Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Полиморфизм и резистентность к инсектицидам у насекомых (обзор литературы) 8
1.1. Полиморфизм популяций и адаптивная микроэволюция у насекомых 8
1.1.1. Адаптационный полиморфизм и экологическая пластичность видов 9
1.1.2. Пути видообразования, основанного на популяционном полиморфизме 11
1.1.3. Проблема развития резистентности к пестицидам у членистоногих 13
1.2. Методы изучения полиморфизма в популяциях членистоногих 18
1.2.1. Токсикологический метод 19
1.2.2. Фенетический метод 19
1.2.3 Аллозимный полиморфизм 21
1.3.4. Методы анализа ДНК-полиморфизма 22
1.3. Полиморфизм и популяционная структура колорадского жука 31
1.3.1. Формирование ареала колорадского жука 31
1.3.2. Структура популяций колорадского жука на территории России 33
Глава 2. Объекты и методы исследования 37
2.1. Характеристика объекта исследования 37
2.2. Описание исследованных регионов 41
2.3. Характеристика использованных инсектицидов 46
2.4. Проведение токсикологических экспериментов 46
2.5. Методы молекулярно-генетических исследований 47
2.5.1. Сбор, хранение и подготовка биоматериала 47
2.5.2. Выделение ДНК 47
2.5.3. Проведение ПЦР-амшшфикации ДНК 48
2.5.4. Рестрикционный анализ 48
2.5.5. Электрофоретическое фракционирование ДНК 49
2.5.6. Секвенирование ДНК 49
2.6. Методы анализа полиморфизма в популяции колорадского жука 49
2.6.1. Анализ полиморфизма по уровню чувствительности к инсектицидам 49
2.6.2. Анализ фенетического полиморфизма 50
2.6.3. Анализ полиморфизма локуса 980A>G гена ацетилхолинэстеразы (AChE) 54
2.6.4. Анализ полиморфизма фрагмента гена цитохромоксидазы I мтДНК 56 2.7. Компьютерный анализ и статистическая обработка результатов 57
Результаты и Обсуждение 59
Глава 3. Полиморфизм колорадского жука на Южном Урале 59
3 1. Полиморфизм колорадского жука по уровню чувствительности к инсектицидам 60
3.2. Фонетический полиморфизм 70
3.2.1. Определение оптимального объёма выборки колорадского жука 70
3.2.2. Изменение фенетической структуры популяции колорадского жука во времени 76
3.2.3. Изменение уровня разнообразия в локальных популяциях колорадского жука под влиянием инсектицидного пресса 81
3.2.4. Внутрипопуляционный полиморфизм колорадского жука на Южном Урале 83
3.2.5. Межпопуляционный полиморфизм колорадского жука на Южном Урале 97
3.3. Полиморфизм фрагмента гена цитохромоксидазы I (COI) мтДНК 108
3.4. Структура популяции колорадского жука на Южном Урале 114
3.4.1. Эпигенетический ландшафт популяции колорадского жука на Южном 118 Урале.
Заключение 123
Выводы 124
Список литературы
- Полиморфизм популяций и адаптивная микроэволюция у насекомых
- Методы изучения полиморфизма в популяциях членистоногих
- Проведение ПЦР-амшшфикации ДНК
- Полиморфизм колорадского жука по уровню чувствительности к инсектицидам
Введение к работе
Колорадский жук - вид с продолжающимися процессами видообразования, характеризуется значительным внутривидовым полиморфизмом и экологической пластичностью (Ушатинская, 3981; Фасулати, 2002). Это позволяет ему успешно адаптироваться, в том числе и к антропогенным воздействиям - у колорадского жука развилась резистентность к почти всем используемым на настоящий момент и применявшимся ранее инсектицидам, во все'м его ареале. Согласно современному взгляду на популяцию как на единицу эволюции и одновременно - единицу управления видами (Яблоков, 1987), очевидна необходимость изучения этого вида на популяциоииом уровне.
СР. Фасулати (1985, 1993) на территории Восточно-Европейской равнины выделил пять популяционных комплексов колорадского жука, а также смежный с ними западно-казахстанский и изолированный от основного ареала среднеазиатский комплексы. Граница между двумя восточно-европейскими комплексами популяций, возможно, проходит по территории Башкортостана (Вилкова, Фасулати, 2001; Вилкова с соавт., 2005).
Изменения структуры популяций колорадского жука, происходящие с высокой скоростью, обуславливают необходимость систематического анализа с использованием большого количества типов фенов. Разработанные в последние десятилетия молекулярно-биологические методы генетического анализа позволяют оценить степень внутривидового полиморфизма на уровне первичной структуры ДНК (Roderick, 1996; Loxdale, Lushai, 1998). Сочетание классических и современных методов должно дать наиболее адекватную оценку уровня полиморфизма и популяционной структуры вида.
Цель работы: выявление особенностей формирования популяционной структуры колорадского жука на Южном Урале.
5 Для достижения данной дели были поставлены следующие задачи:
Собрать биологический материал и создать банк ДНК колорадского жука для проведения популяционно-генетических исследований.
Провести анализ полиморфизма в локальных популяциях колорадского жука по уровню чувствительности к инсектицидам.
Оценить уровень полиморфизма в модельной локальной популяции с установленным высоким уровнем резистентности к фосфор органическим инсектицидам по наличию нуклеотидной мутации 980A>G гена ацетилхолинэстеразы (AChE).
Проанализировать фенетическую структуру популяции, оценить её динамику во времени и влияние инсектицидного пресса.
Провести анализ полиморфизма фрагмента гена цитохромоксидазы I (COI) мтДНК в локальных популяциях колорадского жука.
Оценить возможные эволюционные процессы в южноуральской популяции колорадского жука и факторы, влияющие на них.
Научная новизна. Впервые в России создан банк ДНК колорадского жука объёмом 1035 образцов. Впервые использованы методы ДНК-анализа для уточнения филогенетических отношений родов Leptinotarsa и Zygogramma. На основе анализа четырёх типов фенов рисунка покровов (22 вариации) впервые показана подразделённость структуры популяции колорадского жука на Южном Урале и установлено наличие популяционнои системы. Впервые проведено исследование частот аллелей 980A>G гена ЛС/гії в модельной локальной популяции (Уфимский р-н) с установленным высоким уровнем резистентности к фосфорорганическим инсектицидам.
Практическая значимость работы. Анализ структуры популяции колорадского жука является первым этапом на пути к научному обоснованию проведения мер по регулированию его численности. Выявление двух групп популяций, различающихся по уровню чувствительности к инсектицидам, должно послужить основой для дифференциации схем защиты растений. Полученные в работе результаты помогут скорректировать точность прогноза расселения
колорадского жука на территории России и скорость формирования устойчивых к инсектицидам популяций. Отработанные методы анализа полиморфизма колорадского жука могут послужить материалом в процессе учебно-полевых практик. на практических занятиях и при подготовке квалификационных работ в учебных заведениях.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на XII - м съезде Русского Энтомологического Общества (Санкт-Петербург, 2002), 6-ой Пущинской школе-коференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2002), международной научно-практической конференции "Экологические аспекты интенсификации сельскохозяйственного производства" (Пенза, 2002), И-й международной конференции "Разнообразие беспозвоночных животных на Севере" (Сыктывкар, 2003), Ш-м съезде ВОГиС (Москва, 2004) и иа 1Х-м Вероссийском популяционном семинаре "Особь и популяция - стратегии жизни" (Уфа, 2006).
Работа выполнялась в соответствии с планами НИР Института биохимии и генетики УНЦ РАН по темам «Генетико-биохимические механизмы адаптивности насекомых» (№ гос. регистрации 01.200. 2 05310) и «Закономерности адаптивных процессов в онтогенезе и популяциях насекомых» (№ гос. регистрации 0120. 0 500082). Работа выполнялась в рамках проекта, поддержанного грантом РФФИ «Генетическая структура. специфика формирования резистентности и микроэволюционные процессы в популяциях колорадского жука на территории РБ» (05-04-97916-р_агцдель_а).
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность всем, оказавшим помощь в сборе биологического материала, в особенности сотрудникам Всероссийского института защиты растений (ВИЗР, Санкт-Петербург, Пушкин) и доценту кафедры общей биологии и экологии Башкирского государственного аграрного университета, кандидату биологических наук Татьяне Львовне Леонтьевой. Автор благодарит сотрудника лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИБГ УНЦ РАН, кандидата биологичесішх наук, Андрея Хаиифовича Баймиева за проведение секвенирования фрагмента гена СОІ мтДНК колорадского жука. Считаю своим приятным долгом выразить благодарность ведущему научному сотруднику лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИБГ УНЦ РАН, кандидату
7 биологичесішх наук Юрию Михайловичу Никонорову за консультации в области молекулярной биологии и кандидату медицинских наук, старшему научному сотруднику лаборатории молекулярной генетики человека Ильдусу Альбертовичу Кутуеву рецензирование данной работы.
Полиморфизм популяций и адаптивная микроэволюция у насекомых
В основе современного эволюционного учения лежит представление о том, что элементарной единицей эволюционного процесса являются не отдельные особи, а популяции. В преобразовании популяций заключается первый шаг эволюционного процесса (Шварц, 1980). Если эти преобразования не являются гомеостатической реакцией, характерной для генофонда стабильных популяций, но носят необратимый характер, то мы имеем право говорить о микроэволгоциониых процессах.
Необратимость микроэволюционных преобразований, по мнению С.С. Шварца (1980), и представляет собой критерий самостоятельности эволюционной судьбы, т.е. критерий подвида. Предшествующие процессы, характеризующие гомеостатическую реакцию на изменения условий существования, а именно -ненаправленное изменение структуры популяции, сменяющееся направленным ее изменением, являются началом необратимых перестроек генетической структуры популяций в ходе внутривидовой дифференциации, и потому должны рассматриваться не менее детально, чем более крупные и эволюционно значимые этапы подвидо- и видообразования. Эти первые шаги эволюционного процесса носят характер формирования приспособлений к среде обитания, т.е. адаптациогенеза.
Генетический полиморфизм и различия в спектре и силе воздействия экологических факторов внутри популяций, особенно для видов в состоянии активного расселения, становятся основой для возникновения многообразных приспособлений, свойственных группам особей в рангах более мелких, чем популяция. Так возникает адаптационный полиморфизм, и уточнение причин появления и механизмов его реализации - необходимый компонент в эволюционной биографии вида.
Колорадский жук - один из 48-ми видов рода Leptinotarsa, обитающих в южной и центральной частях Северной Америки. Эволюция данного рода соответствует, с одной стороны, его расселению из центра возникновения (Панама) на Север и эволюции рисунка покровов - с другой (Ушатинская, 1981). Как в первом, так и во втором случае вид L decemlineata завершает эволюцию рода и, как эволюционно молодой вид, характризуется наибольшим полиморфизмом, биологической пластичностью и наибольшим адаптивным потенциалом по сравнению с остальными видами (Tower, 1906; Ушатинская, 1981; Фасулати, 2002).
Субаридные условия горных степей и полупустынь, в которых шло видообразование L. decemlineata, кормовые растения сем. Solanacea, содержащие гликоалкалоиды - всё это послужило формированию вида с широкими пределами норм реакции как на абиотические факторы среды, позволив колорадскому жуку адаптироваться к новым климатическим условиям, так и к биотическим (освоение новых кормовых растений - культурного картофеля, баклажан, томата и др. паслёновых) и антропогенным факторам (резистентность к инсектицидам, устойчивым и трансгенным сортам картофеля).
ЮЛ. Алтухов даёт положительный ответ на вопрос, вынесенный в название одной из глав своей монографии (Алтухов, 2003): "Можно ли прийти к идее эволюции, исследуя генетические процессы на популяциоыном уровне?" и иллюстрирует свой ответ примерами из области исследований популяций лососевых и голосеменных. Попробуем и мы дать ответ на его вопрос, рассмотрев примеры из области энтомологии
В качестве первого примера адаптационного полиморфизма у насекомых можно привести ставший уже классическим случай так называемого индустриального меланизма, описанного В. Кетлуэллом (Kettlewell, 1959). Редкая вначале меланистическая форма берёзовой пяденицы Biston hetularia стала интенсивно распространяться в промышленных задымлённых районах Англии (Бирмингем, Манчестер). Данная форма получила преимущество перед светлой формой в виде покровительственной окраски на закопчённых стволах деревьев, что приводило к избирательному истреблению бабочек птицами (Айала, Кайгер, 1988; Яблоков, Юсуфов, 2004).
Таким образом, адаптационный полиморфизм возникает и закрепляется в популяции при действии естественного отбора. При этом две или несколько генетически различных форм внутри популяции подвергаются отбору в разных экологических условиях в разной степени (Яблоков, Юсуфов, 2004). Еще один хорошо изученный пример - красные и чёрные формы двуточечной коровки Adalia bipunctata (Тимофеев-Ресовский, Свирежев, 1965). Красная форма лучше переносит холод во время зимовки, чёрная - интенсивнее размножаются летом. Поэтому разнонаправленное действие отбора, направленное на сохранение красных жуков зимой и чёрных осенью, приводит к существованию устойчивого адаптационного полиморфизма (Яблоков, Юсуфов, 2004).
Приведём ещё ряд примеров полиморфизма в популяциях насекомых, способствующего их экологической пластичности.
Lepiura dubia Scop. - у этого жука-дровосека на Урале и в средней полосе России наблюдается 100%-ая встречаемость морфы limbata, тогда как на Кавказе она встречается очень редко. В целом, на Кавказе преобладают мелаиистические морфы, которые не встречаются на Урале и в средней полосе (Плавильщиков, 1936). В данном случае адаптивность полиморфизма связана с покровительственной окраской. На Урале и в средней полосе этот вид связан с сосновыми лесами, па стадии личинки развиваясь в древесине больных и мёртвых сосен, реже кедров, елей и пихт (Плавильщиков, 1936), па чьей коре красноватая и бурая окраска морфы limbata делает имаго малозаметными, предохраняя их от склёвываиия птицами. На Кавказе же данный вид обитает в основном в пихтовых лесах; личинки развиваются в древесине пихты кавказской, имеющей пепельно-чёрную окраску коры. Меланистическая окраска самок делаег их незаметными на коре пихт при откладке яиц. Самцы же, большую часть жизни проводящие на цветах, имеют буровато-зелёную окраску (Новожёнов, 1979).
Близкий вид дровосека - L. sequensi Reitt, обитает в Сибири и на Дальнем Востоке (Плавильщиков, 1936), населяет хвойные и лиственные леса, личинка развивается в древесине сосен и елей. Особи этого вида в целом по окраске сходны с L. dubia из уральских популяций, однако с большой частотой у сибирского вида встречаются меланисты. Их процент в байкальских популяциях увеличивается, особенно он велик в горах, где насекомые более связаны с темно-хвойными породами (Новожёиов, 1979).
Методы изучения полиморфизма в популяциях членистоногих
Метод основан на анализе различий в уровне чувствительности колорадского жука к действию инсектицидов различного типа. В частности, отмечены различия в чувствительности колорадского жука к децису в Белорусии - ПР для южных популяций составил от 6.6 до 18.6 , для центральных -3 (Быховец, 2000). На общем фоне эффективного (90 - 97% смертности) действия пиретроидов в Нижегородской области отмечены две локальных популяции с 9.6х ПР для дециса и 4.7 для суми-альфа (Иванов, 2000); в Ростовской области в зависимости от района ПР колебался от 22.4 до 233.3 (Вошедский с соавт., 2000.). Как уже указывалось выше, токсикологический анализ популяций колорадского жука в Сербии показал наличие значительных различий по уровню резистентности. Приведём эти цифры ещё раз: в зависимости от популяции вредителя, резистентность к хлорпирифосу составила от 1х до 109х, к карбосульфану - от 1х до 53 х (Slankovic et al., 2004).
Отмечены различия в уровнях чувствительности колорадского жука из различных экологических популяций к микроорганизмам и биопрепаратам (Лиховидов с соавт., 1987); при этом отмечено возрастание чувствительности по мере продвижения с юга на север (Гулий с соавт., 1990).
Наиболее часто для изучения внутривидового полиморфизма в популяциях насекомых используется анализ фенов. Термины "фен" и "фенотип" ввёл В. Иогансен в 1909-м году, понимая под феном элементарный генетически обусловленный признак, а под фенотипом - совокупность всех внешних и внутренних структур и функций организма (Johannsen, 1909).
По А.В. Яблокову (1987), фенами называют "любые дискретные альтернативные вариации признаков и свойств особей, которые на всём имеющемся материале (обязательно многочисленном) далее неподразделимы без потери качества. Фены всегда отражают генетическую конституцию данной особи, а своей частотой - генетическую структуру популяции и других ... групп особей данного вида". Данного определения фена мы и будем придерживаться в своей работе.
Предметом фенетики является внутривидовая изменчивость, основанная на рассмотрении фенов; методы фенетики - выделение фенов и количественное изучение такой изменчивости в популяциях и географически различных частях ареала (Тимофеев-Ресовский, Яблоков, 1973). Иногда фенетику путают с феногенетикой, хотя задачи этих дисциплин достаточно далеки друг от друга. В связи с этим считаем необходимым отметить, что феногенетика изучает пути реализации наследственной информации в процессе индивидуального развития организма, тогда как фенетика - структуру и динамику популяций (Соколова, 1998).
При изучении популяций прежде всего стоит задача выделения тех или иных признаков, подлежащих исследованию, в нашем случае - фенов. Важно иметь наборы признаков, каждый из которых характеризует определённую структуру или функцию организма. Выбор объекта для фенетических исследований так же очень важен и должен соответствовать следующим характеристикам: высокая численность; широкий спектр изменчивости различных морфологических структур на внутри- и межпопуляциош-гом уровнях; сбор материала не должен наносить ущерба окружающей природе.
В качестве дискретно изменяющихся признаков - фенов - у колорадского жука можно выделить вариабельность рисунка частей тела имаго и личинок, жилкование крыльев, окраску яиц. Из всего этого разнообразия чаще всего используются фены рисунка частей тела имаго, в частности - фены темени, затылка, переднеспинки и элитр (Фасулати. 1985, 1986, 1993, 2002; Ерёмина, Денисова, 1987; Климец, 1988; Гриценко с соавт., 1998; Беиьковская с соавт., 2002, 2004; Зелеев, 2003 и др.).
Так. фены переднеспинки (пронотума) были использованы для анализа полиморфизма колорадского жука в Саратовской области (Ерёмина, Денисова, 1987). Авторами показаны различия в частотах определённых вариаций из разных выборок рассматриваемой территории, а также динамика фенов за ряд лет. Отмечены изменения неоднородности фенетической структуры в разные периоды
жизни популяций, а также в зависимости от климатических (температура и влажность) условий развития первой (весенней) и второй (летней) генераций.
На основе анализа частот встречаемости вариаций четырёх типов фенов рисунка (темя, затылок, пронотум, элитры) было показано, что большая часть территории Башкортостана была заселена из южного (степного) очага расселения (Беньковская с соавт., 2000).
В ряде работ приводятся данные о фенетических различиях между популяциями колорадского жука, обитающими на разных паслёновых культурах (Гриценко. Соломатин, 1990; Фасулати, 1994), сортах картофеля, в т.ч. трансгенных (Фасулати, 1987, 1994; Вилкова, 2000; Король, 2000). Отмечены изменения в частотах встречаемости фенов после химических обработок (Кохманюк, 1982; Ерёмина, Денисова, 1987; Беньковская, 2000, 2003; Фасулати, 2000; Король, 2000), что, возможно, объясняется селективным действием инсектицидов. Рядом исследователей отмечена динамика частот фенов в течение ряда лет наблюдений (Овчинникова с соавт.. 1984; Фасулати, 1986; Ерёмина, Денисова, 1987)
Проведение ПЦР-амшшфикации ДНК
Обработку ДНК ферментами рестрикции проводили в условиях (буферная система и температура), рекомендованных производителями (СибЭшим, Россия). Расщепление проводили под слоем вазелинового масла. К препаратам гидролизованной ДНК добавляли буфер; содержащий глицерин и маркерные красители, и разделяли их в полиакриламидкых гелях.
Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК осуществляли в буферной системе, содержащей 40 мМ трис-ацетата рН 7.6 и 1 мМ ЭДТА. В зависимости от целей эксперимента использовали 0.8-2% агарозный гель или же 5-8% ПААГ.
Расчётное количество акриламида и метилен-бис-акриламида растворяли в бидистиллированной воде, и дегазировали под вакуумом. Затем добавляли до 0.07%) персульфата аммония и 15-30 мкл TEMED. После полимеризации геля проводили преэлектрофорез в течение 20-30 мин при напряжении 1 В/см. Фракционирование препарата проводили в течении 2-4 часов при напряжении 2-5 В/см.
Электрофорез проводили в приборах горизонтального (агарозные гели) и вертикального (ПААГ) типа. В качестве маркёра длины использовали фрагменты ДНК фага Я, расщеплённой рестриктазой Pstl. После окончания электрофореза как агарозные, так и полиакриламидиые гели окрашивали в растворе бромистого этидия (0.5 мкг/мл) в течение 20 мин, после чего отмывали от несвязавшегося с ДНК красителя в дистиллированной воде в течение 10 мин. Результаты наблюдали в проходящем ультрафиолетовом свете длиной 312 нм (трансиллюмииатор ЇМ-36 фирмы "UV-Products", США).
Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили в автоматическом режиме на системе ABI PRISM 310 Genetic Analyser, Applied Biosystems при условиях, рекомендуемых производителями.
На первом этапе токсикологических работ нами проводилось определение уровня устойчивости колорадского жука к инсектицидам с использованием в качестве генетической характеристики локальной популяции диагностической концентрации (ДК) выбранных препаратов. Все препараты испытывались в 4 - 5 концентрациях (см. табл. 2.2), полученных по "логарифмической" схеме разведения. Рабочие концентрации инсектицидов подбирались после предварительных опытов.
В дальнейшем полученные величины ДК использовались для токсикологической характеристики изучаемых локальных популяций колорадского жука. Количество (в %) погибших и выживших особей в экспериментах с применением ДК препаратов принимали за основу для расчётов соотношений чувствительных и резистентных генотипов в локальных популяциях.
Для анализа фенетического полиморфизма использовались фены рисунка темени, 5 вариаций (Климец, 1988; Беньковская с соавт., 2004), затылка, 3 вариации (Беньковская с соавт., 2000, 2004), пронотума, 9 вариаций (Фасулати, 1985) и элитр, 5 вариаций (Климец, 1988; Беньковская с соавт., 2004).
Фены рисунка покровов имаго колорадского жука стали предметом пристального внимания и детального изучения еще с начала XX века (Tower, 1906). В достаточно большом количестве работ, посвященных изменчивости этого признака, все авторы делят фены на группы, соответствующие частям тела: ]) рисунок головы, 2) пронотума (переднеспинки), 3) элитр (надкрыльев), 4) брюшка и 5) ног. В наших исследованиях использованы первые три группы.
Фены рисунка головы делятся в свою очередь на две группы. Первая -рисуї-юк темени, т.е. срединное пятно, имеющее чаще всего сердцевидную форму (Tower, 1906). В работах отечественных исследователей описаны различные вариации этого рисунка (Климец, 1988; Ерёмина, Денисова, 1987). В целом вариации рисунка темени отражают различную степень мсланизации, и поэтому оправдано разделение их на несколько групп по этому признак} . Предложенное Е.П. Климец (1988) деление на 3 группы m - о - ш по наблюдениям, сделанным в нашей лаборатории, недостаточно, особенно это касается наибольшей интенсивности окраски: мы встречали вариации с еще большей интенсивностью (рис. 2.4. А), и предлагаем описывать их как вариации 3 и М (Беньковская с соавт., 2004).
Вторая группа фенов - рисунок, расположенный в затылочной части головы, состоящий из двух симметрично расположенных пятен, описанных ранее (Tower, 1906) как овальные пятна. По наблюдениям, сделанным в нашей лаборатории, интенсивность окраски этих пятен описывается тремя вариациями (Беньковская с соавт.. 2000, 2004): Subnormal (Sub, или -)- слабо окрашенные, четко разделяющиеся пятна; Normal (N) - пятна, интенсивно окрашенные, не сливающиеся друг с другом и не достигающие заднего края глаза; и Extremal (Ex, или + ) - интенсивно окрашенные пятна, сливающиеся друг с другом и доходящие до заднего края глаза (рис. 2.4. Б).
Полиморфизм колорадского жука по уровню чувствительности к инсектицидам
Нами в работе по анализу уровня чувствительности колорадского жука к инсектицидам использовались препараты из разных классов. Материал из большей части выборок проверялся по уровню чувствительности к карбофосу (малатиону) (фосфорорганический инсектицид, ФОН) и децису (синтетический пиретроид). На ряде выборок проверялось действие препаратов из новых классов - моспилан и актара (неоникотиноиды).
Инсектициды в установленных нами в предварительных опытах диагностических концентрациях (ДК) использовались для токсикологической оценки локальных популяций, выборки из которых были собраны в период с 2003 - 2005 гг. Диагностические концентрации составили; для дециса 0.01%, карбофоса 1.0%, моспилана и актары по 0.001% соответственно. Для сравнения приведём установленные в 1985 г. ДК (удвоенное значение СК95) циперметрина и декаметрина - 0.034% и 0.0092% соответственно (Амирханов с соавт., 1986). В 1992 г. для мониторинга резистентности колорадского жука ДК циперметрина составила 0.038%, для перметрина 0.17% (Амирханов, Поскряков, 1994).
Смертность жуков от ДК с поправкой на контроль показывает процент особей, еще чувствительных к данному инсектициду в исследуемой популяции. Выживают только устойчивые особи. Таким образом, ДК является своего рода генетической характеристикой анализируемой локальной популяции, позволяя различать чувствительные и резистентные к применяемому инсектициду генотипы колорадского жука.
Результаты токсикологических экспериментов представлены в таблице 3.1 и на рис. 3.1. и 3.3. Распределение по уровню чувствительности к инсектицидам в локальных популяциях показывает (рис, 3,1, А), что устойчивость к децису. который широко применялся в Башкортостане, является почти повсеместной. В отдельных локальных популяциях колорадского жука обнаружено более 80% чувствительных особей (локальные популяции Максим Горький, кашкалашская, шарлыкская, ямакайская, старосубхангуловская, венецкая, октябрьская, старокалмашевская), в то время как в других их менее 10% (бузовьязовская, русскоюрмашская). В среднем по всем рассмотренным выборкам - около 62% особей на территории республики ещё остаётся чувствительными к децису. Устойчивость к фосфороргалическим соединениям (в данном случае - к модельному препарату карбофосу) распространена гораздо шире (рис. 3.1, Б) - чувствительных особей осталось менее 25%, с изменением данного показателя от 0% смертности (аскаровская, ключская, месягутовская, венецкая, юнновская, бузовьязовская, зиргановская, фомичевская и булгаковская локальные популяции, характеризующиеся максимальной резистентностью) до 93-94% смертности (мякашская и старокалмашевская локальные популяции, характеризующиеся сохранением чувствительности к воздействию данного препарата).
Обращает на себя внимание мозаичность распространения устойчивых популяций по территории республики. Подобное локальное появление устойчивых субпопуляций колорадского жука отмечалось также в Московской и Нижегородской областях (Яковлева с соавт,, 2000; Иванов, 2000). Оно может объясняться широким распространением монокультуры картофеля, уменьшающим миграции вредителя.
Для установления возможных молекулярно-генетических основ существующей резистентности к ФОИ мы провели ДНК-типирование образцов колорадского жука из локальной популяции Уфимского района Башкортостана. Данная популяция была выбрана как модельная, поскольку для неё установлен высокий уровень множественной резистентности не только к децису и карбофосу, но и к неоникотиноидам.
Известно, что один из основных механизмов резистентности насекомых к ФОИ - снижение чувствительности к действию инсектицидов у мутантноЙ формы ацетилхолинэстеразы (AChE) (Feyereisen, 1995; ffrench-Constant et al., 1998). На молекулярном уровне это обусловлено нуклеотидными и, как следствие, аминокислотными мутациями AChE, выявленными в резистентных генотипах. Так, в гене AChE резистентных линий плодовой мушки дрозофилы отмечено 5 нуклеотидных мутаций в 4-х позициях (Mutero et al., 1994), в гомологичном гене комнатной мухи - 4 мутации (Williamson et al., 1995).
Нечувствительность AChE колорадского жука к ФОИ связана с трашицией 980A G, приводящей к замене аминокислоты серии на глицин в положении 291 (Zhu, Clark, 1995; Zhu et al., 1996). Для выявления данной точковой миссенс-мутации в геноме колорадского жука нами использовался метод двунаправленной ПЦР-амплификации специфических аллелей (bi-PASA) (Williamson et al., 1996; Liu et al., 1997). Данный метод позволяет идентифицировать как чувствительные/резистентные гомозиготные аллели SS и RR, так и гетерозиготные SR (Clark et al., 2001).
Нами были проанализированы генотипы общей выборки (п=98) колорадского жука Дмитриевской локальной популяции Уфимского р-на Башкортостана. Из трёх возможных аллельных состояний (SS, RR и SR) фрагмента гена AChE нами были идентифицированы резистентные гомозиготы RR (частота встречаемости 0.7) и гетерозиготы SR (частота встречаемости 0.3) (рис. 3.2). RR - резистентные гомозоготные аллели (фрагмент длиной в 126 п.о.), SR - гетерозиготные аллели (фрагменты длиной в 206 и 126 п.о.). Фрагмент длиной в 293 п.о. - продукт неспецифической ПЦР с участием двух внешних праймеров.
Колорадский жук в данной модельной локальной популяции обладает максимальной резистентностью к карбофосу. Мы считаем, что долговременные обработки ФОИ на начальном этапе расселения колорадского жука по территории Башкортостана оказали селективное влияние на колорадского жука, элиминируя особей с чувствительными генотипами (гомозиготные чувствительные аллели дикого типа SS обнаружены не были).
Особую тревогу вызывает обнаружение локальных популяций колорадского жука, в которых обнаруживаются особи, устойчивые к новому препарату моспилану. Этот препарат начали применять только с 2003 г. Средняя гибель от диагностической концентрации (рис. 3.3.) составила всего 72.6%. Нами отмечены локальные популяции колорадского жука с уровнем смертности 60, 33.3 и даже 20% (булгаковская, юнновская и бузовъязовская локальные популяции соответственно). Устойчивость к актаре, которую начали применять одновременно с моспиланом, развивается значительно медленнее (смертность в среднем порядка 93%), но в одной из локальных популяций Уфимского района (булгаковской) даже этот препарат оказался малоэффективен - смертность при применении ДК всего 20%.
