Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Функциональная геномика инфекционных заболеваний 11
1.2. Биоинформатика, как инструмент формирования выборки генов из генома человека для изучения патологии 17
1.3. Генетическая подверженность туберкулезу и сальмонелл езу 22
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Характеристика-выборки здоровых доноров 40
2.2. Биоинформационные подходы для поиска и оценки фенотипической значимости выбранных SNPs 41
2.2.1. Поиск функционально значимых SNPs с помощью on-line программ и баз данных 42
2.2.2. Выбор потенциально функционально значимых SNPs с помощью программы Matlnspector 43
2.3. Молекулярно-генетические методы исследования 44
2.3.1. Выделение ДНК из мононуклеаров венозной крови 44
2.3.2. Определение полиморфизма генов IFNG, IFNGR2, МСР1, STAT1, TLR2 45
2.3.3.Условия культивирования мононуклеарных клеток венозной крови 48
2.3.4. Выделение РНК из мононуклеаров венозной крови и получение кДНК с помощью реакции обратной транскрипции.. 49
2.3.5. Условия постановки RT-PCR 50
2.4. Статистические методы 51
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Поиск функционально значимых SNPs с помощью биоинформационных ресурсов 53
3.2. Оценка уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции РНА, TDM, LPS, IFN-y, IL-4 и их комбинациями 59
3.3. Сравнение уровней генетической экспрессии в культурах клеток носителей различных генотипов по выбранным полиморфным вариантам генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1,
IFNGR2
Заключение 91
Выводы 96
Список литературы
- Биоинформатика, как инструмент формирования выборки генов из генома человека для изучения патологии
- Генетическая подверженность туберкулезу и сальмонелл езу
- Поиск функционально значимых SNPs с помощью on-line программ и баз данных
- Оценка уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции РНА, TDM, LPS, IFN-y, IL-4 и их комбинациями
Введение к работе
Одной из проблем современной медицины является изучение механизмов возникновения и персистировання внутриклеточных бактериальных инфекций, вызванных Mycobacterium tuberculosis и Salmonella enteritidis [Воробьев, 2001; Ottenhoff, 2002; Schnappinger, 2006]. Несмотря на многочисленные исследования в области генетики инфекционных заболеваний, многие аспекты функционирования генов, определяющих развитие защитных реакций при внедрении патогенна, остаются до конца не установленными [Lopez-Maderuelo, 2003; Alca'is, 2005].
К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о том, что, такие инфекционные заболевания, как туберкулез и сальмонеллез, с генетической точки зрения, являются полигенными [Hunter, 2000; Kaufmann, 2001; Qiao, 2003, Коненков, 2008]. Выявление спектра генов и их полиморфизмов, влияющих на риск развития туберкулеза и сальмонеллеза, заболеваний со схожими начальными этапами патогенеза, представляет особый интерес.
Имеющиеся па сегодняшний день данные о фенотипическом проявлении полиморфных вариантов генов носят противоречивый характер и не позволяют сделать однозначных выводов об их вкладе в развитие инфекционных заболеваний [Cooke, 2006; Malik, 2006]. Совместное использование молекулярно-генетических, эпидемиологических и биоинформационных подходов для оценки функциональной значимости полиморфных вариантов генов, позволяет обеспечить высокую воспроизводимость и точность полученных ассоциаций между генотипами и заболеванием.
В настоящее время существуют десятки биоинформационных ресурсов, которые позволяют проводить отбор генов-кандидатов и их полиморфных вариантов, влияющих на восприимчивость к инфекционным заболеваниям [Cartharius, 2003; Berezikov, 2005; Chorley, 2008]. Предполагаемый вклад однонуклеотидных полиморфных замен в изменение уровня экспрессии генов может быть оценен посредством использования специальных компьютерных программ: Matlnspector, MATRIX SEARCH, SignalScan и др. [GuhaThakurta, 2006].
Важную роль в изучении функционирования генов, несущих в своей структуре SNPs с предполагаемым фенотштическим эффектом, и их вклада в развитие инфекционных заболеваний, играет экспрессионное профилирование [Bussemaker, 2001; Lazarus, 2005]. К настоящему времени разработан ряд экспериментальных моделей, представляющих собой культуры клеток человека, которые позволяют получить информацию об экспрессии изучаемых генов и уточнить многие патофизиологические процессы in vitro, происходящие при введении в культуру клеток бактериальных агентов [Пичугина, 2003; Cliff, 2004].
Известно, что фенотипический эффект полиморфного варианта гена может зависеть от контекста, в котором он действуют, то есть от вида
стимулятора, вводимого в культуру клеток. В связи с этим представляет интерес изучение влияния компонентов клеточной стенки М. tuberculosis и S. enteritidis, иммуномодуляторов lFN-y и IL-4 и их комбинаций с микробными агентами на уровень экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток человека.
Таким образом, исследование экспрессии генов, несущих полиморфные варианты различных регуляторных молекул, которые обеспечивают начальные этапы развития иммунного ответа, таких как ген интерферона гамма (IFNG), ген субъединицы 2 рецептора интерферона гамма (IFNGR2), ген трансдуктора и активатора транскрипции (STAT1), ген Toll-like рецептора 2 (TLR2) и ген моноцитарного хемотаксического протеина (МСР1) в условиях воздействия бактериальных компонентов на клетки иммунной системы человека является перспективным.
Цель исследования:
Изучить функциональную вариабельность генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2, вовлеченных в формирование подверженности инфекционным заболеваниям.
Задачи исследования:
1. Сформировать на основе биоинформационных данных панель
потенциально функциональных однонуклеотидных полиморфизмов в
промоторной и интронной областях генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и
- JFNGR2.
Определить частоту однонуклеотидных полиморфизмов исследуемых генов у здоровых жителей г. Томска.
Оценить базальный и стимулированный различными факторами (неспецифический индуктор РНА, микробные продукты TDM и LPS, иммуномодуляторы IFN-y и IL-4) уровень экспрессии генов в краткосрочных культурах мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей.
Провести анализ связи уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 с их полиморфными вариантами.
Научная новизна:
Предложен алгоритм поиска функционально значимых полиморфизмов генов с помощью биоинформационных методов и последующего экспрессионного профилирования. Впервые изучена функциональная значимость полиморфизмов С-2508Т гена МСР1, Т-1488С гена IFNG, G/T гена TLR2, А-1831С гена STAT1, G-1704del гена IFNGR2, влияющих на развитие и течение инфекционных заболеваний (туберкулеза и сальмонеллеза). Впервые получены данные о распределении частот аллелей полиморфного варианта rs56000463: T>G в интронной области гена TLR2 в популяции европеоидов. Впервые установлено, что изученные варианты промоторных областей генов МСР1, IFNG и IFNGR2 являются функционально значимыми и влияют на уровень экспрессии генов.
Научно-практическая значимость:
Полученные данные об уровне экспрессии генов иммунного ответа в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей при стимуляции их индукторами микробного и немикробного происхождения дополняют фундаментальные сведения о генетической компоненте запуска и реализации защитных механизмов клеток иммунной системы при инфицировании их М. tuberculosis и S. entcritidis. Данные о функциональной значимости полиморфных вариантов промоторной области генов MCPl, IFNG и IFNGR2 могут служить основой для дальнейшего изучения их ассоциации с риском развития внутриклеточных инфекционных заболеваний. Основываясь на программе Matlnspector, представлен алгоритм поиска полиморфизмов генов, влияющих на генную экспрессию, который может быть использован в дизайне исследованпй, направленных на установление функционально- и патогенетически значимых вариантов генов.
Положения, выносимые на защиту:
Полиморфные варианты С-2508Т гена MCPl, Т-1488С гена IFNG, G-1704del гена IFNGR2, выбранные с помощью биоинформационной программы Matlnspector, являются функционально значимыми: уровень экспрессии генов по этим полиморфным вариантам существенно меняется в зависимости от генотипа.
У носителей одних и тех же генотипов по исследуемым полиморфизмам разные виды стимуляторов с неизменной концентрацией вызывали разные экспрессионные ответы в культурах клеток.
Гомозиготные генотипы -2508СС и -2508ТТ гена MCPl обладают протективной ролью в развитие туберкулеза и сальмонеллеза, так как ассоциированы с более высоким уровнем экспрессии гена по сравнению с гетерозиготами. Аллель -1488С гена IFNG играет протективную роль в развитии иммунита против М. tuberculosis, а аллель -1488Т развитии иммунного ответа при инфицировании S. enteritidis.
Апробация работы:
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2007), VIII научном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), на Ежегодной Европейской конференции по генетике человека (Барселона, 2008), семинаре по биоинформатике в ГОУ ВПО Сибирском государственном медицинском университете Росздрава (Томск, 2008), межлабораторных научных семинарах НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 2007, 2009), межлабораторном научном семинаре на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории (Томск, 2008).
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале списка ВАК, 1 статья в сборнике, 2 тезиса в материалах отечественных конференций, 1 - в зарубежных.
Структура и объем диссертации:
Биоинформатика, как инструмент формирования выборки генов из генома человека для изучения патологии
Геномика — раздел молекулярной генетики, который осуществляет анализ структуры и функций генома как интегрального функционального массива генов, их регуляторных элементов и других последовательностей. Геномика включает в область своих интересов множество модельных организмов, таких, как бактерии, дрожжи, нематода, дрозофила и мышь, геномы которых исследуются и сравниваются между собой для расшифровки структурных основ их функциональной организации. Сравнительный анализ структур геномов различных организмов, основанный на положении о том, что "в гомологии структур зашифрована аналогия функций", оказывается весьма плодотворным и помогает устанавливать функции генов человека [Свердлов, 2000].
Анализ генов не ограничивается только сравнением их структур. Для исследования функционирования генома используют целый комплекс методов: in (ex) vivo (на модельных животных), in vitro (анализ реакций клеточных культур), in situ (детекция какого-либо клеточного компонента), in silico (методы биоинформатики) и т.п. [Cartet, 1997]. Функциональное значение идентифицированной последовательности нуклеотидов с характерными особенностями, присущими гену, может быть проанализирована путем ее модификации in vitro, введения модифицированного варианта в клетки в культуре или в живые организмы и изучения эффекта вариации последовательности на свойства клеток или весь организм. Современная молекулярная генетика использует для этих целей нокаутированных животных, у которых направленно удаляется изучаемая последовательность нуклеотидов или блокируется ее функция [Fritsche, 2003; Nobenrauth, 1999; Hunter, 2000]. Например, на линиях мышей RAW-37 и RAW-21, отличающихся присутствием в геноме функционирующего или не функционирующего гена Nrampl, были исследованы различия в уровнях продукции NO [Fritsche, 2003]. Стимуляция IFN-y и LPS Nrampl - экспрессирующих макрофагальных клеток линии RAW-37 приводила к повышению цитоплазматического белкового продукта iNOS и увеличению его энзиматической активности, по сравнению с клеточной линией RAW-21. Параллельно отмечалось повышение экспрессии IFN-y-регулирующего фактора 1 (IRF1) и увеличение связывающей способности iNOS-промотора в клеточной линии RAW-37. iNOS катализирует формирование NO, который является центральной эффекторной молекулой антимикробной активности макрофагов. Повышение уровня продукции N0 может, в частности, лежать в основе защиты от инфицирования внутриклеточными патогенами посредством функционирования нормального гена Nrampl [Fritsche, 2003]. Кроме того, на нокаутных животных можно оценить вклад определенного цитокина в развитие того или иного инфекционного процесса. Например, роль IL-18 в резистентности к микобактериальной инфекции доказана в исследованиях на IL-18-дефицитных мышах зараженных М. tuberculosis или М. bovis, развивающейся в виде грануломатозной реакции [Sugawara, 1999; Takeda, 1998]. Исследования на IL-18-дефицитных мышах показали недостаточный ответ на IFN-y при внедрении в организм таких внутриклеточных агентов, как Leishmania major, Staphylococcus aureus [Wei, 1999].
В настоящее время довольно интенсивно используется полногеномное экспрессионное профилирование, направленное на исследование того, как изменяется уровень мРНК клеток хозяина в ответ на инфекцию [Jenner, 2005], и приводит ли инфицирование клеток хозяина специфическими патогенами к патоген-специфическим внутриклеточным ответам.
В культурах дендритных клеток, зараженных E.coli, вирусом гриппа и Candida ablicans было показано большое количество однонаправленных транскрипционных изменений [Huang, 2001]. При исследовании ответа мононуклеарных клеток на инфицирование грамположительными и грамотрицательными бактериальными патогеннами так же был идентифицирован набор генов, характеризующихся идентичными изменениями уровня экспрессии [Boldrick, 2002].
К таким генам относятся гены клеточных иммунорегуляторных сигнальных путей и гены провоспалительных цитокинов. При запуске программы активации макрофагов в ответ на внедрение патогена, происходит повышение экспрессии генов, кодирующих рецепторы, адгезионные молекулы и белки, вовлеченные в тканевое ремоделирование. Гены, кодирующие сигнальные трансдукторные молекулы и провоспалительные цитокины, также являются частью программы активации макрофагов.
Несколько лет тому назад ряд научно-исследовательских групп, используя технологию микрочипового анализа экспрессии генов, изучили ответ человеческого организма на инфекцию. Эти исследования были сфокусированы на вирусных и бактериальных патогенах. Идентифицирован ряд генов хозяина не вовлеченных в иммунный ответ против инфекции, но показывающих изменения уровня экспрессии при стимуляции патогенами [Diehn,2001].
Первая группа под руководством J. Ichikawa (2000) использовала чип, содержащий примерно 1500 клонов человеческих генов, представляющих собой уже известные гены, а также еще не охарактеризованные гены. Вторая группа ученных во главе с С. Belcher (2000) работали с чипом Affimetrix HU6800, который содержал олигонуклеотидные пробы примерно 6800 генов человека. Обе группы выделили только те гены, изменение уровня экспрессии которых превышало 2-х кратный порог для Pseudomonas aeruginosa [Ichikawa, 2000] и более чем 3-х кратный порог для Bordetella pertussis [Belcher, 2000]. При этом число перекрывающихся генов иммунного
Генетическая подверженность туберкулезу и сальмонелл езу
Материалом для исследования служила венозная кровь 14 здоровых жителей г. Томска русской национальности. Мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК) выделяли стандартно путем центрифугирования гепаринизированной венозной крови при 2000 оборотов/мин. в течение 30 минут. Клетки, собранные из интерфазы, помещали в культуральные сосуды со средой RPMI-1640 (в количестве 6 мл среды на 1 мл супернатанта), с 1% эмбриональной телячьей сывороткой и аминокислотами, необходимыми для культивирования. Для приготовления культуральной среды использовали 500 мл среды RPMI-1640, 50 мл 1% эмбриональной телячьей сыворотки, по 10 мл глутамина и аминокислот. Клетки инкубировали при 37С в течение 12-16 часов. По истечению этого срока в культуры добавляли стимуляторы фирмы-производителя Sigma: РНА (фитогемагглютинин, 10 мкг/мл), TDM (трехалозе 6,6 -димиколат компонент клеточной стенки М. tuberculosis, 100 нг/мл), LPS (липополисахарид, компонент клеточной стенки Salmonella enteritidis, 100 нг/мл), IFNg (100 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл), и их комбинации TDM+IL-4 (120 нг/мл), TDM+IFNg (200 нг/мл), LPS+IL-4 (120 нг/мл), LPS+IFNg (200 нг/мл). Концентрации индукторов подбирали на основании данных eBioscience, Inc. (Гі1е://1осаШо5іУР:/Методьі/клеточньіе%20культурьі.1і1іп). Для контроля использовали не стимулированные клетки. Экспериментально определенное оптимальное время экспозиции клеточных культур с индукторами составило 1 час для культуры с LPS, и 3 часа для всех остальных культур. Стандартизация биологического материала происходила на этапе измерения концентрации клеток. Измерение концентрации клеток в клеточной суспензии проводили с помощью гематологического анализатора «Micros 60» (АВХ Diagnostics).
Выделение суммарной мРНК проводили с использованием набора TRI-Reagent (Mrcgene). Для выделения РНК из 750 мкл венозной крови использовали 1,7 мл TRI-Reagent, а для выделения РНК из 5-6 мл клеточных культур использовали 1,8 мл TRI-Reagent. После гомогенизации с TRI-Reagent в смесь добавляли 200 мкл хлороформа и размешивали на вортексе в течение 15 секунд, отстаивали 2-10 минут и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 минут. Отбирали верхнюю фазу в новую пробирку и добавляли 400 мкл изопропилового спирта, центрифугировали при 12000 об/мин в течение 8 минут. Удаляли надосадок и добавляли этиловой спирт (1мл спирта на 1 мл TRI-Reagent). После центрифугирования, удаляли спирт и сушили РНК в течение 5-10 минут. РНК растворяли в 50 мкл ДЕПК-обработанной воде. До проведения эксперимента РНК хранили при -70С.
Визуализацию выделенных образцов РНК осуществляли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Пример электрофореграммы, полученных образцов, представлен на рис 4.
Концентрацию выделенной РНК определяли путем измерения оптической плотности на приборе Nanodrop. Стандартизацию концентрации мРНК (100 нг/мкл) проводили на этапе получения кДНК. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 40 мкл, с использованием 3 мкл смеси dNTP, 4 мкл 10Х-буфера, 1 мкл олиго-dT, 0,01 мкл обратной транскриптазы фирмы Medigen (Новосибирск) на один образец. Смесь доводили до 40 мкл деионизованной водой. Программа обратной транскрипции включала предварительную инкубацию смеси при 25С в течение 5 минут, с последующим увеличением температуры до 42С в течение 30 минут. Программу завершала финальная денатурация при 85С в течение 5 минут.
Для RT-PCR реакции использованы наборы праймеров и TagMan-зондов производства фирмы Sintol (Москва). Реакцию проводили на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO RAD, США). Реакционная смесь RT-PCR для каждого образца содержала 1,0 мкл смеси пары праймеров, 0,5 мкл зондов концентрацией 10 мкМ, 1,0 мкл смеси dNTP концентрацией 5 мМ, 2,5 мкл SA-буфера, 2,5 мкл MgCl2 (20 мкМ), 0,5 мкл Taq ДНК-полимеразы с концентрацией 5 ед/мкл и 1мкл кДНК (10 нг/мкл). Смесь раскапывали в специальных планшетах для полимеразнои цепной реакции, сверху наклеивали оптически проницаемую пленку. Учет результатов проводили через 50 циклов.
Для каждого исследуемого образца реакцию RT-PCR проводили в трех повторах одновременно. Кроме исследуемых генов, оценивали уровень экспрессии гена «домашнего хозяйства» GAPDH (gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) для последующего статистического анализа. Обязательным условием являлась постановка образцов изучаемого гена и внутреннего контроля в одном планшете - для достижения одного и того же уровня эффективности амплификации гена мишени и эндогенного контроля.
Частоты генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью теста % [Вейр, 1995]. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий %2 с поправкой Йейтса на непрерывность.
Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по Nei [Nei, 1987]. Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле: D=(hobs-hexp)/hexp, где hobs и hexp - ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно.
Для вычисления кратных различий в уровнях экспрессии гена-мишени между образцами, полученными из стимулированных и не стимулированных культур, использовали сравнительный AACt метод [руководство Applied Biosystems].
На первом этапе нормализации вычисляли уровни среднего и стандартного отклонения для каждого исследуемого образца, полученного в трех повторах. Затем уровень экспрессии специфических генов в стимулированных и нестимулированных культурах (контроль) нормализовали относительно экспрессии гена GAPDH по формуле:
На следующем этапе уровень экспрессии специфических генов в стимулированных клеточных культурах калибровали относительно соответствующих показателей из не стимулированных культур, по формуле: AAL T AUT стимулиров AUT не стимулиров На завершающем этапе вычисляли п-кратные различия между уровнем экспрессии мРНК специфического гена в стимулированных и не стимулированных культурах по формуле: -АДСт Статистическую обработку данных проводили с расчетом среднего арифметического значений n-кратных различий между уровнем экспрессии РНК специфического гена в стимулированных и не стимулированных культурах и ошибки среднего для каждой группы с использованием программы Statistica 6.0 for Windows (Statsoft, США). Статистическую значимость различий показателей уровня экспрессии между исследуемыми группами, сформированными по виду использованного стимулятора, определяли с использованием непараметрического критерия Вилкоксона.
Кроме того, были оценены уровни экспрессии генов IFNG, IFNGR2, МСР1, STAT1, TLR2 в зависимости от генотипа по полиморфным вариантам: Т-1488С, G-1704del, Т-2508С, А-1831С и rs56000463: T G соответственно. Оценку статистической значимости различий уровней экспрессии генов у носителей различных генотипов проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа.
Поиск функционально значимых SNPs с помощью on-line программ и баз данных
Таким образом, наиболее выраженное повышение экспрессии гена IFNG наблюдалось при стимуляции бактериальным продуктом LPS, индуктором иммунного ответа IL-4, РНА и комбинацией TDM+IL-4. По данным литературы [Пичугина, 2003], уровень экспрессии гена IFNG при стимуляции культур лимфоцитов РНА и PPD (purified protein derivative antigen, микобактериальный антиген) у здоровых людей выше по сравнению с экспрессией этого гена в не стимулированных клеточных культурах. В проведенном нами исследовании также отмечен повышенный уровень экспрессии гена IFNG в культурах стимулированных РНА и микобактериальным антигеном TDM относительно спонтанного уровня.
По данным литературы [Lang, 1998], в культуре не стимулированных мононуклеарных клеток экспрессия гена IFNG не обнаруживалась или детектировалась очень слабо. После стимуляции LPS уровень экспрессии гена IFNG повышался, но не существенно. Стимуляция РНА, напротив, приводила к индукции экспрессии гена IFNG. В нашем исследовании неспецифический индуктор РНА (2,30±1,45) повышал уровень экспрессии гена IFNG в меньшей степени, чем IL-4 (2,46±1,51) или комбинация TDM+IL-4 (2,35±1,80) (табл.4).
В исследовании стимулированных РНА культур мононуклеарных клеток крови четырех здоровых доноров показано, что уровень мРНК гена IFNG в течение первых трех часов инкубации повышается на 30% по сравнению с не стимулированной культурой [Fan, 1998]. Максимальная экспрессия отмечена на 8 час инкубации со стимулятором. В нашем случае, уровень экспрессии гена IFNG в течение первых трех часов инкубации с РНА повышался в 2,3 раза по сравнению с не стимулированной культурой (рис. 7).
В работе Воробьева А. А. (2001) показано активирующее воздействие антигенов сальмонеллы на продукцию IFN-y. В нашем исследовании также отмечено увеличение экспрессии гена IFNG в ответ на введение в клеточную культуру мононуклеарных клеток крови индуктора LPS (рис. 6).
Обнаружено повышение уровня экспрессии генов провосполительных цитокинов МСР1 и IFNG при введении в культуру клеток противовоспалительного цитокина IL-4 или его комбинаций с микробными продуктами TDM и LPS (табл. 4). Уровень экспрессии гена МСР1 повышался при стимуляции IL-4 или его сочетаниями с микробными антигенами (TDM, LPS) более чем в три раза по сравнению с контролем (рис. 5). А уровень экспрессии гена IFNG при культивировании клеток с IL-4 или TDM+IL-4 повышался в два раза (рис. 6). Известно, что IL-4 является плейотропным цитокином - модулятором активности макрофагов [Ohmori, 1994; Levings, 1999; Zhou, 1994]. Его рассматривают как цитокин противовоспалительного действия, супрессирующего генную экспрессию провосполительных цитокинов в ответ на стимуляцию LPS и IFN-y. Однако имеется ряд исследований, обнаруживших, что стимуляция IL-4 in vitro или in vivo ассоциирована с провосполительными ответами по I типу [Bell, 1999; Fort, 2001]. В некоторых случаях IL-4 может способствовать экспрессии генов провосполительных цитокинов.
Например, индукция человеческих моноцитов или мышиных макрофагов IL-4 показала повышение продукции таких цитокинов, как TNF-а и IL12p70 в ответ на дополнительную стимуляцию LPS [Kambayashi, 1996; D Andrea, 1995]. В работах J. Major и соавторов (2002) стимуляция IL-4 культуры перитонеальных макрофагов мыши в течение 6 часов сопровождалась двух- и четырехкратным увеличением LPS-индуцированной экспрессии некоторых цитокинов и хемокинов, включая TNF-a, ILla, MIP-2 (макрофагального воспалительного белка-2). Стимуляцию культуры клеток проводили комбинацией LPS+IL-4, либо индукцией LPS с предварительной 18-часовой инкубацией IL-4. Экспозиция одним LPS приводила к заметной экспрессии генов провоспалительных цитокинов, но, если клетки перед этим культивировали с IL-4 в течение 18 часов, отмечали значительное увеличение уровней экспрессии изучаемых генов. Эти данные свидетельствуют о том, что IL-4 способен к потенциальной LPS-индуцированной продукции провосполительных цитокинов.
Предложен механизм, который, возможно, обусловливает IL-4-опосредованную продукцию провосполительных цитокинов [Major, 2002]. В клетках стимулированных IL-4, количество белка TNF-a повышалось, а уровень мРНК не изменялся, то есть происходило усиление процессов трансляции мРНК. Уровень мРНК TNFa селективно повышался в клеточных культурах стимулированных и IL-4 и LPS, по сравнению с культурами индуцированными только LPS.
Если индукция экспрессии генов стимулятором IL-4 (или комбинацией LPS+IL-4) происходила в течение хотя бы двух часов, то уже наблюдалось регистрируемое повышение уровня экспрессии генов провоспалительных цитокинов (например, TNF-a). Наивысший уровень экспрессии провоспалительного гена TNF-a отмечен после 24-часовой экспозиции культуры клеток IL-4 или комбинацией LPS+IL-4 [Major, 2002]. В нашей работе проведен ряд предварительных экспериментов по определению оптимального времени экспозиции культур мононуклеарных клеток крови со стимуляторами. Выделение мРНК исследуемых генов проводилось после 30 минут, 1, 2, 3 и 6 часов стимуляции. Наиболее оптимальным временем экспозиции клеточных культур с индуктором IL-4 и его комбинациями с TDM и LPS оказалось 3 часа (см. гл. 2 Материал и методы).
Уровень экспрессии гена TLR2 повышался более чем в 1,5 раза при стимуляции клеточных культур микробными агентами LPS, TDM в комбинации с IL-4 или с IFN-y, но двухкратное изменение уровня экспрессии исследуемого гена отмечено только при использовании комбинации TDM+IL-4 (рис. 8).
По данным литературы [Means, 1999] показано активирующее действие компонента клеточной стенки М. tuberculosis LAM (микобактериальный гликолипидный липоарабиноманнан) на экспрессию молекул TLR2 на поверхности иммунокомпетентных клеток. В нашем исследовании уровень экспрессии гена TLR2 повышался при введении в культуру корд-фактора клеточной стенки М. tuberculosis TDM в комбинации с IL-4 в два раза или с IFN-y в 1,9 раза (рис. 8).
Оценка уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 при стимуляции РНА, TDM, LPS, IFN-y, IL-4 и их комбинациями
Задачи проведенного исследования включали в себя формирование, посредством биоинформационных методов панели потенциально функциональных однонуклеотидных полиморфных вариантов в промоторной и интронной областях генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1 и IFNGR2 и оценку влияние полиморфизмов на экспрессию исследуемых генов в культурах мононуклеарных клеток крови при стимуляции их индукторами микробного и не микробного происхождения у здоровых русских жителей г. Томска.
С помощью биоинформационной программы Matlnspector проведен анализ 26 полиморфизмов промоторной области генов МСР1, IFNG, STAT J, IFNGR2 и пяти SNPs интронной области гена TLR2, из которых для дальнейшего анализа выбрано только пять SNPs: rsl024611, rs2069705, rs4853455, rsl7880053 и rs56000463. Остальные 21 SNPs при оценке их предполагаемого фенотипического эффекта, не вызывали изменений в качестве и количестве ССФТ регуляторного региона каждого из исследуемых генов. Идентифиция потенциальных сайтов связывания для факторов транскрипции в промоторных областях генов МСР1, IFNG, STAT1, IFNGR2 и в интронной области гена TLR2 позволила значительно сократить пространство поиска кандидантных SNPs, то еть подойти к их выбору более целенаправленно.
Выявлено, что присутствие нуклеотида «С» в позиции Т-2508С гена МСР1 и в положении Т-1488С гена IFNG формирует сайты связывания для фактора транскрипции MyoD в гене МСР1 и для HNF1 в гене IFNG. С помощью базы данных IIGRRD (http://www.bionet.nsc.ru/TPvPvD) показана непосредственная роль этих сайтов связывания для факторов транскрипции MyoD и HNF1 в осуществлении процессов транскрипции генов иммунного ответа. Возможно, что именно эти сайты связывания являются необходимыми для обеспечения функциональности, рассмотренных участков, промоторных регионов этих генов. Анализ изменений уровня экспрессии генов МСР1, IFNG, TLR2, STAT1, IFNGR2 в культурах клеток стимулированных различными индукторами показал, что экспрессия исследуемых генов может быть, как индуцирована, так и супрессирована. Микробные продукты LPS и TDM, индукторы иммунного ответа IL-4 и IFN-y, неспецифический индуктор РНА, а также комбинации TDM+IFN-y, TDM+IL-4, LPS+IFN-y и LPS+IL-4 индуцировали экспрессию генов МСР1, IFNG и TLR2, и снижали уровень экспрессии генов STAT1HIFNGR2.
Одна и та же доза стимулятора оказывала разное воздействие на экспрессию разных генов. Сравнение профилей генной экспрессии в исследуемых группах, показало, что это характерно для всех используемых индукторов. Также выявлено, что уровень экспрессии различных генов варьировал в зависимости от вида используемого стимулятора, т.е. оказался стимул-специфическим.
Уровень экспрессии гена МСР1 увеличивался в два и более раза в клеточных культурах стимулированных всеми видами индукторов. Индуктор LPS оказывал значительное стимулирующее воздействие на экспрессию гена МСР1, так как из всех опробованных стимуляторов он увеличивал уровень экспрессии этого гена более чем в 4,9 раза. Возможно, активирующее действие LPS на ген МСР1, объясняется наличием ARE (adenosine-uridine-rich element) - элемента в пределах З -UTR мРНК, который играет значительную роль в осуществлении посттранскрипционных механизмов проведения сигнала LPS. LPS-сигнал стабилизировал мРНК, блокируя ее деградацию, что ведет к быстрому накоплению соответствующего белкового продукта.
Двух- и более кратное повышение экспрессии гена IFNG наблюдалось при стимуляции бактериальным продуктом LPS, индуктором иммунного ответа IL-4, РНА и комбинацией TDM+IL-4. Во всех остальных случаях уровень экспрессии этого гена не достигал порога регистрации значений. Обнаружено повышение уровня экспрессии провосполительных генов МСР1 и IFNG при введении в культуру клеток противовоспалительного цитокина IL-4 или его комбинаций с микробными продуктами TDM и LPS. Уровень экспрессии гена МСР1 повышался при стимуляции IL-4 или его сочетаниями с микробными антигенами (TDM, LPS) более чем в три раза по сравнению с контролем. А уровень экспрессии гена IFNG при культивировании клеток с IL-4 или TDM+IL-4 повышался в два раза относительно не стимулированной культуры. IL-4 известен как цитокин противовоспалительного действия, супрессирующий генную экспрессию провосполительных цитокинов. Однако имеется ряд исследований, обнаруживших, что стимуляция IL-4 in vitro или in vivo ассоциирована с провосполительными ответами по І типу. В нашем случае IL-4 способствовал экспрессии провосполительных генов МСР1 и IFNG.
Экспрессия гена TLR2 в культурах мононуклеарных клеток крови здоровых людей повышалась только при использовании комбинации TDM+IL-4. Стимуляция культур клеток индукторами микробного и не микробного происхождения приводила к снижению уровня экспрессии генов STAT1 и IFNGR2. Регистрируемое снижение экспрессии гена IFNGR2 наблюдалось при добавлении в культуры клеток не специфического индуктора РНА, микробного антигена LPS или LPS в сочетании с IFN-y и компонента микобактериальной стенки TDM в комбинации с IFN-y.
Анализ уровня экспрессии обладателей полиморфных вариантов генов MCPl, IFNG, TLR2, ST ATI и IFNGR2 в условиях стимуляции культур мононуклеарных клеток крови различными индукторами показал зависимость их от генотипа.
![Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири [Электронный ресурс]](/i/i/4282/196247.png "Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири [Электронный ресурс] Колоколова Ольга Валентиновна")
