Введение к работе
Актуальность темы. Считывание триплетов мРНК аппаратом белкового синтеза в соответствии с генетическим кодом - основополагающее свойство живой клетки, обеспечивающее ее стабильное функционирование. Как и другие матричные процессы, трансляция характеризуется некоторым уровнем неточного считывания, в результате которого может происходить переосмысление значащих триплетов, считывание стоп-кодонов как значащих, сдвиг рамки считывания. В соответствии с принципом поливариантности матричных процессов, способность к прочтению одного и того же триплета более чем одним способом является неотъемлемым свойством белок-синтезирующей системы клетки (Инге-Вечтомов, 1969).
Наиболее простой моделью для изучения генетического контроля точности трансляции является изучение супрессии понсенс-мутаций, приводящих к появлению преждевременного стоп-кодона в открытой рамке считывания. Такие изменения в точности трансляции могут быть обнаружены на фенотипическом уровне, так как считывание сгоп-кодонов как значащих восстанавливает синтез полноразмерного белка, прерванный нонсенс-мутацией. Увеличение или уменьшение эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей-сахаромицетов может быть вызвано факторами как генетической, так и эпигенетической природы. Большинство мутаций, влияющих на эффективность нонсенс-супрессии, изолированы в генах, кодирующих тРНК, рРНК, белки рибосомы, факторы элонгации и терминации трансляции (см. Valente a. Kinzy, 2003). Хорошо изученным примером эпигенетического фактора, приводящего к усилению нонсенс-супрессии, является дрожжевой прион [PSt] - продукт прионного превращения фактора терминации eRF3 (Sup35p) (Сох, 1965; Wickner et al, 1995).
Многие белки, прямо или косвенно участвующие в трансляции, являются фосфобелками, и их функциональная активность регулируется специфическими киназами и фосфатазами. Для некоторых из этих белков показано, что уровень их фосфорилированности оказывает влияние на процесс трансляции. Например, фосфорилирование а-субъединицы фактора инициации трансляции IF-2 киназой Gcn2p снижает эффективность инициации трансляции в ответ на некоторые стрессовые условия (Hinnebusch, 1993). Фосфорилирование белков Р0, Р1 и Р2, входящих в состав "стебля" рибосомы, оказывает влияние на трансляцию некоторых мРНК (Zambrano et al., 1997). Фосфорилирование белка Upf2p оказывает влияние на функционирование системы нонсенс-зависимой деградации мРНК (Wang et al., 2006). Таким образом, изменение уровня экспрессии определенных киназ и фосфатаз может влиять на работу аппарата трансляции.
Действительно, показано, что в генетический контроль трансляции у дрожжей вовлечены гомологичные фосфатазы Ppzlp и Ppqlp. Делеция гена
PPQ1 приводит к аллосупрессии, а сверхэкспрессия - к антисупрессии на фоне различных нонсенс-супрессорных факторов (Vincent et ah, 1994). Деления гена PPZ1 приводит к увеличению частоты считывания стоп-кодонов как значащих в 3-4 раза (de Nadal et а!., 2001). Роль фосфатазы PPZ1 в регуляции эффективности нонсенс-супрессии была также подтверждена в нашей лаборатории в ходе исследования антисупрессорного прионоподобного детерминанта [ISP+]. Было показано, что изменение уровня экспрессии гена PPZ1 (а также гена HALS, кодирующего негативную регуляторігую субъединицу Ppzlp) влияет на проявление детерминанта [ISP+] (Aksenova et al., 2007). Кроме того, было показано, что сверхэкспрессия и делеция генов HAL3 и PPZI влияют на эффективность нонсенс-супрессии и в [isp~] штаммах. Эти данные подтверждают участие белкового комплекса НаІЗ/Ppzlp в контроле считывания стоп-кодонов.
Однако механизмы влияния этой и других фосфатаз на считывание стоп-кодонов в настоящее время практически не изучены. В частности, неизвестны белки-мишени фосфатазной активности Ppzlp и Ppqlp, участвующие в трансляции.
В связи с этим целью исследования явилось изучение связи между фосфатазой Ppzlp и эффективностью нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В ходе работы решались следующие задачи: (1) изучение влияния фосфатазы Ppzlp на проявление нонсенс-супрессорных мутаций в генах sup35 и sup45; (2) изучение влияния фосфатазы Ppzlp и ее регуляторной субъединицы НаІЗр на проявление фактора [PSf]; (3) выяснение роли гомологичной фосфатазы Ppz2p в генетическом контроле считывания стоп-кодонов; (4) поиск белков-мишеней фосфатазы Ppzlp, опосредующих влияние этой фосфатазы на считывание стоп-кодонов.
Научная новизна исследования. Получены дополнительные данные, проливающие свет на механизмы влияния фосфатазы Ppzlp на эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей-сахаромицетов. Показана зависимость проявления некоторых нонсенс-супрессорных мутаций в генах sup35 и sup45, а также дрожжевого приона [РБҐ] от уровня экспрессии гена PPZ1. Также мы показали, что проявление фактора [PSt~\ зависит и от уровня экспрессии гена PPZ2, кодирующего фосфатазу Ppz2p. При этом влияние гена HAL3 на проявление фактора [РБҐ] обусловлено ингибированием фосфатазной активности как Ppzlp, так и Ppz2p. Получены данные, свидетельствующие о том, что дефосфорилирование фактора элонгации EFlBa (TefSp) фосфатазой Ppzlp играет минорную роль в проявлении антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1. В соответствии с этими данными высказана гипотеза о том, что влияние Ppzlp на эффективность нонсенс-супрессии опосредовано дефосфорилированием как минимум двух фосфобелков, участвующих в трансляции - EFlBa и какого-то другого белка, в настоящее время остающегося
неизвестным. В связи с этим были проверены предположения о возможной роли ряда фосфобелков, связанных с трансляцией, в проявлении антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1: (1) фактора терминации eRFl (Sup45p); (2) белков Upflp и Upf2p, участвующих в нонсенс-зависимой деградации мРНК; (3) белка Slalp; и (4) шаперонов Ssblp и Ssb2p. Показано, что эти белки не являются мишенами фосфатазной активности Ppzlp. Тем не менее, показано, что двойная делеция генов SSB1 и SSB2 блокирует аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии мутантной аллели ppzl-R451L, кодирующей каталитически неактивный белок Ppzlp. На основании этих данных высказано предположение о том, что фосфатаза Ppzlp может оказывать влияние на функционирование аппарата трансляции за счет взаимодействия с шаперонами Ssblp и Ssb2p, причем это взаимодействие на связано с фосфатазной активностью Ppzlp.
Практическая ценность. В настоящее время известно значительное количество наследственных заболеваний человека, обусловленных нарушениями в работе трансляционного аппарата клетки (синдром Уолкотта-Раллисона, лейкоэнцефалопатия, хроническая миелоидная лейкемия и др.) (см. Calkhoven et al., 2002). Кроме того, показано, что дерегуляция экспрессии факторов инициации трансляции играет важную роль в процессе онкотрансформации клетки (см. Stoneley a. Willis, 2003). Поэтому изучение механизмов регуляции точности трансляции может способствовать разработке методов лечения этих заболеваний, связанных с нарушениями трансляции.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ей Международной конференции молодых ученых (Одесса, Украина 2007), на конференции EuroPhosphatases 2007 (Авейро, Португалия 2007), на 12-ом Международном конгрессе по дрожжам (Киев, Украина 2008) и на конференции по трансляционному контролю (Колд Спринг Харбор, США 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы. Работа изложена на 152 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (210 наименований). Работа содержит 7 таблиц и 30 рисунков.
![Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4480/365685.png "Несовместимость фактора [PSI+] и мутаций в гене SUP45 дрожжей Saccharomyces cerevisiae Киктев Денис Александрович")
