Введение к работе
Актуальность japo6jeMbi:. Увеличение площадей сельскохозяйственных культур и преобладание в посевах, в основном, одних и тех же сортов способствуют широкому распространению болезней у растений, что приводит к недобору урожая и снижению качества продукции. В связи с этим проблема устойчивости. растений к. болеэнйм является : актуальной и приобретает экономический, медико-токсикологический и экологический аспекты (Балашова, 1981; Попкова, 1989; Marasos et al., 1992; Шевелуха, 1997).
Зерновые культуры вносят наибольший вклад в обеспечение населения земного шара : продуктами питания. Среди этих культур особое место отводится амфидиплоиду тритикале, который совмещает ценные качества родительских форм, и, в первую очередь, продуктивность пшеницы и экологическую устойчивость ржи.
Считалось, что тритикале обладает иммунитетом к большинству патогенов, Встречающихся в природе. Позднее, было показано, что эта. культура одинаково восприимчива к болезням, поражающим как пшеницу, так и рожь (Гужов, 1978; Dekens, 1987; Санин,. 1994). Распространению грибных болезней в значительной степени способствовало культивирование . сортов, созданных на узкой генетической основе, (действие этого фактора у тритикале усугубляется отсутствием естественных центров происхождения) Кроме того, сказались- как недостаточный учет степени устойчивости родительских форм при гибридизации, так и низкая пластичность многих сортов, наряду с высокой адаптивностью грибных патогенов к фунгицидам, генотипам растений и стрессовым абиотическим факторам. Однако, до сих пор болезни тритикале слабо изучены, особенно в генетическом плане.
Среди самых, распространенных и вредоносных болезней зерновых
культур, в том числе и тритикале, в Республике Молдова за.последние 15-20
лет отмечаются фузариоз, а в 1996-1997 гг. - бурая ржавчина и септориоз.
Возбудителями фузариоза являются грибы рода Fusarium Це. et Fr. Его
проявление самое разнообразное: гниение семян в почве при прорастании,
что влечет за собой иэреживание посевов, гниение прикорневой части стебля,
заражение. семян микотоксинами, пустоколосье, снижение технологических
качеств семян при хранении и элементов продуктивности растений
(Федорова, 1985; Новожилов, Левитин, 1990; Ittu et al., 1993). Наибольшей
вредоносностью в условиях Молдавии отличается гниение прикорневой части
стебля.' Бурую ржавчину вызывает гриб Puccini» recondite Eriks, септориоз -
Scptoria tritici Rob. et Desm. Эти патогены индуцируют появление
хлоротичных, затем некротичных пятен на листовой поверхности, что
приводит к снижению ассимиляционной способности листьев и, как
следствие, к снижению продуктивности растений (Дедяев, Трушелев,
Пащенко, 1994). '
Наиболее эффективной мерой борьбы с патогенами с экологической, практической и экономической точек зрения является создание генетически-резистентных; к болс-чяц. форм—В—тноиіемии-^наследуемости признака устойчивости разных іидов рЙтеТйМ'Ч^<фузариозу сведения в литературе . , ,. ,. иГ~:; .Г НАУЧНАЯ Б' ЩЛИбТЕКА 1
МОСЧ. С '. " ". "'"' -ДЄІ.1ИИ
противоречивы (Salgado, Schwartz, Впек, 1995; Singh, Ma, Ra, 1995 и др ). Из
всех форм проявления данной болезни у зерновых культур наиболее хорошо
изучен фузариоз колоса пшеницы Вместе с тем, сообщения по этому вопросу
неоднозначны в отношении количества генов (Gocho, 1985; Wu ct al, 1987;
Atanassov et al, 1993), коэффициентов наследуемости признака (Snijdcrs, 1990;
Saur, Trottet, 1992; Sing, Ma, Ra, 1995) и др признаков Отсутствуют данные о
генетическом контроле устойчивости зерновых культур к фузариозной гнили
прикорневой части стебля. Устойчивость растений к патогенам следует
рассматривать в системе их общей адаптивности (Жученко, 1980). Это
положение имеет решающее значение при создании источников
долговременной устойчивости (Балашова, 1981) Практически не исследовано
влияние абиотических факторов на экспрессию основных генетических
параметров устойчивости к фузариозу. Весьма противоречивы данные по
контролю устойчивости зерновых культур (в основном пшеницы) к бурой
ржавчине и септориозу (Ковалышина, 1988, Danon, Eyal, 1990; Kloppers,
Pretonus, 1992; Солодухина, 1994). В естественных условиях зерновые
культуры чаще всего поражаются не одним, а 2-3-мя и более количеством
патогенов Следовательно чрезвычайно важно создание
комплексноустойчивых форм (Шкаликов, Никандалсти, Усманова, 1992). Однако сведения о наследовании признака устойчивости к определенной болезни в смешанных инфекциях полностью отсутствуют. Слабо освещены в литературе аспекты механизмов действия патогенов Fusanum на зерновые культуры на разных уровнях биологической организации, особенно на молекулярном; отсутствуют и комплексные знания об иммунологических основах устойчивости к фузариозу у этих видов, и у тритикале в частности. Не отражен в литературе и генетический аспект контроля основных биотехнологических показателей зерновых' культур "in vitro" на среде с фузариотоксинами. Нет данных о существовании эффективных экзонндукторов резистентности природного характера Слабо отражена и прикладная сторона проблемы иммунологических основ устойчивости тритикале к фузариозу: отсутствуют новые, современные методы оценки чувствительности генотипов к патогенам Fusanum. а также эффективные, экологически безвредные способы повышения устойчивости культуры.
Для решения указанных проблем было проведено комплексное изучение действия фитопатогенов Flisanum и их метаболитов на биологические системы разного уровня организации тритикале. Это позволило раскрыть систему специфических реакций, составляющих основу фенотипического проявления фузариозоустойчнвости на уровне целостного растения Выявлены особенности наследуемости резистентности к фузариозу тритикале in vitro и in vivo Установлено новое поколение экологически безвредных химических иммунизаторов растений. Сформулированные положения и предложенные разработки, по нашему мнению, можно рассматривать как перспективное направление в иммуногенетике, что повысит эффективность защиты растений от болезней
Лель .я задачи..исследования: Целью настоящего исследования являлось выявление иммунологических основ устойчивости тритикале к фузариозу на разных уровнях биологической организации объекта, и разработка на их базе новых методов оценки устойчивости и способов ее повышения, а также создание источников и доноров комплексной устойчивости тритикале к фузариозу, бурой ржавчине и септориозу.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
- Оценить вредоносность фузариоза на естественном и искусственном
инфекционном фоне, бурой ржавчины и септориоза при естественном
заражении тритикале; определить влияние факторов среды на проявление
болезней. .
- Установить механизмы действия патогенов Fusarium и их метаболитов на
растения тритикале.
- Выявить особенности генетического контроля ряда биотехнологических
показателей тритикале в культуре незрелых зародышей "in vitnf на среде с
фузариевой кислотой.
- Определить особенности наследования устойчивости тритикале: а) к
фузариозу на фоне поражения бурой ржавчиной и септориоэом, б) к бурой
, ржавчине и септориозу. у разных по резистентности к фузариозу линий тритикале при разных условиях среды.
- Установить фенотипические корреляции между степенью поражає мости
фузариоэом, бурой ржавчиной и септориозом в смешанных инфекциях и
разработать способ идентификации комбинаций или генотипов с
комплексной устойчивостью.
Выявить эффективные экологически безвредные . экзоиндукторы устойчивости тритикале к фузариозу и некоторые механизмы их биорегуляторной активности в системе растение-патоген.
Научная_новизна__.результлтов. .исследований. Впервые проведено комплексное изучение действия фитопатогенов Fusarium и их метаболитов на важные структурно-функциональные параметры биологических систем разного уровня организации (ДНК, аминокислоты, ферменты, белки, клетки, органы репродуктивного аппарата, целостный организм, популяция) у тритикале. Сформулированы и. обоснованы научные положения, которые могут составить новое перспективное направление в изучении природы фузариозоустойчивости культурных растений.
Впервые с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе RAPD-профилей амплифииированных последовательностей ДНК, доказано, что гетерозиготное состояние форм тритикале (FI), в отличие от гомозиготного, обеспечивает стабильность полиморфизма ДНК при действии одного из основных токсинов патогенов Fusarium - фузариевой кислоты. При правильном подборе праймеров можно найти чувствительные к токсину локусы.
Установлено, что реакция растений тритикале на фузариоэ связана с особенностью функционирования полиморфных белковых систем. Синтез
пероксидаз при патогенезе может усиливаться или снижаться, что свидетельствует об их регуляторной роли в окислительно-восстановительном обмене в больном растении При этом уровень синтеза в большей степени имеет генотипическую зависимость, чем фуэариозоустойчивую. В отличие от пероксидаз, синтез водорастворимых белков в патогенезе детерминирован фснолшическим проявлением признака усиление синтеза пептидов со средней и высокой молекулярной массой характерно только для резистентных форм.
Выявлено, что биотехнологические показатели (каллусо-, стебле-, корнеобразование, биомасса эмбриогенного каллуса) в культуре незрелых зародышей тритикале генетически детерминированы, при этом важную роль имеет цитоплазматический фактор Определена положительная корреляция между частотой эмбриогенного каллусообразования на среде с фузариевой кислотой и устойчивостью растений на инфекционном фоне. В наследуемости признака "биомасса эмбриогенного каллуса" - одного иэ важных факторов для получения жизнеспособных регенерантов положительную роль играют аддитивные эффекты и гетерозигот-гстерозиготные взаимодействия как на оптимальной среде, так и на среде с фузариевой кислотой Коэффициенты наследуемости (в широком и узком смысле слова) данного признака в указанных условиях высокие.
Установление, что в смешанной инфекции- фузариоз, бурая ржавчина, септорноз, устойчивость к первым двум болезням наследуется по неполному или сверхдоминантному типу, а к третьей болезни - как тю доминантному, так и рецессивному типу В наследовании устойчивости к этим болезням с наибольшей частотой отмечаются аддитивные эффекты Кроме этого, для реакции резистентности к фузариозу большое значение по силе эффекта имеют гетерозигот-гетероэиготные взаимодействия, к бурой ржавчине -эффект доминирования, а к септориозу - разные типы взаимодействий. Устойчивость к фузариозу и септориозу находится, в основном, под олигогенным, а к бурой ржавчине - под олиго-полигенным контролем При неблагоприятных условиях среды возрастает число генетических факторов, вовлекаемых в защитные реакции Выявлены высокие коэффициенты наследуемости (в широком и узком смысле слова) резистентности к указанным болезням
Впервые показано, что генные действия и взаимодействия влияют самым прямым образом на кластерную организацию форм тритикале в смешанной грибной инфекции и определяют эвклидовы расстояния (генетические дистанции) между генотипами.
Впервые выявлены важные механизмы биорегуляторной активности представителей нового поколения иммунизаторов растений класса стероидных гликозндов в системе Triticale - Fusanum, заключающиеся в подавлении роста и развития грибов, повышении синтеза гидроксипролина и фотосинтетических пигментов, снижениа проницаемости клеточных мембран растений, использование которых в конечном итоге приводит к повышению устойчивости тритикале к фузариозу
Пракпгаескаіиначимость.работн
- Созданы питательные среды для выявления скрытой грибной инфекции
семян тритикале (Ах.№1513028, №1526220 СССР).
- Предложены для защитных мер стероидные гликозиды с фунгитоксической
: активностью по отношению к грибам Fusarium (Ах. №1584357, №1584358
СССР, А.С. №643, №644, №1174, №1204 МД). .
- Разработаны способы предпосевной обработки семян тритикале и пшеницы
для повышения устойчивости к фузариозу (Ах. №1630017, №1755416 СССР, Патент №2069940 Рос.Фед.).
- Разработан экспресс-метод оценки устойчивости тритикале к фузариозу на
* основе молекулярных маркеров (А.с. №1261 МД).
- Разработан экспресс-метод оценки фузариозоустойчивости тритикале,
пшеницы и ржи в культуре "in vitro" (Приоритетная справка №98-02-47 от
8.12.98 МД). . . '
- Разработан экспресс-метод идентификации в культуре "in vitro" комбинаций
тритикале с генетическими эффектами действия и взаимодействия генов, повышающие устойчивость к фузариозу (Приоритетная справка №99-0043 от 27.1.1999 г.). ,
- Предложены методические рекомендации "Identificarea genotipurilor de grau
secara si triticale rezistentc la fuzarioza" (1995).
Создано 10 линий тритикале с комплексной устойчивостью к фузариозу, бурой ржавчине и септориозу, имеющие значительные положительные СКС и ОКС, а также с повышенной морозостойкостью и высокими элементами продуктивности.
Соавторство в создании сорта тритикале Инген 93, районированного в Республике Молдова в 1996 г. и сортов озимой твердой пшеницы Леукурум 14, являющейся родительским компонентом с хорошей совместимостью при создании первичных тритикале, и тритикале Инген 33, переданных на госсортоиспытание в Молдавии в 1998 и 1999 гг.
Основныслоложениялыносимые на защиту:
Определение степени поражаемости тритикале и вредоносности фузариоза, бурой ржавчины и . септориоза и ~ их взаимосвязь с абиотическими условиями. ''"'. -.,,
Механизмы действия патогенов Fusarium и их метаболитов на тритикале на разных уровнях биологической организации объекта.
Генетические аспекты контроля устойчивости тритикале к фузариозу (/а
vitro н in ии0),~бурой ржавчине и септориозу (в полевых условиях).
- Использование искусственного инфекционного фона для получения форм
тритикале, і сочетающих устойчивость : к фузариозу с высокой
продуктивностью.
- Применение химических иммунизаторов класса стероидных гликозидов в качестве индукторов устойчивости зерновых культур К фузариозу.
Апробация работы Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Экологическая генетика растений и животных" (Кишинев, 1987); III Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1989), Всесоюзной конференции "Экологическая генетика растений, животных и человека" (Кишинев, 1991); ХУІІІ и XXII Конгрессах Румыно-американской академии (Кишинев, 1993; Тырговиште, Румыния, 1997); Международной конференции "Молекулярно-генетичсские маркеры и селекция растений" (Киев, 1994); Международных симпозиумах "Btotehnologies now & tomorrow" (Бухарест, 1994, 1995, 1996); Национальной конференции "Probleme actuate ale geneticii, biotehnologiei si ameliorani" ("Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции" (Кишинев, 1994); ХУІІІ Национальном симпозиуме по генетике растений и животных (Тимишоара, 1994); ХУІІІ Международном конгрессе по зашите растений (Хага, Голландия, 1995); Симпозиуме EERO-USAID по экологической химии (Кишинев, 1995); I Национальном симпозиуме "Ingmena genetica si biotehnologu avansate" ("Генетическая инженерия и современные биотехнологии"), Кишинев, 1996), Конференции "Management ecologic si dczvoltarc durabila" ("Экологический менежмент u устойчивое развитие" (Кишинев, 1996), Международном конгрессе "Saponine Used in Food and Agnculture" (Нью-Йорк, 1996); УІІІ Международном конгрессе по бактериологии и микробиологии (Иерусалим, 1996); 1 Всемирном конгрессе по аллслопатии (Пуерто Реал, Испания, 1996); YIY Национальном симпозиуме по генетике растений и животных (Сучеава, Румыния, 1996); IY Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1997, 1999), YII съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (Горки, 1997); Международной конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998); Втором конгрессе Ботанического общества Республики Молдова "Biodiversitatea vegetala a Repubbcu in preajma milcniului ИГ (Растительное разнообразие республики на пороге 3-го тысячелетия", Кишинев, 1998); Научно-практической конференции "Зашита растений огт вредителей, болезней и сорняков в Республике Молдова* (Кишинев, 1998); XX Национальном симпозиуме по генетике растений и животных (Бухарест, 1998); IX Международном конгрессе- по химии пестицидов (Лондон, 1988); XXYI1 Международной выставке по изобретениям "New techniques and products" (Женева, 1999); Республиканской научной конференции "Оптимизация селекционного процесса на основе генетических методов" (Харьков, 1999); Международном симпозиуме "Saponins in Food Feedstuff's and Medicinal Plants" (Пулави, Польша 1999).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 69 работ, в том числе 1 монография, 1 методические рекомендации, 12 авторских свидетельств СССР, Российской Федерации и Республики Молдова
..9
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, их обсуждение, а также выводов, практических рекомендаций и приложений. Библиография включает 418 источников, в том числе 209 на русском языке. Работа изложена на 335 страницах компьютерного набора, содержит 114 таблиц и 24_ рисунка. Приложения на 24 страницах.
