Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гемоглобин человека: норма и аномальные формы (по литературным данным) 13 Гемоглобин человека (основные сведения) 13
Глобиновые гены и биосинтез гемоглобина человека (основные сведения) 18
Появление аномальных гемоглобинов 24
Мутации ДНК и типы аномальных гемоглобинов 27
Влияние аминокислотных замен на некоторые свойства аномальных гемоглобинов 30
Молекулярная диагностика аномальных гемоглобинов 32
ГЛАВА 2. Анализ фенотипичвских проявлений носительства аномальных гемоглобинов человека 44
Первичные фенотипические проявления молекулярного дефекта 44
Состояние компенсации дефекта в организме 49
Проявление стрессовых воздействий 56
Заключение 57
ГЛАВА 3. Генетическая гетерогенность аномальных гемоглобинов человека: полиморфизм гемоглобина и общий анализ явления нейтральности вариантов 59
Полиморфизм гемоглобина человека 60
Иерархия уровней нейтральности белковых вариантов (феноменологическое рассмотрение) 66
Общий анализ нейтральности вариантов гемоглобина 70
Заключение 76
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 77
Приготовление гемолизата 78
Электрофорез гемолизата.на ацетат-целлюлозной пленке 78
Количественная оценка состава гемолизата 79
Функциональные.исследования цельной крови 79
Определение нестабильности 80
Хроматографическое разделение гемолизата 81
Выделение глобина 81
Аналитическое разделение глобиновых цепей 82
Препаративное разделение глобиновых цепей 82
Ашноэтилирование цепей 83
ТриптическиЙ гидролиз 83
Пептидные карты 84
Извлечение пептидов из тонкого слоя 85
Полный кислотный гидролиз пептидов 86
Дансилироваяяе аминокислот и пептидов 87
Хроматографическое разделение ДНС-аминокислот 87
Полиамидная хроматография ДНС-аминокислот 88
Аминокислотный анализ 89
Количественный дансильный метод 89
Определение N-концевой аминокислоты пептида 94
Определение С-концевой аминокислоты пептида 94
Секвенирование пептидов методом дансил-Эдмана 95
Секвенирование пептидов ДАШТЦ-методом 96
Идентификация ДАБТГ-производных аминокислот 97
Секвенирование пептидов прямым методом Эдмана 98
Идентификация ФТГ-пронзводных аминокислот 99
Расщепление пептидов термолизином 99
ГЛАВА 5. Молекулярная диагностика аномальных гемоглобинов 101
Выбор системы методов молекулярной диагностики 101
Микропрепаративные тонкослойные пептидные карты 121
Комплекс микрометодов ручного секвенирования пептидов 129
Идентификация распространенных аномальных гемоглобинов 135
Идентификация редких аномальных гемоглобинов 142
Идентификация новых аномальных гемоглобинов 155
Заключение 164
ГЛАВА 6* Генетическая гетерогенность аномальных гемоглобинов: распространение й некоторые свойства вариантов; нейтральные и псевдо-нейтралъные варианты, звсшшонный аспект 168
Распространение аномальных гемоглобинов 168
Некоторые свойства аномальных гемоглобинов 172
Анализ нейтральности Hb D Punjab и Hb 0 Arab 182
Истинно нейтральные и псевдо-нейтральные белковые варианты 190
Эволюционный аспект 194
Заключение 196
ГЛАВА 7. Новый подход к структурной вдштифжацщ аномальных гемоглобшов 199
Заключение 210
Выводы 212
Литература 216
Приложения 246
- Влияние аминокислотных замен на некоторые свойства аномальных гемоглобинов
- Иерархия уровней нейтральности белковых вариантов (феноменологическое рассмотрение)
- Комплекс микрометодов ручного секвенирования пептидов
- Истинно нейтральные и псевдо-нейтральные белковые варианты
Введение к работе
Генетическая гетерогенность аномальных гемоглобинов обусловлена, как известно» существованием в популяциях вариантов глобиновых генов, дающих при их экспрессии глобины с отличающейся первичной структурой, чаще всего - содержащие единичную аминокислотную замену* Генетическая гетерогенность аномальных гемоглобинов человека является причиной группы наследственных заболеваний системы крови -структурных гемоглобинопатии* Установление характера и локализации аминокислотной замены в молекуле мутантного гемоглобина, т.е. его молекулярная диагностика, в каждом конкретном случае гемоглобинопатии позволяет ставить больному точный диагноз заболевания. Поэтому структурный анализ аномальных гемоглобинов - основная приклад^ ная задача в изучении генетической гетерогенности этого белка - важен и всегда актуален для практического здравоохранения.
Исследование генетической гетерогенности аномальных гемоглобин-нов в популяциях позволяет получить важные для медицинской генетики данные, необходимые для организации медицинской помощи больным гемоглобинопатиями в районах, эндемичных по этим заболеваниям* Такие исследования проводятся в соответствии с комплексной программой "Изучение распространенности и гетерогенности гемоглобинопатии", утвержденной Президиумом АМН СССР в 1975 году. Некоторые мутантные гемоглобины могут быть использованы в качестве удобных маркеров, помогающих исследовать перемещение и смешение популяций. Поэтому данные о генетической гетерогенности аномальных гемоглобинов, обнаруженных на территории СССР и ряда других стран, представляют интерес для популяционной генетики»
Изучение свойств мутантних гемоглобинов проливает свет на один из основных вопросов современной биохимии и химии белка - о
— О *ш
соотношении структуры белка и его функции и об изменении последней в результате небольших локальных нарушений уникальной структуры белка. Сопоставление структуры и свойств аномальных гемоглобинов с клинической картиной заболевания имеет фундаментальное значение для современной медицины и гематологии в частности, поскольку позволяет выявлять взаимосвязь между характером молекулярного дефекта, ответственного за возникновение наследственной патологии (на примере гемоглобинопатии J и особенностями клинического проявления заболева-* ния, вносит вклад в изучение патогенеза молекулярных болезней» Эта часть исследования генетической гетерогенности аномальных гемоглс— бинов человека проводилась в соответствии с Госпрограммой 0.69.07 по иммунологии и медицинской генетике.
Генетическая гетерогенность семейств мутантных белков вообще и гемоглобина в частности лежит в основе явления белкового полиморфизма, который, как всякий наследственный полиморфизм, может служить мерой генетической изменчивости популяции. В свою очередь изменчивость лежит в основе таких фундаментальных биологических процессов как адаптация и эволюция. В процессе эволюции белки должны с необходимостью проходить стадию полиморфизма, поэтому очевидна важность явления полиморфизма белков (и, следовательно, изучения их генетической гетерогенности) для разделов теоретической и молекулярной биологии, занимающихся проблемами молекулярной эволюции*
Цель исследования
Целью экспериментальных исследований явилась структурная идентификация аномальных гемоглобинов человека, выявленных на территории СССР и ряда других стран, а также разработка новых подходов к таким исследованиям. Идентификация аномальных гемоглобинов была положена в основу молекулярной диагностики структурных гемоглобинопа-
тий, выявленных у гематологических больных.
Целью теоретического исследования явился комплексный анализ генетической гетерогенности семейства аномальных гемоглобинов человека, основанный на современных данных генетики, гематологии, физиологии, белковой химии и молекулярной биологии, а также собственных экспериментальных результатах*
Задачи исследования:
Исследовать гемоглобинопатии неясной этиологии, выявленные на территории СССР и ряда других стран. Еровести идентификацию и изучить некоторые свойства аномальных гемоглобинов, обнаруженных у больных структурными гемоглобинопатиями и тем самым поставить точный молекулярный диагноз заболевания*
Получить данные о наличии и гетерогенности ыутантных гемоглобинов в ряде популяций СССР и некоторых других стран.
Разработать новый подход в структурной идентификации аномальных гемоглобинов человека, основанный на использовании отечест* венного оборудования и имеющий преимущества перед классической схемой определения первичной структуры мутантних гемоглобинов в основных характеристиках - экономичности, экспрессности и чувствительности.
Разработать новые и усовершенствовать и оптимизировать ряд известных методов, используемых в молекулярной диагностике аномальных гемоглобинов. Доказать применимость комплекса ручных ультра-микрочууствительных методов структурной пептидной химии в молекулярной диагностике аномальных гемоглобинов и с их помощью провести идентификацию ряда вариантов гемоглобина на микроуровне.
На основе полученных экспериментальных и литературных данных провести комплексный анализ гипотезы нейтральности вариантов гемоглобина человека. Оценить применимость концепций селекционизма и
нейтрализма для объяснения существующей картины полиморфизма гемоглобина человека*
Научная новизна
Проведена структурная идентификация около ста образцов аномальних гемоглобинов человека, обнаруженных у жителей СССР, а также Болгарии, Венгрии, Гвинеи,. Йемена, Кипра, Кубы, Даоса, Мали, Монголии и Сирии. Открыты аномальные гемоглобины ИЬ Дагестан с*60
Лиз—*»Глу, НЬ Можайск р92Гис—*Арг и ІЇЬ Никосия &Г2Лиз-*Глн. Идентифицированы редкие мутантные гемоглобины: НЬ Abraham Unco^j Hbflge-г\о^{} НЬ йиепоь fKr-es, HbXietrottj HfcM $а$МойлР Hi? Sttij и НЬТйСотя.
Доказано наличие распространенных на земном шаре аномальных гемоглобинов S, В, С и Ъ Pwnjftb в популяциях, населяющих СССР. Изучены некоторые свойства новых и редких мутантних гемоглобинов.
Разработаны и использованы в исследованиях методы микропрепаративного выделения глобинов после электрофоретичвского разделения гемолизатов или глобиновых цепей на пленке целдогель, позволяющие быстро и просто получать из одной стандартной пленки 10 - 40 нмоль чистой, обессоленной глобиновой цепи, а также метод количественного анализа аминокислот в форме их флуоресцирующих дансильных производных чувствительностью 0,01 нмоль.
Разработанные методы микропреяаративного выделения глобиновых цепей положены в основу развитого в работе нового подхода в молекулярной диагностике аномальных гемоглобинов» характеризующегося относительными простотой, экспрессыостыо и чувствительностью. Новый подход использован для идентификации ряда аномальных гемоглобинов .
Изучены возможности пептидных карт в тонком слое целлюлозы в качестве микропрепаративного метода выделения пептидов при структурной идентификации аномальных гемоглобинов. Известные ручные ме-
тоды изучения первичной структуры пептидов в ультрамикромасштабе адаптированы для целей молекулярной диагностики аномальных гемогло-бинов.
Комплексный анализ генетической гетерогенности аномальных гемоглобинов человека с использованием собственных экспериментальных результатов, а также данных генетики, гематологии, физиологии, белковой химии и молекулярной биологии свидетельствует об отсутствии нейтральности многих вариантов гемоглобина. Выдвинута гипотеза о возможной роли повышенной локальной конформационной подвижности белка в создании нейтральных белковых вариантов.
Сформулирована концепция генетической гетерогенности аномальных гемоглобинов человека, в основу которой положено введенное в работе понятие о псевдо-нейтральных белковых вариантах, численно преобладающих в семействе мутантних гемоглобинов. Такие варианты, в отличие от истинно нейтральных, могут подпадать под действие отбора при возможных изменениях средовых и генетических факторов. В компенсированном гетерозиготном состоянии псевдо-нейтральные варианты являются потенциальным источником появления у белка новых функций и адаптивно ценных форм»
Высказана и обоснована гипотеза, согласно которой эволюция белков протекает от стадии, удовлетворяющей концепции нейтральности белкового полиморфизма, к стадии, удовлетворяющей концепции се-лекционизма. Уровень полиморфизма гемоглобина человека соответствует стадии молекулярной эволюции, на которой находится этот белок, а требованиям адаптации популяций к текущим условиям окружающей среды.
Практическое значение
Основное значение проведенного исследования для отечественного здравоохранения состоит в воспроизведении и разработке на базе
_ 10 -
Всесоюзного гематологического научного центра совокупности методов структурной белковой химии, дозволяющей проводить работы по молекулярной диагностике аномальных гемоглобинов в нашей стране, а также в создании методических основ для постановки аналогичных работ в других исследовательских центрах страны.
Установление характера и локализации дефекта первичной структуры белка в каждом конкретном случае гемоглобинопатии является необходимым этапом постановки правильного диагноза, лечения и прогноза заболевания*
Данные по гетерогенности мутантних форм гемоглобина в различных регионах страны необходимы для организации практической медицинской помощи населению на местах (создание медико-генетических консультаций и диагностических лабораторий, подготовка медицинских кадров).
Новый экспериментальный подход, основанный на микропрепаратив-ном выделении глобинов после их электрофореза на целлогеле, делает молекулярную диагностику аномальных гемоглобинов более экономичной, доступной, требующей меньших временных затрат; этот подход может найти применение при идентификации различных аномальных гемоглобинов.
Система ультрамикрометодов белковой химии, развитая и адаптированная применительно к задачам определения первичной структуры аномальных гемоглобинов, может оказаться полезной при изучении молекулярных основ других наследственных болезней, вызванных наличием аномальных белков, при типировании различных мутантных белков, анализе белкового полиморфизма, решении других задач структурной белковой химии.
Тема и содержание диссертационной работы отвечают заданиям комплексной программы АШ СССР "Изучение распространенности и гетерогенности гемоглобинопатии", Госпрограмме по физико-химической би-
~ 11 -
ологки и биотехнологии, Госдрограмме 0.69.07 по иммунологии и медицинской генетике и Госпрограмме 0.69.05 "Лейкозы".
Внедрение в практику
Работы по структурной идентификации аномальных гемоглобинов человека внедрены в практику и проводятся во Всесоюзном гематологическом научном центре МЗ СССР.
Развитые в представленном исследовании методы молекулярной диагностики аномальных гемоглобинов, основанные на использовании отечественного оборудования, внедрены в практику работы гематологических центров Азербайджанской ССР (АзНЙИ гематологии и переливания крови, Республиканская станция переливания крови, г. Баку) и Узбекской ССР (УзНИИ гематологии и переливания крови, г. Ташкент).
В соответствии с Планами международного сотрудничества и в порядке оказания научно-технической помощи гематологическим службам Болгарии, Венгрии, Гвинеи, Йемена, Кипра и Монголии проведены работы по молекулярной диагностике аномальных гемоглобинов, обнаруженных в этих странах.
Фрагменты работы дважды - в 1982 и в 1984 годах были экспонированы на ВДНХ СССР, а в 1982 году удостоены Дипломов 2й и 3^ степени ВДШ СССР.
По материалам диссертации опубликовано более 50 печатных работ в отечественных и международных изданиях. Материалы диссертации доложены на 1 и 2 Всесоюзных съездах гематологов и трансфузиологов (Баку, 1979; Львов, 1985), Международном Конгрессе общества гематологов (Будапешт, 1982), 1 Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1983), 6 и 7 Всесоюзных симпозиумах по химии белков и пептидов (Рига, 1983; Таллин, 1987), 1 Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Киев, 1984), Всесоюзной посоле "Биолюминесценция и хемилюминесцентный анализ" (Красноярск, 1985),
6 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), 5 съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им, Н.И.Вавилова (Москва, 1987), 2 Международной конференции по методам разделения в биохимии (Кестхеи, 1988); 52, 53, 55, 56 и 59 научных сессиях ЦНИИГПК,
Развитая в диссертации концепция генетической гетерогенности аномальных гемоглобинов человека доложена и обсуждена на Московском городском семинаре по молекулярной биофизике, Московском городском семинаре по эволюционной биохимии, научных семинарах Института молекулярной генетики АН СССР и Института медицинской генетики АМН СССР.
На защиту выносятся:
Результаты экспериментальных исследований генетической гетерогенности аномальных гемоглобинов человека, выявленных на территории СССР и ряда других стран, позволившие открыть новые варианты гемоглобина, идентифицировать распространенные и редкие варианты,
Методические разработки, включающие создание нового экспериментального подхода к молекулярной диагностике аномальных гемоглобинов, новых методов исследования, модификации и адаптации известных методов с целью повышения эффективности структурной идентификации аномальных гемоглобинов.
Концепция генетической гетерогенности аномальных гемоглобинов человека, основанная на понятии псевдо-нейтральности белковых вариантов и иерархическом подходе к рассмотрению явления нейтральности белковых вариантов и их фенотишческих проявлений.
Влияние аминокислотных замен на некоторые свойства аномальных гемоглобинов
Точечные миссенс-мутации, являющиеся, как было отмечено, причиной появления большинства аномальных гемоглобинов, с равной вероятностью могут затрагивать различные участки экзонов глобиновых генов; мутациям, так сказать, "все равно", к каким последствиям для белка они могут привести. Однако в гемоглобине одна и та же аминокислотная замена, локализованная в разных участках полипептидной цепи, может вызвать совершенно различные изменения структурных и функциональных свойств молекулы. Так например, замена Глу- Лиз имеет место в ji-цепях гемоглобинов НЬ С рб(АЗ), НЬ SirLraj 7(А4), НЬ Е Saskatoon р22(В4), НЬ Е 26(В8), НЬ Agenogip90(F6), НЬ Вгї lsh Columbia 1G1(Q3) и НЬ 0 Arab &12KQH4), при этом только в двух случаях имеются данные, что такая замена привела к изменению функциональных свойств соответствующих гемоглобинов /36/. Сродство к 2 у НЬ Aoenogi оказалось ниже, чем в норме (остаток F6 расположен в окружении нескольких гем-контактных остатков, важных для функционирования молекулы и, в первую очередь, остатка проксимального гйстидина F8, см. рис. 1), и повышенным у НЬ BrttUK Columbia (остаток Q3 принимает участие в с(1-в1 и о -і -контактах между субъединицами в тетрамере). Кроме того, многое определяется химической природой самой заменяющей аминокислоты. Возвращаясь к приведенному выше ряду аномальных гемоглобинов, можно отметить, что за-мена Глу—Вал (вместо Глу— Лиз) для остатка б ведет к образованию НЬ S, способному при соответствующих условиях полимеризоваться внутри эритроцитов с изменением их формы и свойств. Такая же замена (Глу— Вал) в положении а 26 приводит к образованию слегка нестабильного НЬ Непгч Mondor, а замена Глу- Глн в положении ВІ2І - к образованию НЬ D Punjab со слегка повышенным сродством к 02 /36/.
Резюмируя оба примера, можно заключить, что физико-химические и функциональные свойства аномальных гемоглобинов (и, следовательно, их возможные фенотшшческие проявления) определяются в равной степени как локализацией, так и характером аминокислотной замены.
Большую помощь в анализе возможных последствий замены на молекулярном уровне оказывает знание пространственной структуры различных форм гемоглобина. Выяснены особенности изменения нативной структуры в процессе оксигенации - дезоксигенации и места присоединения к гемоглобину его основного лиганда - кислорода и таких аллостерических эффекторов, как COg, протоны и органические фосфаты /3-5, 9, 41/. Знание роли каждого аминокислотного остатка в пространственной организации молекулы позволяет предполагать, к каким последствиям может привести его замена на другой остаток. Такого рода анализ содержится в большинстве работ, посвященных описанию аномальных гемоглобинов и он во многих случаях позволяет достаточно хорошо ориентироваться в молекулярных причинах, вызывающих нарушение структуры и/или функции мутантного белка. И все же подход, основанный на приписывании аминокислотным остаткам детер минированной роли /42/ либо в создании уникальной третичной и четвертичной структуры тетрамера, либо в обеспечении оптимального (с точки зрения выполнения кислород-транспортных функций) обратимого взаимодействия гемоглобина с С , 2,3-ДФГ, протонами и СО2 (естественно, с учетом взаимосвязанности структуры и функции молекулы) является несколько упрощенным. Нативная белковая структура способна в высокой степени кооперативно реагировать на происходящие в ней локальные изменения, и единичная аминокислотная замена может повлечь за собой значительные конформационные изменения не только во всей аномальной субъединице, но даже вызвать структурные перестройки в нормальных субъединицах и тетрамере в целом /43, 44/.
Как уже было отмечено во введении, аномальные гемоглобины являются причиной группы наследственных заболеваний, называемых структурными гемоглобинопатиями и основу диагностики структурных гемоглобинопатии составляет молекулярная диагностика аномальных гемоглобинов. В задачи молекулярной диагностики входит обнаружение мутантного гемоглобина как наиболее вероятной причины гематологической и клинической аномалии и установление характера и локализации дефекта в молекуле гемоглобина. Обнаружение аномального гемоглобина при обследовании населения позволяет кроме того выявлять бессимптомное, недиагностируемое другими методами гетерозиготное состояние по этому аномальному гемоглобину. С другой стороны, известно, что относительно доброкачественное гетерозиготное состояние по многим аномальным гемоглобинам является неблагоприятным фоном, утяжеляющим течение инфекционных и хронических заболеваний (см. след. главу). Таким образом, обнаружение аномального гемоглобина у практически здоровых гетерозигот может вести за собой опре-днленные профилактические мероприятия, направленные на исключение критических, стрессовых ситуаций, при которых гетерозиготное НОСИ-тельство утяжеляет ответную реакцию организма.
Предположение о наличии у больного аномального гемоглобина основывается, как правило, на анализе клинической картины заболевания, гематологических показателей и морфологии эритроцитов, когда иные, более распространенные причины анемии бывают отвергнуты. Наиболее популярными лабораторными методами прямого экспериментального обнаружения аномального гемоглобина в настоящее время являются различные варианты электрофореза или изоэлектрического фокусирования - методы, основанные на изменении заряда молекулы мутантного белка
Иерархия уровней нейтральности белковых вариантов (феноменологическое рассмотрение)
Однако ограниченность (если не невозможность) использования этих критериев для практической оценки нейтральности белковых вариантов связана даже не столько со значительными количественными различиями требований двух критериев, сколько с трудностями обоснованного экспериментального определения величин s и Ne в популяциях человека. Относительные приспособленности (1-s) носителей мутантного белка могут быть оценены, исходя из частот встречаемости гетере— и гомозигот по этой аномалии в популяции, только при условии принятия ряда допущений /170/: равновесность частот аллелей представляющего интерес локуса, действие отбора только на половозрелые организмы. Здва ли эти допущения выполняются в реальных популяциях, и тем не менее даже такие оценки для членов семейства аномальных гемоглобинов в настоящее время могут быть сделаны только для наиболее распространенных вариантов - Hb S, НЬ Е и НЬ С. К упомянутым следует добавить трудности количественного учета вклада эффекта репродуктивной компенсации в дифференциальную плодовитость разных генотипов, а также констатировать, что социально-экономические и экологические условия существования популяций, заметно влияющие на приспособленность различных генотипов, в настоящее время могут подвергаться значительным изменениям даже за время жизни одного поколения.
Перечисленные ограничения и факторы затрудняют интерпретацию данных о приспособленностях носителей распространенных аномальных гемоглобинов, опубликованных в некоторых работах /32, 170, 185, 239, 240/, В качестве примера можно привести коэффициенты отбора, вычисленные для популяции, в которой наряду с НЬ А распространен НЬ Е: 6 0,05-0,1; S« -0»2 - -0,05 и SEf =Ю,2 - 0,3 /32/« Очевидно, что точность определения величин $ даже для весьма распространенного варианта на практике не позволяет воспользоваться приведенными выше критериями Кимуры и Ли для оценки степени его нейтральности при любых разумных допущениях величины эффективной численности популяции. Для остальных вариантов, вносящих вклад в полиморфизм семейства аномальных гемоглобинов, даже исходна оценки частот встречаемости различных генотипов в популяциях за редким исключением отсутствуют.
Из сказанного становятся ясными трудности, с которыми сталкивается популяционная генетика при практических попытках оценки степени нейтральности аномальных гемоглобинов в популяциях человека. Вероятно, этим объясняется то обстоятельство, что до настоящего времени соответствующих работ не опубликовано.
Нейтральность (или ее отсутствие), выражающаяся в практически одинаковой (или, соответственно, различной) приспособленности носителей мутантного белка и нормальных индивидуумов, как и другие, рассмотренные в главе 2 фенотипические проявления, является следствием реализации дефекта белка на молекулярном, клеточном, организменном и, наконец, популяционном уровнях. Вероятно, при отсутствии возможности оценить "итоговую" лопуляпионную нейтральность белкового варианта имеет смысл рассматривать нейтральность, обусловленную каждым из предшествующих уровней иерархии (как это фактически делается в некоторых работах, например в /179, ISO/). Тогда по аналогии с общим понятием нейтральности под молекулярной нейтральностью белкового варианта, например, следует понимать невозможность отличить мутантную форму белка от нормальной по ее эффективным структурным и функциональным характеристикам любыми методами анализа этих характеристик. (Для гемоглобина многие существенные структурно-функциональные характеристики, влияющие на его свойства, рассмотрены в первом разделе главы 1) Аналогичным обра J В соответствии с общепринятым везде далее в тексте нейтральность белкового варианта, проявляемая на популяционном уровне, называется, как и само явление, просто нейтральностью.можно определить более высокие уровни нейтральности - морфологическую и клиническую. На всех уровнях иерархии работают характерные для каждого из них механизмы гомеостаза (применительно к анализу аномальных гемоглобинов эти механизмы были рассмотрены в главе 2), которые дозволяют в известных пределах компенсировать проявление дефекта, сформировавшегося на предыдущих уровнях. Таким образом, каждый уровень иерархии располагает специфическими возможностями увеличения эффективной нейтральности белкового варианта. Как соотносятся между собой нейтральности разных уровней иерархии?
Если, например, вариант относительно нейтрален клинически, это, конечно, не гарантирует его относительной нейтральности на других уровнях иерархии, однако можно предположить, что, вообще говоря, чем более нейтральны белковые варианты на низших уровнях предлагаемой иерархии, тем больше вероятность сохранения нейтральности на высших уровнях, включая популяционный. С другой стороны, отсутствие клинической нейтральности варианта, т.е. наличие у его носителя клинической симптоматики, скорее всего, свидетель-сивует также и об отсутствии его нейтральности При всех этих феноменологических построениях следует иметь в виду, что нейтральность любого уровня иерархии для того или иного белкового варианта всегда рассматривается для конкретных популяций, существование которых определяется конкретными генетическими и средовыми факторами. Один и тот же белковый вариант, в принципе, может обеспечивать своим носителям разную степень нейтральности любого уровня в разных популяциях при разных условиях их существования.
Комплекс микрометодов ручного секвенирования пептидов
Проведенное исследование позволило заключить, что метод пептидных карт в тонком слое целлюлозы может быть использован в качестве микропрепаративного в работах во молекулярной диагностике аномальных гемоглобинов. Тем не менее, поскольку выделить с его помощью удается из одной пептидной карты в среднем порядка 1-1,5 нмоль пептида, этот микропрепаративный метод может быть применен лишь в сочетании с самыми чувствительными методами аминокислотного анализа, о которых шла речь в предыдущем разделе главы. Ультрамик-рочувствительнне методы секвенирования, сочетающиеся с препаративными возможностями пептидных карт в тонком слое будут рассмотрены в следующем разделе главы.
Наиболее чувствительные из известных в настоящее время методов ручного секвенирования - методы дансил-Эдмана и ДАЖГЦ-Эдмана (см главу 1) - в принципе позволяют работать с наиоиольными количествами пептидов, тем не менее для таких работ используют, как правило, порядка 10 нмоль вещества /124, 283, 234/. Необходимость секвенирования значительно меньших количеств усложняет исследование, т.к. идентификация аминокислот, отщепившихся на каждом шаге деградации, ведется на пределе чувствительности аналитических методов» Использовать такую технику для определения первичной структуры неизвестных 10 - 15-членных пептидов затруднительно.
Установление первичной структуры аномальных пептидов в молекулярной диагностике мутантних гемоглобинов имеет то важное преимущество, что, во-первых, первичная структура соответствующего нормального пептида всегда известна, а во-вторых, что этот нормальный пептид, выделенный сходным образом из пептидной карты нормального протеолизата, может быть секвенирован параллельно с аномальным. Как и во многих других случаях сопоставление результатов анализов на каждом шаге секвенирования позволяет выявить единичную аминокислотную замену даже на пределе чувствительности аналитических методов.
Существенный технический момент в ручном секвенировании ульт-рамикроколичеств пептидов - возможность проведения циклов Эдмана в минимальных объемах, что уменьшает степень загрязнения и потери вещества на циклах. Исходя из этих соображений нами была разработана специальная микроячейка емкостью около 100 мкл с минимальным мертвым объемом /285/, позволяющая вести стадии циклов Эдмана в объемах 20 - 30 мкл. Фотография микроячейки (1) представлена на рис, 19,
Для одновременного, параллельного секвенирования аномального и нормального пептидов нами использовалась микромодификация ячейки типа "паук" на 4 пробирки объемом около 1 мл каждая /285/. Эта ячейка также представлена на рис. 19 (2). Практика использования системы "паук" показала ее большое удобство именно в описываемых исследованиях: одновременно с аномальным и соответствующим нормальным пептидами целесообразно вести секвенирование какого-либо модельного пептида известной структуры (контроль за протеканием стадий циклов Эдмана) и "фона", элюированного из той же самой пептидной карты (контроль за уровнем примесей из адсорбента и вотирующих систем).
Прямые методы секвенирования (классический фенилизотиоцианат-ннй метод Эдмана и метод ДАЕЙТЦ-Эдмана, см главу 1 и соответствующие разделы главы 4) основаны на идентификации отщепившихся в циклах N-концевых производных аминокислот в форме их тиогидантоинов. Трудности этих методов связаны прежде всего с идентификацией тиогидантоинов серина и треонина, в значительной степени разрушающихся в процессе конверсии. Для метода ДНС-Эдмана, основанного на определении М-концевых аминокислот укороченных на циклах пептидов, идентификация ДНС-серина и ДНС-треонина трудностей не представляет. В то же время этот метод не позволяет отличать ДНС-про-изводные аспарагиновой и глутаминовой кислот от их амидов, т.к. в процессе кислотного гидролиза аспарагин и глутамин переходят в соответствующие кислоты. Поэтому прямые методы секвенирования ж метод ДНС-Эдмана взаимно дополняют друг друга и были использованы нами в зависимости от характера предполагаемой на основании предварительных данных аминокислотной замены.
Возможность проведения реакций карбамидирования пептидов и отщепления ФТК-аминокислот в микроячейках привела к сокращению временных параметров ручных циклов. Выбранные на основании модельных опытов и дальнейшего практического использования условия отражены в соответствующих разделах главы 4 и суммированы в табл. 6,
На основании проведенных исследований и проверки их результатов на модельных пептидах нам удалось собрать комплекс ручных методов сравнительного изучения первичной структуры средних по размерам пептидов, доступных в количествах порядка 1-2 нмоль, который, следовательно, может быть использован в сочетании с микропрепаративным методом тонкослойных пептидных карт. Комплекс адаптирован для проведения работ по молекулярной диагностике аномальных гемоглобинов человека, но применим также для идентификации других мутантних белков./275., 279, 2flS, 286/.
Истинно нейтральные и псевдо-нейтральные белковые варианты
Рассмотрение полиморфизма, характерного для гемоглобина человека, приводит к мысли, что следует различать истинно нейтральные и псевдо-нейтральные белковые варианты, понятие о которых введено на стр. 75. И те, и другие хорошо компенсируются организмом в гетерозиготном состоянии и поэтому на популяционном уровне могут выглядеть как одинаково нейтральные, удовлетворяющие теории Кимуры. Тем не менее, истинно нейтральные белковые варианты не должны подпадать под действие стабилизирующего отбора как в гетеро- так и в гомозиготном состоянии ни при каких возможных изменениях средовых факторов и генетического фона Только такие варианты - исходный материал для нейтральной эволюции. В семействе аномальных гемоглобинов человека претендентов на истинную (и даже эффективную /178/) нейтральность мало, если они вообще есть. Невидимому, наиболее близкими к ним являются Hb D Punjab, Hb G Philadelphia и некоторые варианты, отобранные в табл. 2. Возможно, этот небольшой список кандидатов можно увеличить еще на несколько вариантов, но более вероятно, что последующие исследования его, наоборот, уменьшат.
Псевдо-неЙтральные белковые варианты, составляющие значительное большинство в семействе аномальных гемоглобинов человека, напротив» могут подпадать под действие отбора в гетерозиготном состоянии при изменении средовых факторов и/или генетического фона, когда внутренние компенсаторные возможности организма будут исчерпаны, а также в гомозиготном состоянии. Поэтому у псевдо-нейтралъ-ных вариантов нет перспективы достигнуть высоких частот в больших популяциях с помощью случайного дрейфа, т.е. внести вклад в нейтральную молекулярную эволюцию.
Дискриминируют эти две группы нейтральных вариантов как факторы внешней среды, так и факторы внутренней среды организма, включая его генетическую конституцию. Внутренняя среда организма опосредует влияние внешней среды через свои механизмы гомеостаза и определяет, в каких пределах изменения условий белковый вариант будет оставаться нейтральным, не подверженным элиминации отбором. Можно предполагать, что чем выше уровень развития организма, чем совершеннее его гомеостатические механизмы, тем больше такой организм может допустить псевдо-нейтральных белковых вариантов и тем, следовательно» больше генетическое разнообразие вида, к которому принадлежит организм Может показаться, что псевдо-нейтралыше белковые варианты представляют собой только лишь потенциальный генетический груз» вредный для популяции. Это не так, В компенсированном, нейтрализованном состоянии могут существовать мутантные формы, которые, оставаясь потенциально вредными для организма в обычных условиях его жизни, могут оказаться полезными для жизни в других условиях. Если такие новые условия существования будут приняты организмом -например, псевдо-нейтральный вариант даст возможность организму занять новую экологическую нишу - то бывший псевдо-нейтралъный вариант вполне может стать ценным, обладающим селективным преимуществом перед прежним диким типом. Отбор быстро поменяет варианты местами.
Возможным подтверждением такой судьбы для псевдо-нейтрального варианта служит анализ причин приспособленности лам к жизни в условиях высокогорья. Кровь лам обладает повышенным сродством к кислороду по сравнению с кровью млекопитающих, живущих на равнине /352/. Это, конечно, имеет ясный адаптивный смысл, поскольку позволяет хорошо насыщать артериальную кровь кислородом в условиях его низкого содержания на высоте. Структурные и функциональные исследования гемоглобина ламы позволили Г.Брауницеру заключить, что повышение сродства к кислороду связано с уменьшением сродства гемоглобина ламы к 2,3-дифосфоглицврату (см главу 1), а это сродство, в свою очередь, уменьшено по причине нахождения в положении N2 -субъединиц гемоглобина ламы остатка аспарагина /353, 354/. 7 человека и ближайшего родственника ламы верблюда в этом положе-» нии находится гистидин, и он, как известно, входит в число аминокислот, формирующих центр связывания гемоглобина с 2,3-ДФГ. Таким образом, замена р2Гие- Асн, которая могла быть для предка ламы псевдо-нейтральной в условиях равнины (ведь она давала гемоглобин с повышенным сродством к кислороду), позволила ламе занять новую экологическую нишу и оказалась явно адаптивно ценной.
Предложенная интерпретация справедлива в случае, если существование и некоторое распространение псевдо-нейтрального варианта предшествовало заселению предками ламы высокогорья и сделало возможным это заселение Однако более вероятно, что освоение новой экологической ниши ламой проходило через обычные стадии аккомодации, акклиматизаций и адаптации /245/ с участием разных уровней организации и систем организма и закончилась "созданием" варианта гемоглобина с повышенным сродством к кислороду, который обеспечил ламе совершенную адаптацию. Ведь, скажем, шерпы, хорошо адаптированные к жизни в высокогорье, за много поколений существования на Тибете пока что не "создали" (или не успели создать?) вариант ге-Аоглобина, лучше обеспечивающий снабжение организма кислородом в условиях высотной гипоксии /355/, хотя, например, носители псевдонейтрального Hb Andrew Minneapolis І44Лиз- Асн с повышенным сродством к кислороду ("люди - ламы") обнаруживают определенные преимущества при пребывании на высоте /356/. Таким образом, псевдонейтраль ный вариант мог быть важной предпосылкой для заселения высокогорья, но была она использована или нет определяется механизмами освоения ниши в каждом конкретном случае, о которых можно только предполагать.
