученные результаты могут быть использованы Агентством по лесам РФ, ФГУП «Рослесозащита», НИИЛГиС (г. Воронеж) в разработке программ сохранения и хозяйственного использования этих видов без нанесения урона их генофондам, для сертификации посевного материала при создании семенных плантаций и подбора партий семян для длительного хранения в генетических банках, проверки уровней генетического разнообразия и паспортизации объектов ЕГСК (Единого генетико-селекционного комплекса), идентификации потомства в контролируемых скрещиваниях (в том числе и при межвидовой гибридизации), уточнении границ лесосеменных районов.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 96-04-49465, 99-04-48962, 04-04-49795, 05-04-48591), программ Президиума РАН «Динамика генофондов», «Биологические ресурсы России: Фундаментальные основы рационального использования», «Происхождение и эволюция биосферы», а также Программы поддержки ведущих научных школ (НШ-1698.2003.4; НШ-8596.2006.4).
Ю.П. Алтухову и Д.В. Политову за всестороннюю помощь и
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность научным руководителям
поддержку; П.Н. Разумову, Р. Ханту, Р. Снежко, X. Вангу, Р. Финкельдаю, А.В. Громадину, Ф. Бергманну, Р.Т. Гуту, И. Бладе, С. Н. Горошкевичу и коллективу Хабаровской лесосеменной станции - за предоставленные образцы семян и вегетативных тканей; М.М. Паленовой, Н.Ю. Гордон, Ю.С. Белоконю - за помощь в сборе материала в экспедициях; О.П. Малюченко, Ю.С. Белоконю -за помощь при проведении лабораторных экспериментов. Автор благодарит К.В. Крутовского, Е.А. Салменкову, Д.В. Политова, Ю.С. Белоконя за ценные замечания и обсуждение в ходе подготовки рукописи.
Систематика и межвидовая гибридизация сосен секции Strobus
Деление секции Strobus на подсекции по морфолого-анатомическим признакам вызывает ряд вопросов у исследователей. Довольно надежными признаками для выделения в отдельную группу Cembrae можно считать особенности строения шишек (чешуи удерживают семена в зрелом состоянии) и полную бескрылость семян. У. Критчфилд предположил, что бескрылость среди представителей подсекции Cembrae возникала, по меньшей мере, дважды в Евразии (независимо у P. pumila и в группе P. cembra- Р. sibirica- Р. koraiensis) и единожды в Северной Америке (P. albicaulis) и предложил считать ее конвергентным эволюционным признаком среди белых сосен, не имеющим решающего значения для построения систематики (Critchfield, 1986). Семена представителей подсекции Cembroides секции Раггуа также полностью лишены крыла. Бескрылость (полная или частичная) возникала множество раз у разных групп сосен, в том числе и у некоторых представителей подрода Pinus, как приспособление к распространению семян птицами. Поэтому при филогенетических построениях необходимо учитывать и другие признаки.
В работе Куприяновой и Литвинцевой (1974), посвященной исследованию строения пыльцы сосен группы Cembrae и близких видов, показана близость P. koraiensis к P. armandii - представителю Strobi. Другие группы, выделенные по сходному строению пыльцы: P. cembra, P. sibirica и Р. pumila; P. albicaulis, P. flexilis и P. strobus. В исследовании клеток паренхимы хвои кедровых и близких к ним сосен (Литвинцева, 1974) предлагается деление на две группы по морфологическому сходству. Первая группа - Pinus sibirica и Pinus cembra, у которых поверхность клеток паренхимы гладкая. Вторая группа состоит из трех подгрупп, включающих сосны с разной степенью складчатости оболочек клеток паренхимы: 1 - P. pumila и P. albicaulis, 2- P. koraiensis и Р. armandii, 3-Р. flexilis и P. strobus.
По расположению главных смоляных каналов внутри хвои также невозможно четко разделить представителей подсекций. Критчфилд выделяет в отдельную группу из четырех видов секции Strobus, у которых по три смоляных канала расположены центрально: P. cembra, P. sibirica, P. koraiensis и Р. armandii. У других представителей секции главные смоляные каналы расположены поверхностно (Critchfield, 1986).
Значительные анатомические сходства указывают на близость сосен двух подсекций и, возможно, отражают общность их происхождения, однако, они могут быть и специализированными адаптациями к условиям обитания видов, поэтому их использование в исследованиях по систематике на уровне ниже секции не всегда оправдано.
Число хромосом у сосен и кариологический анализ Все представители рода Pinus имеют диплоидный набор хромосом 2n = 24 (Муратова, 1980; Козубов, Муратова, 1987; Муратова, Круклис, 1988). Кариотипы всех видов сосен характеризуются значительным сходством длины хромосом, расположения центромер. Несмотря на некоторые видовые особенности, морфологическая дифференциация хромосом между видами внутри подрода Strobus выражена слабо и не может быть использована для построения классификаций внутри секций (Saylor, 1983). Кариологические особенности представителей подсекции Cembrae были рассмотрены в работе Е. Н. Муратовой (1980). Была выявлена внутривидовая изменчивость по числу вторичных перетяжек на некоторых хромосомах, в зависимости от места обитания. Показано значительное сходство в морфологии и размерах хромосом.
Межвидовая гибридизация Межвидовая гибридизация встречается у древесных растений довольно часто. Широко известны примеры естественной гибридизации в зонах перекрывания ареалов среди лиственных (роды Alnus, Betula) и хвойных (роды Larix, Picea) деревьев бореальной зоны (Коропачинский, Милютин, 2006).
Среди жестких сосен (подрод Pinus) межвидовая гибридизация также встречается в естественных условиях между близкими симпатричными видами: P. jeffreyi х P. ponderosa, P. jeffreyi х P. coulteri, P. radiata х P. attenuata, Р. palustris х P. taeda, P. taeda х P. echinata, P. banksiana х P. contorta, P. mugo х Р.
sylvestris, P. mugo x P. nigra, P. pinaster x P. halepensis и др. (Mirov, 1967). Некоторые из современных видов сосен произошли путем гибридизации. Так С.-Р. Ванг и А.Шмидт, исследуя хлоропластные геномы ныне существующих дальневосточных видов сосен, установили, что предками P. densata были Р. tabulaeformis, P. yunnanensis и третья неизвестная вымершая сосна (Wang, Szmidt, 1994). На основании морфологических (Урусов, 1999) и генетических (Потенко, Попков, 2003) данных доказано, что сосна погребальная, P. funebris, обитающая на Дальнем Востоке, является гибридом сосны густоцветковой и сосны обыкновенной.
Между представителями подсекций Cembrae и Strobi (секция Strobus подрода Strobus) нет четких репродуктивных барьеров. Описаны случаи естественной и искусственной гибридизации как внутри подсекций, так и между соснами из разных подсекций. Pinus reflexa - естественный гибрид Р. flexilis х P. strobiformis, обнаружен в естественных популяциях в штате Аризона в местах совместного произрастания этих видов (Andresen, Steinhoff, 1971; Steinhoff, Andresen, 1971); P. pumila x P. sibirica - обнаружена гибридизация в зоне перекрывания ареалов в нескольких локальностях на побережье Байкала (Politov et al, 1999; Горошкевич, 2000); Pinus hakkodensis - естественный гибрид P. pumila x P. parviflora (Sato, 1993b, a, 1995; Watano et al, 1996).
Во второй половине XX века широко предпринимались попытки искусственной гибридизации сосен из разных регионов с целью получения высокопродуктивных, быстрорастущих гибридов и форм, устойчивых к заболеваниям (таким как пузырчатая ржавчина, вызываемая грибом Cronartium ribicola). В результате этих исследований было получено множество гибридных форм, в том числе и трансконтинентальных гибридов.
Получены гибриды в скрещиваниях сосны сахарной (P. lambertiana) с сосной корейской и сосной Арманда {P. koraiensis, P. armandii) (Critchfield, Kinloch, 1986; Blada, 2000); сосны кедровой европейской (P. cembrd) с Р. wallichiana, P. monticola и P. flexilis (Blada, 1994), P. flexilis с P. albicaulis (Steinhoff, 1972). Хорошо скрещиваются между собой ряд сосен подсекции
Strobi - P. monticola, P. рейсе, P. wallichiana, P. strobus, P. parviflora (Mirov, 1967; Fowler, Heimburger, 1969; Bingham, 1972; Bingham et al, 1972; Kriebel, 1972; Steinhoff, 1972; Blada, 1992). Успешными также были скрещивания P. strobus x P. flexilis, P. strobus x P. рейсе (Kriebel, 1972; Blada, 2000), P. strobus x P. ayacahuite (Steinhoff, 1972), P. monticola x P. flexilis (Mirov, 1967; Bingham, 1972), P. monticola x P. strobiformis (Bingham, 1972; Bingham et al, 1972). В условиях ботанического сада обнаружена естественная гибридизация Р. wallichiana и P. ayacahuite (Dallimore, Jackson, 1948, цит. по (Mirov, 1967)).
Уровни белкового полиморфизма и внутривидовая дифференциация сосен
С начала 70-х годов прошлого столетия, благодаря применению методов выявляющих изоферментный полиморфизм, был накоплен огромный массив данных о генетической изменчивости в популяциях древесных растений. У большинства долгоживущих, ветроопыляемых видов с высоким уровнем ауткроссинга наблюдаются высокие уровни внутрипопуляционного разнообразия на фоне низкого разнообразия между популяциями (Hamrick, Godt, 1989; Hamrick et al, 1992). Хвойные обнаруживают очень высокие уровни генного и аллельного разнообразия. Обычно 45 - 70% их генов находятся в полиморфном состоянии. Однако встречаются гены, мономорфные в пределах родов и даже семейств. Среднее число аллелей на локус обычно находится в пределах от 1,5 до 2,5, средняя гетерозиготность (ЯЕ) - 12 - 22 % (Политов, 2004).
Современная картина генетического разнообразия хвойных сформировалась и продолжает развиваться под влиянием различных, часто разнонаправленных процессов, таких как история формирования ареала, система скрещивания вида, миграция, изоляция частей ареала и случайный дрейф генов, а также мутации и естественный отбор.
У сосен, как и у большинства хвойных, смешанная система скрещивания, с преобладанием перекрестного опыления и определенной долей самоопыления (от 0 до 10 %) (Политов, Крутовский, 1990). Кроме того, если в популяциях выражена семейная структура, часть скрещиваний в них будет близкородственными. В популяциях белоствольной сосны (Pinus albicaulis), распространяемой птицами, нередко встречаются группы деревьев, происходящих из одного тайника, оставленного кедровкой. Внутри такой группы особи часто являются полусибсами, так как происходят от одного материнского дерева. Вероятность опыления внутри группы довольно высока, что приводит к инбридингу, не связанному с самоопылением (Furnier et al, 1987; Rogers et al, 1999). У других видов кедровых сосен микродифференциация не выражена вследствие эффективного перемешивания семян внутри локальной популяции птицами и редкой встречаемости многоствольных групп (Lewandowski, Burczyk, 2000; Politov, Krutovskii, 2004).
Среди сосен встречаются как узкоареальные эндемики, так и виды с обширными и даже трансконтинентальными ареалами (Critchfield, Little, 1966; Mirov, 1967). За длительную эволюционную историю сосны пережили множество разнонаправленных климатических и геологических событий, которые повлияли на формирование их генетической структуры. Перемены климата за счет колебания температур привели к формированию современных ареалов видов, которые распространены севернее зон прошлых оледенений, или вытеснены другими видами на границы экологических ниш, пригодных для выживания. В неблагоприятных условиях численность видов могла резко сокращаться до немногочисленных изолятов (рефугиумов), в которых, при отсутствии миграции между ними, интенсивно происходил инбридинг и генетико-автоматические процессы, способствуя снижению разнообразия. После расселения в более благоприятных условиях показатели внутрипопуляционного разнообразия оказывались снижены, а различия между популяциями возрастали. Хорошим примером подобного хода событий может служить формирование ареала сосны белоствольной. Современный ареал вида представлен географически разрозненными высокогорными популяциями. Анализ изоферментной изменчивости P. albicaulis по всему ареалу (Jorgensen, Hamrick, 1997) показал, что в северных популяциях, реколонизировавших послеледниковые места обитания, снижено генетическое разнообразие (число аллелей на локус) и дифференциация между ними выше, чем между южными. Вероятно, значительную роль здесь сыграл эффект основателя -восстановление численности популяции из небольшого числа родительских особей с ограниченной изменчивостью. Сосна горная Веймутова, P. monticola -вид симпатричный P. albicaulis, также прошла через послеледниковую реколонизацию более северных территорий. Она демонстрирует высокий уровень межпопуляционного разнообразия. Данные, представленные Р. Стейнхофом и соавторами (Steinhoff et al, 1983), показывают максимальную дифференциацию между прибрежными популяциями (GST = 0,102 - 0,124), формирование которых происходило из разных рефугиумов, тогда как южные и центральные популяции оказались более сходными внутри групп (GST = 0.032 и 0,070 соответственно). Северные популяции оказались менее разнообразными по составу, чем южные. Среднее число аллелей на локус в южных популяциях (Калифорния) - 2,1, в северных прибрежных (Британская Колумбия, Вашингтон) - 1,5, центральных (Британская Колумбия, Монтана, Айдахо, Вашингтон) -1,7.
Хранение материала и подготовка образцов для анализов
Гистохимическое окрашивание срезов гелей проводили по стандартным методикам (Серов и др., 1977; Conkle et al, 1982; Cheliak, Pitel, 1984; Manchenko, 1994) с модификациями в ряде случаев. Поскольку выявление ADH и GDH требует одинакового состава красящей смеси, за исключением субстратов, а их изозимы значительно отличаются по электрофоретической подвижности, их окрашивание проводили на одном срезе геля, добавляя в смесь оба субстрата (Политов, 1989). Аналогичным образом проводили совместное окрашивание SDH, GDH и FDH. Данная методика не вызывала затруднений в интерпретации полученных спектров, поскольку при разгонке в буферной системе С различия в подвижности этих изозимов были довольно велики.
Все изученные ферментные системы, их обозначения и номера по К. Ф. (1984), буферные системы, применявшиеся при их разделении, число наблюдаемых и интерпретируемых независимых зон активности приведены в таблице 5.
Обнаруживаемые при окраске на соответствующие ферменты зоны активности рассматривались, как контролируемые отдельными генными локусами в случае независимой сегрегации аллозимных вариантов. Моногенный контроль каждой из зон проверяли путем сопоставления наблюдаемого и ожидаемого (1:1) сегрегационных соотношений аллозимных вариантов. Выявленные зоны активности, как и кодирующие их локусы, нумеровали в соответствии с убыванием их электрофоретической подвижности. Наиболее частому для данного вида аллелю присваивали обозначение 100, остальные аллели обозначали в соответствии с относительной электрофоретической подвижностью контролируемых ими аллозимов. Например: зона активности PGM-1 контролируется локусом Pgm-1 с аллелями Pgm-1100, Pgm-1103 и Pgm-189. Для сравнения изменчивости у разных видов обозначение 100 присваивали аллелю, наиболее часто встречающемуся у наибольшего числа видов.
От каждого дерева анализировали не менее 8 семян. Заключение о гетерозиготности материнского дерева по анализируемому локусу делали на основании сегрегации в гаплоидных эндоспермах семян от данного дерева. Если расщепления не наблюдалось, дерево считалось гомозиготным. В отсутствие нарушений менделевской сегрегации вероятность неправильной классификации гетерозиготы как гомозиготы определяется как
Р = 1-0,5 , где к- число проанализированных эндоспермов (Morris, Spieth, 1978). Поэтому для анализа генотипа дерева использовали не менее семи эндоспермов, что позволяло отслеживать гетерозиготы с вероятностью 0,985 и выше.
Интерпретация диплоидных генотипов зародышей и вегетативных тканей по ряду локусов (Adh-2, Lap-2, Mdh-3, Mdh-4, Sod-3, Sod-4) была затруднена из-за недостаточного разделения альтернативных вариантов по подвижности и наличия «нуль»-аллелей, поэтому в различных разделах данной работы использован неодинаковый набор локусов.
В случае смешанных сборов семян для расчета частот аллелей в популяции использовали генотипы зародышей, а для локусов с плохо интерпретируемыми диплоидными генотипами - гаплотипы эндоспермов семян.
Параметры внутрипопуляционной изменчивости и межпопуляционной дифференциации рассчитывались с использованием шести выборок P. cembra и 12 выборок P. koraiensis, в которых присутствовали генотипические данные по максимальному числу локусов. На основании многолокусных генотипов зародышей с помощью компьютерных программ BIOSYS-2 (Swofford, Selander, 1981), POPGENE (Yeh et al, 1998), GenAlEx V.6 (Peakall, Smouse, 2006), рассчитывали частоты аллелей и стандартные показатели генетической изменичвости, в т. ч. наблюдаемую и ожидаемую (в предположении равновесия Харди - Вайнберга) гетерозиготность, F-статистики (Wright, 1978), стандартные генетические дистанции Нея D (Nei, 1972). Для локусов, которые анализировались только в эндоспермах, доля межпопуляционной компоненты изменчивости оценивалась с помощью і т-статистики Нея (Nei, 1977). Кластеризацию по методу невзвешенных парногрупповых средних (UPGMA) и по методу ближайшего связывания (Neighbor Joining или NJ-метод) с оценкой бутстрэп-поддержки узлов ветвления проводили в модулях Seqboot, Gendist, Neighbor и Consense пакета программ PHYLIP v3.2 (Felsenstein, 1989), анализ дифференциации по методу многомерного шкалирования (MDS) - в программе STATISTICA (StatSoft, 1998).
Для анализа генетической структуры популяций на разных возрастных стадиях использовали четыре выборки сосны корейской (ЛА, ПХ, MX, СА). На основании наблюдаемых многолокусных генотипов зародышей от свободного опыления и материнских деревьев определяли соответствие наблюдаемого распределения генотипов теоретически ожидаемому из равновесия Харди -Вайнберга (х -тест), рассчитывали ожидаемую (ЯЕ) и наблюдаемую (Я0) гетерозиготности, индекс фиксации Райта (Wright, 1965), (FjS = [ЯЕ - #0]/#Е). Поскольку точность оценки уровня инбридинга Fis зависит от уровня изменчивости локуса, средний индекс фиксации рассчитывали по всем проанализированным в данной выборке локусам и отдельно по высокоизменчивым локусам, Fis(com). Высокоизменчивыми считались локусы, по которым частота альтернативного аллеля была не ниже 0,150 (где в предположении равновесия Харди - Вайнберга можно ожидать не менее трех особей в классе альтернативных гомозигот). Таким образом, FjS оптимизирован по числу локусов, aFis(com) - по численностям в распределении генотипов.
Динамика индивидуальной гетерозиготности в популяциях корейской сосны на разных стадиях жизненного цикла
У европейской кедровой сосны средние значения рассмотренных параметров генетической изменчивости находились в пределах, характерных для подрода, однако, ближе к нижней границе значений. В литературе приводятся различные оценки показателей генетического разнообразия для этого вида (табл. 10), однако по разным причинам сравнение с этими оценками наших данных затруднено. В ряде ранних работ выборки ограничены по численности особей и по числу изученных локусов (Гончаренко и др., 1991; Подогас и др., 1991а; Шурхал и др., 1991; Goncharenko et al, 1992; Shurkhal et al, 1992; Подогас, 1993). В других работах набор локусов существенно отличается от изученного нами (Пирко, 2000; Пірко, 2001). В ранней работе Шмидта (1982) профили частот аллелей ряда локусов (Got-1, Got-2, Adh-Ї) не соответствуют обнаруженным нами и другими авторами. В пяти популяциях из двух регионов севера Италии (южный предел обитания вида в Альпах), исследованных по 25 аллозимным локусам были обаружены довольно высокие уровни изменчивости (Л=2,5, #Е=0,281) (Belletti, Gullace, 1999).
Генетическое разнообразие одной популяции Р. сетЪга в высотном профиле из Австрийских Альп было изучено Р. Клумпом и М. Стефски (Klumpp, Stefsky, 2004). На основании данных об изменчивости двадцати двух аллозимных локусов авторы показали увеличение генного разнообразия среди взрослых деревьев и уменьшение разнообразия в выборках подроста с возрастанием высоты. В средневысотных выборках обнаружены высокие уровни аллельного и гаметического многолокусного разнообразия. Учитывая микроклиматические факторы, авторы заключили, что именно эта часть популяции вносит максимальный вклад в репродукцию, поскольку распространение пыльцы и семян осуществляется преимущественно из средней высоты вверх и вниз по склону. Данный вывод имеет большое практическое значение для разработки программ восстановления ресурсов этого вида, находящегося под угрозой вымирания по всему ареалу.
У кедровых сосен, как и у большинства хвойных, смешанная система скрещивания, которая объединяет ауткроссинг с определенной долей самоопыления. В результате близкородственных скрещиваний и самоопыления у них формируется частично инбредное потомство. Известно, что инбридинг может иметь негативное влияние, как на жизнеспособность отдельных особей, так и на устойчивость популяции в целом (Алтухов, 1995,1998, 2003,2004).
Для корейской сосны известны оценки доли самоопыления на уровне 3 -6% по данным Д.В. Политова и К.В. Крутовского (Politov, Krutovskii, 1994; Kjutovskii et al, 1995), и 9 - 12% по данным B.B. Потенко и A.B. Беликова (Потенко, Беликов, 2002; Potenko, 2004).
На основании многолокусных генотипов зародышей и материнских деревьев мы оценили отклонения от равновесия Харди - Вайнберга и рассчитали показатели коэффициента инбридинга (индекс фиксации Райта) (Wright, 1965) в четырех выборках сосны корейской. В таблице 11 представлены эти показатели для зародышей. Достоверные отклонения от равновесия Харди - Вайнберга наблюдались во всех выборках: в ПХ - по 4 из 14 изменчивых локусов, в СА - по 1 из 13, в MX - по 2 из 14, в ЛА - по 2 из 13. Семь из девяти случаев достоверного отклонения связаны с дефицитом гетерозигот, о чем свидетельствуют положительные значения индекса фиксации Райта (Fis). При усреднении полокусных значений 7 проявляется тенденция к дефициту гетерозиготных генотипов в трех из четырех выборках. В выборке MX наблюдается состояние близкое к равновесию. При исключении локусов со слабой изменчивостью усредненные значения индекса фиксации FIS(com) в выборке ПХ и MX возросли, в СА уменьшились, а в ЛА почти не изменились. Таким образом, анализ наблюдаемых и ожидаемых распределений генотипов и отклонений от равновесия Харди - Вайнберга в выборках зародышей показал наличие дефицита гетерозигот в трех выборках и близкое к равновесному состояние в четвертой (MX).
В выборках материнских деревьев уровень средней ожидаемой гетерозиготности оказался довольно высоким от 0,186 до 0,224, однако уровень наблюдаемой гетрозиготности был выше, от 0,207 до 0,278 (табл. 12). В целом только два из пяти наблюдаемых случаев отклонений от равновесия Харди -Вайнберга были обусловлены эксцессом гетерозигот. Тем не менее, в среднем ни в одной из выборок не наблюдалось положительного значения /. При исключении слабополиморфных локусов избыток гетерозигот стал более выраженным во всех выборках, кроме выборки MX. Во всех выборках материнских деревьев значения индекса фиксации были ниже, чем среди зародышей их семян (рис. 27).
Возрастание гетерозиготности с возрастом довольно часто наблюдается в популяциях хвойных (Политов, 2004). У Pinus radiata отмечена высокая гетерозиготность у 20-летних деревьев, ниже у - пятилетних сеянцев и самая низкая у зародышей семян (Plessas, Strauss, 1986). У зародышей сосны обыкновенной обнаружен больший дефицит гетерозигот, чем у сеянцев в возрасте 1,5 лет из той же партии семян (Muona etal, 1987).
