Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные морфо-экологические и молекулярно-генетические особенности- популяций ряпушек Coregonus albula (L.) и С. sardinella Valenciennes 7
1.1. Морфо-экологические особенности ряпушек coregonus albula (l.) и с. sardinella valenciennes 7
1.1.1. Характерные морфологические особенности Coregonus albula и С. sardinella 7
1.1.2. Разнообразие экологических форм ряпушки как отражение ее видовой пластичности 8
1.1.3. Морфо-экологическая пластичность ряпушки в условиях искусственного и естественного расселения 15
1.2. Генетический полиморфизм и генетическая дифференциация популяций ряпушки европейского севера 16
1.2.1. Полиморфизм хромосомного набора у ряпушек 17
1.2.2. Полиморфизм аллозимов в популяциях ряпушки Европейского Севера 18
1.2.3. Полиморфизм нуклеотидных последовательностей ДНК в популяциях ряпушкиЕвропейского Севера 22
1.3. Проблемы систематики и филогеографии комплекса евразийских ряпушек с. Albula/c. Sardinella 25
1.3.1. Проблемы систематики комплекса ряпушек,
связанные с особенностями их морфологии 25
1.3.2. Молекулярно-генетический анализ в решении проблем систематики и филогеографии комплекса евразийских ряпушек 27
1.3.3. Возможные пути заселения ряпушкой водоемов
Европейского Севера России 30
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Популяции ряпушки, изученные в работе 32
2.2. Методы.морфологического анализа 32
2.3. Методы генетического анализа 34
2.3.1. Сбор и фиксация проб для генетического анализа 34
2.3.2. Анализ полиморфизма изолокусов креатинкиназы СК-А1,2* 35
2.3.3. Анализ полиморфизма митохондриальной ДНК (мтДНК) 38
2.4. Методы статистической обработки первичных данных 42
Глава 3. Особенности морфологии ряпушки из зоны предполагаемого контакта С. albula и С. sardinella 46
3.1. Морфологические особенности изученных популяций ряпушки европейского севера России 46
3.1.1. Анализ дифференцирующей способности признаков, используемых при сравнении популяций ряпушки 46
3.1.2. Анализ морфологических признаков изученных популяций ряпушки 54
3.2. Анализ морфологических признаков у ряпушек европы и сибири, относящихся к разным экологическим формам 56
Глава 4. Генетическая дифференциация популяций ряпушки Европейского Севера России 61
4.1. Полиморфизм изолокусов креатинкиназы ск-а 1,2* в исследованных популяциях ряпушки 61
4.2. Полиморфизм митохондриальной ДНК в популяциях ряпушки 62
4.2.1. Полиморфизм сайтов рестрикции ND-1 фрагмента митохондриальной ДНК в исследованных популяциях ряпушки 62
4.2.2. Полиморфизм нуклеотидной последовательности
участка мтДПК ряпушки внутри reHaND-І 74
Глава 5. Морфологические и молекулярно-генетические маркеры в решении проблем систематики комплекса евразийских ряпушек С. albula и С. sardinella 83
5.1. Анализ применимости морфологических признаков в качестве маркеров для дифференциации видов евразийской ряпушки 83
5.1.1. Особенности диагностических морфологических признаков у ряпушки популяций со спорным систематическим статусом 83
5.1.2. Диагностические возможности «видовых» признаков евразийских ряпушек 85
5.1.3. Дифференциация исследованных популяций по морфологическим признакам 87
5.2. Роль полиморфизма изолокусов креатинкииазы ск-а1.2* в тестировании видовой принадлежности ряпушек 87
5.2. Полиморфизм митохондриальной днк в решении проблем филогеографии и систематики ряпушки европейского севера 90
5.3.1. Анализ внутрипопуляционного разнообразия ряпушки исследованных водоемов 90
5.3.2. Межпопуляционное разнообразие ряпушки
из водоемов Европейского Севера 91
5.3.3. Межвидовая дифференциация сиговых рыб
Европейского Севера России по данным анализа
нуклеотидной последовательности участка ND-1 генамтДПК 94
Глава 6. Основные пути расселения ряпушек по территории Европейского Севера России 98
6.1. Роль событий последнего оледенения в,расселении сиговых рыб Евразии 98
6.2. Расселение ряпушки по территории европейского севера России 99
6.2.1. Данные ПЦР-ПДРФ анализа мтДНК в решении проблем филогеографии ряпушки Европейского Севера России 99
6.2.2. Основные потоки расселения, приледниковые рефугиумы
и их роль в формировании современной генетической структуры
популяций ряпушки Европейского Севера России 100
Заключение 107
Выводы 108
Благодарности 110
Список литературы
- Морфо-экологическая пластичность ряпушки в условиях искусственного и естественного расселения
- Сбор и фиксация проб для генетического анализа
- Анализ дифференцирующей способности признаков, используемых при сравнении популяций ряпушки
- Полиморфизм митохондриальной ДНК в популяциях ряпушки
Введение к работе
Развитие биохимических и молекулярно-генетических методов анализа в последние несколько десятилетий, позволило подняться исследованиям в области популяционной генетики на качественно новый уровень. На сегодняшний день изучена генетическая структура, а также микро- и макроэволюционные процессы в популяциях сотен видов. Исследование полиморфизма, характерного для разных популяций одного или нескольких видов, позволяет оценить степень родства, уточнить филогенетические отношения между ними (Алтухов, 2003).
Филогеография представляет собой то направление исследований, которое рассматривает эти данные не сами по себе, а учитывает при их интерпретации особенности расселения вида, различные демографические pi исторические события. В рамках такого подхода трактовка особенностей сложившейся на сегодняшний день внутри- и межпопуляционной дифференциации объединяет данные молекулярной и популяционной генетики, этологии, экологии, демографии, филогенетики, палеонтологии, геологии и исторической географии, касающиеся исследуемых популяций. Таким образом, находясь на пересечении макро- и микроэволюционных дисциплин, филогеография позволяет интегрировать набор данных для объяснения сложившейся популяционной структуры вида (Avise, 2000).
В настоящее время филогеографический подход применяется при исследовании самых разных групп позвоночных животных, в том числе и рыб. В северных водоемах одним из основных и наиболее ценных компонентов экосистем являются сиговые рыбы, к которым относятся и ряпушки (обзор: Решетников, 1980). Для большинства представителей семейства характерна исключительная морфо-экологическая пластичность, что вызывает трудности в разработке их филогении и систематики. В ряде случаев значительный размах внутривидовой изменчивости приводит к выделению многочисленных видов и внутривидовых форм (Kottelat, Freyhof, 2007), причем без достаточных на то оснований (Мина и др., 2006; Решетников, Лукин, 2006).
Применение молекулярно-генетических методов позволяет пролить свет на данные вопросы, поскольку в настоящее время уже получены надежные оценки для уровней внутривидовой и межвидовой изменчивости у близких к сиговым систематических групп рыб, например, для лососей (Алтухов и др., 1997; Алтухов, 2003). Однако, как показали исследования сиговых Северной Америки и Западной Европы, многие проблемы даже при таком подходе остаются нерешенными, и, кроме того, к ним прибавляются новые, поскольку в ряде случаев данные морфологического и молекулярно-генетического анализов не соответствуют друг другу. Применение же
филогеографического подхода позволяет объяснить возникшие трудности с учетом особенностей расселения этих групп во время оледенений Плейстоцена (Bernatchez, Dodson, 1994).
В настоящее время популяции ряпушки Западной Европы исследованы достаточно хорошо с применением различных молекулярно-генетических маркеров. Однако значительная часть ареала ряпушек находится на территории нашей страны, а популяции водоемов Европейского Севера России изучены значительно хуже. Имеются лишь данные по аллозимному полиморфизму отдельных популяций (Перелыгин, 19886; Сендек, 1998; Sendek, 2002; Sendek et al., 2008), в то время как полиморфизм митохондриальной ДІІК (мтДНК) до сих пор не анализировали. Вместе с тем, именно на Европейском Севере России, согласно распространенной точке зрения, в районе реки Печора, находится зона перекрывания ареалов ряпушек Coregomis albula и Coregonus sardinella, где возможна их гибридизация. Более того, не ясны особенности формирования популяций и пути послеледникового расселения ряпушек по европейской территории России, а эти данные необходимо учитывать при оценке степени уникальности популяций в ходе разработки мер по их поддержанию и восстановлению.
Европейская и сибирская ряпушки — важные объекты промысла. Крупные формы европейской ряпушки, такие как рипус и килец, обитающие, соответственно, в Ладожском и Онежском озерах, на протяжении ряда лет активно использовались для зарыбления других водоемов (Лопатышкина, 1957; Перелыгин, 19886). Вместе с тем, для успешной интродукции и развишя селекционных программ требуются данные об особенностях генофонда видов и отдельных популяций (Вавилов, 1987).
Что же касается рипуса и кильца, то даже их таксономический статус до сих пор остается предметом дискуссий. Эта же проблема актуальна и в отношении форм ряпушки с разным временем, а также местом нереста и нагула (Svardson, 1979, 1988; Schulz, Freyhof, 2003; Kottelat, Freyhof, 2007). Более того, с 70-х годов прошлого столетия активно обсуждается и вопрос о видовом статусе двух видов ряпушек — С. albula и С. sardinella, которых ряд авторов предлагает считать одним широко распространившимся видом евразийской ряпушки (Дрягин и др., 1969; Пирожников и др., 1975).
С этой точки зрения особый интерес представляют популяции Европейского Севера России, особенно те, которые обитают в районе реки Печора и на прилегающих территориях. Только тщательный анализ их генетических особенностей с учетом данных палеогеографических реконструкций может помочь в разрешении спорных
вопросов, касающихся таксономического статуса рыб конкретных популяций, даст новые аргументы в пользу объединения или, напротив, выделения видов и форм ряпушек в самостоятельные таксономические единицы.
Выявление закономерностей в расселении ряпушек по территории Европейского Севера России облегчит решение аналогичных задач для других представителей рода Coregonus, поскольку не только для ряпушек, но и для сига проблемы, связанные с таксономическим статусом, особенностями формирования популяций и взаимодействием разных филогенетических линий вида стоят очень остро (обзор: Махров, Болотов, 2006).
В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы стало изучение путей расселения и особенностей формирования современных популяций ряпушки на территории Европейского Севера России. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
изучить полиморфизм митохондриальной ДНК в популяциях ряпушек европейской территории России;
на основе данных молекулярно-генетического анализа оценить таксономический с гаї ус популяций ряпушки исследуемой территории;
с целью сопоставления оценок таксономического статуса, сделанных на основании молекулярно-генетического анализа, с имеющимися в литературе представлениями о статусе конкретных популяций, проанализировать собственные и литературные данные о морфологических особенностях разных форм ряпушек;
оценить степень участия ряпушки Сибири в формировании популяций ряпушки Европейского Севера России;
с использованием комплекса молекулярно-генетических характеристик установить возможные пути расселения ряпушек по территории Европейского Севера России с учетом палеогеографических реконструкций.
Морфо-экологическая пластичность ряпушки в условиях искусственного и естественного расселения
Высокая экологическая пластичность, короткий цикл размножения, быстрый темп роста и раннее половое созревание европейской ряпушки давно привлекли внимание рыбоводов. Первая пересадка ряпушек из озера Велье в Пестовское озеро (Новгородская область) была предпринята еще в 1872 году (Покровский, 1953). В XX веке ряпушку (как правило, крупные формы — рипуса, кильца) акклиматизировали в озерах Урала, Кавказа. Производилось заселение ряпушкой многочисленных озер Карелии и Кольского, полуострова (Покровский, 1953; Мельянцев, 1964; Смирнова, 1975; Горбунова и др., 1981; Куккарина, Мельянцев, 1981; Стерлигова-и др., 1987). В литературе обсуждается также вопрос о происхождении соловецкой ряпушки и вероятности ее искусственного вселения в озера Соловецкого архипелага (Захваткин, 1927; Мухомедияров, 1963; Кузищин и др., 1999; Дворянкин, 2005).
Как правило, вселение в новые водоемы приводило к резкому изменению морфо-экологических характеристик акклиматизантов (Лопатышкина, 1957; Ильмаст, 1990; Sandlund, 1992). Так, рипус, вселенный в уральские озера приобрел увеличенную переднюю часть тела, укороченный и более высокий хвост по сравнению с особями из донорной популяции (Лопатышкина, 1957). В большинстве случаев происходило значительное увеличение темпов роста, что при акклиматизации мелкой ряпушки обуславливало сближение ее морфологических параметров с параметрами, характерными для крупной формы (Беляева, 1967; Стерлигова, Ильмаст, 2005).
Кроме того, в прошлом столетии наблюдалось и естественное расселение ряпушки — из Белого озера она распространялась по системе верхневолжских водохранилищ — Рыбинскому, Горьковскому, Куйбышевскому, Саратовскому (Васильев, 1952; Кожевников, Галкин, 1957; Чикова, 1966; Коскова, 1977). Также как и в случае акклиматизантов, ряпушка из Рыбинского водохранилища имеет, как оказалось, более высокий темп роста по сравнению с ряпушкой из Белого озера (Васильев, 1952).
Анализ физико-химических и биологических характеристик озер, ряпушку из которых акклиматизировали в других водоемах, показал, что этому виду для успешного размножения необходимо наличие песчано-каменистых участков. Кроме того, ряпушкам требуется хорошее насыщение воды кислородом; рН воды должно быть выше 6, а кормовая база должна находиться в удовлетворительном состоянии.
Существенно также отсутствие сильного давления со стороны хищных рыб. В то же время размеры и глубина водоемов, прозрачность воды не являются лимитирующими факторами для ряпушки (Горбунова и др., 1981).
Таким образом, приведенные выше факты свидетельствуют о способности ряпушки легко вселяться и размножаться в новых водоемах при определенных экологических условиях, и это обстоятельство, видимо, играло важную роль в широком расселении вида после отступления ледников.
В работах по изучению генетического полиморфизма популяций ряпушки можно выделить- два основных направления. Первое направление связано с исследованием уровня внутри- и межпопуляционной дифференциации ряпушки с использованием самых разнообразных молекулярно-генетических маркеров. В рамках работ этого типа обсуждаются также вопросы происхождения и взаимоотношений симпатричных и аллопатричных популяций с разным временем нереста, темпом роста и др. Второе направление связано с поиском маркеров, позволяющих четко дифференцировать популяции, принадлежащие к разным видам ряпушек — европейской (С. alhuld) и сибирской (С. sardinella). Кроме того, применение молекулярно-генетического анализа позволяет решать проблемы филогеографии, т.е. истории расселения вида.
При изучении генетической дифференциации популяций ряпушек в разное время использовали самые разнообразные генетические методы: полиморфизм хромосомного набора (Svardson, 1945; Nygren et al., 1971; Jankun et al., 1991, 1995), полиморфизм белков (Ирискин, 1974; Vuorinen, Lankinen, 1978; Vuorinen et al., 1981; Vuorinen, 1984; Перелыгин, 1988a, 19886; Bodaly et al., 1991; Vuorinen, Luczinski, 1991; Perelygin, 1992; Beaumont et al., 1995; Сендек, 1998; Kohlmann, Luczynski, 1999; Scndek, 2002; Sendek et al., 2008; Гордеева и др., 2009), полиморфизм повторяющихся последовательностей ядерной ДНК (Kohlmann, Luczynski, 1999; Schulz et al., 2006), тотальной митохондриальной ДНК (мтДНК) (Bernatchez et al., 1991; Partti-Pellinen et al., 1992), a также различных ее фрагментов — генов, кодирующих субъединицы 1, 3 и 4 NADH-дегидрогеназного комплекса (ND-1 и ND-3/4 фрагменты) (Kohlmann, Luczynski, 1999; Politov et al., 2000; Brzuzan et al., 2002; Schulz et al., 2006), а также контрольный регион (D-loop) (Reist et al., 1998; Brzuzan, Ciesielski, 2002; Brzuzan et al., 2004).
Впервые кариотип ряпушки описан в работах (Svardson, 1945; Nygren et al., 1971; Jankun et al., 1991). Как и все представители семейства Coregonidae, ряпушка является по своему происхождению тетраплоидом. К настоящему времени исследован кариотип ряда популяций ряпушки из водоемов Европы. В большинстве изученных популяций хромосомный набор С. albula включает 80 хромосом (2п=80), число хромосомных плеч (NF) равно 96 (табл. 1):
В финском озере Сайма, однако, наряду с рыбами, несущими 80 хромосом, были обнаружены особи с набором равным 81 хромосоме (2n=81) (Jankun et al., 1995). Авторы считают, что полиморфизм подобного рода характерен и для остальных популяций ряпушки, а особи с 81 хромосомой не были обнаружены в предыдущих исследованиях лишь в связи с небольшим объемом выборок.
Интересно, что в популяциях сибирской ряпушки (С. sardinella) также встречаются рыбы как с 80, так и с 81 хромосомой. Однако у С. sardinella, в отличие от европейской ряпушки, иное число хромосомных плеч: у особей с диплоидным набором 2n=80 NF=98, а с 2n=81 NF=100 (Фролов, 2000; цит. по: Атлас..., 2003). Предполагается, что полиморфизм в числе хромосом у двух видов ряпушек связан с системой определения пола у рыб отряда Salmoniformes, представителями которого являются С. albula и С. sardinella (Фролов, 1986, 2000; цит. по: Атлас..., 2003; Jankun et al., 1995).
Сбор и фиксация проб для генетического анализа
Характеристика изолокусов. Креатинкиназа (синоним креатинфосфокиназа, СК, ЕС: 2.7.3.2.), составляет значительную долю общего водорастворимого белка в скелетных мышцах. Система изозимов СК у представителей отряда Salmoniformes, к которому относятся и ряпушки, контролируется как минимум тремя локусами. Два изолокуса (СК-А1,2 ) экспрессируются в мышцах, третий же (СК-3 ) обнаружен в тканях глаза и обладает наибольшим отрицательным зарядом (Алтухов и др., 1997 и ссылки в этой работе). Поскольку у ряпушек, как правило, анализируют изолокусы, представленные в мышечной ткани, ниже речь пойдет только о СК-А1,2 .
У европейской ряпушки продукты изолокусов СК-А1,2 в гомозиготном состоянии по преобладающим аллелям обоих структурных генов совпадают по своей электрофоретической подвижности (рис. 6). Электрофоретический фенотип таких гомозигот, вместе с тем, представлен на зимограммах двумя полосами активности. Медленно мигрирующая в электрическом поле фракция соответствует первичным продуктам преобладающих аллелей СК-А1,2 . Полоса с более высокой анодной подвижностью возникает в результате посттрансляционной модификации одной из субъединиц этого фермента (Vuorinen, 1984). Хотя молекулы креатинкиназы имеют димерную четвертичную структуру, тем не менее, гибридные полимеры не образуются ни между продуктами разных структурных генов, ни между аллельными вариантами одного гена (Перелыгин, 19886).
Предполагается, что для одного из дуплицированных локусов, СК-А1 , у европейской ряпушки изменчивость не характерна. Для локуса СК-Л2 описаны еще два аллельных варианта — с большей и меньшей по сравнению с аллелем 100 электрофоретической подвижностью. Первоначально эти аллельные варианты были описаны Перелыгиным, и в оригинальной работе их подвижности указаны как 120 и 80 соответственно (Перелыгин, 19886). В последующих работах (Bodaly et al., 1991; Sendek, 2002) на эти два аллеля ряпушек ссылались как на аллели 110 и 85, соответственно. Наиболее быстрый аллель С. sardinella (аллель 14() у Перелыгина (19886)) обозначали впоследствии как аллель 120 (Bodaly et al., 1991; Sendek, 2002). В настоящей работе относительные подвижности аллелей креатинкиназы даны по (Bodaly etal., 1991; Sendek, 2002).
В отличие отевропейской, у сибирской ряпушки преобладающие аллели СК-А1 и СК-А2 дивергировали между собой настолько, что их продукты легко можно различить с помощью электрофореза. При этом преобладающий! аллель локуса СК-А1 у сибирской ряпушки — 120, а локуса СК-А2 — 110. Помимо аллелей 110 и 120, в популяциях С. sardinella встречается также аллель 100, совпадающий по своей подвижности с продуктами преобладающих аллелей дуплицированных локусов CK-AJ.2 С. albula (Перелыгин, 19886; Sendek, 2002).
Наиболее частый фенотип ряпушки Сибири представлен гремя полосами активности, которые соответствуют гомодимерам, кодируемым аллелями генов СК-А2 и СК-Л1 , соответственно (рис. 6, фенотип 8). Зона активности фермента с максимальной анодной подвижностью также появляется в результате посттрансляционной модификации одной из субъединиц этого энзима (Перелыгин, 19886; Sendek, 2002).
Более редкий электрофоретический фенотип, встречающийся у сибирской ряпушки, образован четырьмя полосами, причем по сравнению с преобладающим фенотипом, соотношение активностей изозимов с относительными подвижностями ПО и 120 изменено в пользу первого (рис. 6, фенотип 7). С одной стороны, данный факт можно объяснить мономорфностыо гена СК-А2 и гетерозиготным состоянием гена СК-А1 (Перелыгин, 19886). Однако изучение полиморфизма популяций ряпушки из бассейна реки Печора, где предполагается наличие зоны гибридизации двух видов евразийских ряпушек, показало, что этот фенотип можно трактовать как двойную гетерозиготу СК-А1 110/ 120, СК-Л2 100/ 110 (Сендек, 1998; Sendek, 2002).
Кроме пяти вариантов электрофоретических фенотипов креатинкиназы, описанных первоначально в работе (Перелыгин, 19886), у ряпушки бассейна реки Печора выявлены еще три фенотипа (Сендек, 1998; Sendek, 2002). Один из фенотипов представлен на зимограмме в виде четырех полос, наиболее быстрые из которых появляются в результате поеттрансляционпых изменений отдельных субъединиц, а две другие приблизительно одинаковы по интенсивности окраски (рис. 6, фенотип 4). Этот фенотип уместно обозначать двойной гомозиготой по основному аллелю П0 локуса СК-А2 и более редкому аллелю 100 локуса СК-А1 .
С другой стороны, данный фенотип можно трактовать как двойную гетерозиготу по обоим изолокусам. На вероятность такого расщепления указывает присутствие двух фенотипов гибридной природы. Причем, как считает автор работы, фенотип СК-А1 100/ 110, СК-А2 110/ 110 обозначает сегрегацию в локусе СК-А1 по аллелю П0, что не характерно для типичной сибирской ряпушки и свидетельствует о возможной гибридизации между С. albula и С. sardinella в первом поколении (рис. 6, фенотип 5). Появление же третьего фенотипа СК-А1 110/ 120, СК-А2 110/ 110 свидетельствует о закреплении такой гибридизации, по крайней мере, во втором поколении (Сендек, 1998; Sendek, 2002).
Приготовление образцов для анализа полиморфизма. Образцы ткани ряпушки (белых мышц) объемом примерно 5x5x5 мм3, хранившиеся при -70С, помещали в пластиковые пробирки, добавляли равный объем, экстрагирующего буфера, содержащего 15 мМ Трис-HCl рН 7,5 и 20 % сахарозу, после чего гомогенизировали ткань на холоде (0 - +4С). В некоторых случаях гомогенат мышечной ткани хранили при -20С, но не более 20 суток. Непосредственно перед электрофорезом гомогенат размораживали при +4С и центрифугировали (центрифуга К-24, 7 000-10 000 оборотов в минуту, 20—25 мин); для анализа полиморфизма СК-А1,2 использовали надосадочную жидкость.
Проведение электрофореза в полиакриламидном геле. При анализе полиморфизма креатинкиназы электрофорез проводили в 7,5%-м полиакриламидном геле в аппарате конструкции К.А. Трувеллера и Г.Н. Нефедова (1974), используя трис-ЭДТА-боратную (ТЕВ) буферную систему (маточный буфер: Трис - 0,81 М, борная кислота - 0,89 М, ЭДТА - 25 мМ (рН 8,3-8,4); гелевый буфер получали из маточного путем разведения в 10 раз, электродный буфер — путем разведения в 20 раз) (Peacock et al., 1965). Визуальное наблюдение за ходом электрофореза осуществляли, следя за миграцией в геле красителя бромфенолового синего (0,005 % в 20 % сахарозе), который вносили в 1-2 свободные лунки геля.
Условия проведения опыта (напряжение и сила электрического тока, время) подбирали экспериментально в зависимости от параметров электрофоретической камеры. При длине геля около 8—10 см напряжение составляло, как правило, около 230-260 V, а сила тока не превышала 60-80 мА. Продолжительность электрофореза составляла около двух часов.
Анализ дифференцирующей способности признаков, используемых при сравнении популяций ряпушки
Морфологический анализ проводили по 31 признаку; все они традиционно используются при описании видов лососеобразных и в некоторых случаях могут являться диагностическими для тех или иных систематических групп.
По четырем признакам — числу ветвистых лучей в брюшном и грудном плавниках, постдорсальному расстоянию (в процентах длины тела по Смитту) и заглазничному расстоянию (в процентах длины головы) — между изученными популяциями, независимо от того, относились они к популяциям дискуссионного систематического статуса или же считались типичными популяциями С. albala, значимых различий не обнаружено (прил. 2). По каждому из 27 оставшихся признаков различия были значимы не обязательно между всеми популяциями: часть популяций по конкретному признаку могла различаться значимо, а часть не имела значимых различий.
Оказалось, что наиболее значимая дифференциация между популяциями наблюдается по шести признакам (оценки сделаны по значению критерия Фишера, F). Так, при уровне значимости Р 0,05 критерий F для признака «число позвонков» имеет наибольшее значение (F=151,22; интервал варьирования признака составляет от 50 до 60 позвонков), что свидетельствует о наиболее четкой дифференциации изученных популяций по данному показателю. Остальные пять признаков характеризуются меньшей дифференцирующей способностью. Так, для максимальной высоты тела в процентах длины тела по Смитту F=95,01, а пределы варьирования признака лежат в диапазоне от 13,77% до 25,14%; для минимальной высоты тела в процентах длины тела по Смитту F=70,04, пределы варьирования 4,47%-8,92%. Высота спинного плавника в процентах длины тела по Смиту варьирует в пределах 12,96%-21,14% с F=53,53; длина основания анального плавника в процентах длины тела по Смитту — в пределах 10,05%—16,67% с F=49,34, а длина головы в процентах длины тела по Смитту в пределах 15,54%-25,00% с F=47,48.
Для выделения признаков, которые в первую очередь влияют на степень дифференциации популяций, был проведен факторный анализ для 16 морфологических показателей (табл. 6). Оказалось, что в первую очередь дифференциация происходит по следующему комплексу характеристик: максимальная и минимальная высоты тела, длина хвостового стебля, антевентральное (AV) расстояние, диаметр глаза, длина верхней челюсти и число ветвистых лучей в спинном и анальном плавниках. Таким образом, популяции, особи которых имеют невысокое тело, более длинный хвост, сдвинутый назад брюшной плавник, маленький глаз, более длинную верхнюю челюсть, а также меньшее число ветвистых лучей в спинном и анальном плавниках, будут отличаться от популяций, где преобладают особи с обратной тенденцией для вышеперечисленных признаков.
Интересно, что число позвонков — один из признаков, по которому разделяют два вида евразийских ряпушек — не входит в комплекс показателей, имеющих первоочередное значение для дифференциации популяций по морфологическим характеристикам. Он относится к группе признаков, которые в рамках факторного анализа связаны со вторым фактором, то есть тоже оказывают влияние на степень дифференциации популяций, но не столь значительное. Кроме числа позвонков сюда входят такие характеристики, как число простых лучей в спинном и анальном плавниках, длина головы, вентроанальное (VA) и антедорсальное (AD) расстояния. Третий фактор определяется группой признаков, куда входят пектровентралыюе (PV) расстояние и показатель «отношение вентроанального расстояния к антедорсальному расстоянию» (VA/AD).
Сравнительный анализ морфологических признаков у рыб изученных популяций позволяет говорить о значительном отличии ряпушки озер Большого Соловецкого острова от ряпушки, обитающей на материке. Так, для ряпушки из озера Большое Красное, озер Средний и Нижний Перт характерно большее число позвонков и простых лучей в анальном плавнике, а также сдвиг спинного плавника вперед (табл. 56, прил. 2). Необходимо отметить, что остальные популяции (т.е. популяции озер, расположенных на материке), по числу позвонков между собой существенно не различаются (исключение составляют только популяции Водлозера и озера Плещеево).
При сравнении популяций ряпушки Соловков друг с другом, более сходными по большинству признаков оказались популяции озер Средний и Нижний Перт. Для ряпушки еще одного соловецкого озера, озера Гремячее, характерны меньшие размеры тела по сравнению с ряпушкой трех других водоемов и еще более переднее положение спинного плавника. Однако, в связи с тем, что объем выборки из озера Грсмячее был невелик, перечисленные отличия не являются статистически значимыми.
Из материковых популяций наибольшее сходство демонстрируют популяции ряпушки озер Белое и Водлозсро. Так, рыбы из этих водоемов имеют более высокое тело по сравнению с рыбами из других локальностей, у них более высокие и более длинные спинной и анальный плавники. Кроме того, водлозерская и белозерская ряпушки характеризуются длинным брюшным плавником, большим глазом, высокой головой и достаточно короткой нижней челюстью. Хвостовой стебель у ряпушки Водлозера длиннее, чем у рыб из других исследованных нами популяций, а анальный плавник занимает более переднее положение.
Популяция ряпушки озера Плещеево оказалась наиболее сходной по морфологическим признакам с популяцией карельского озера Сегозеро. В качестве характерной особенности следует отметить, что у ряпушки озера Плещеево наблюдается наименьшее число ветвистых и простых лучей в анальном плавнике по сравнению с ряпушкой из других водоемов. В свою очередь, ряпушка из Сегозера характеризуется самой длинной нижней челюстью среди всех изученных выборок.
Таким образом, на основании анализа всего комплекса морфологических признаков изученные популяции ряпушки можно объединить в три группы. Первая группа включает популяции озер Большого Соловецкого острова, вторая — популяции Водлозера и озера Белое и третья — популяции озер Плещеево и Сегозеро (рис. 7). Обращает на себя внимание тот факт, что популяции Соловецких островов при всех их отличиях оказались ближе ряпушке из озер Плещеево и Сегозеро, а не к водлозерской или белозерской ряпушке.
Как уже было отмечено выше (см. Глава 1), признаками, позволяющими различать два вида ряпушек, считаются число позвонков и о і ношение вентроанального расстояния к антедорсальному (VA к AD; обзор: Решетников, 1980). Действигельно, на основании средних значений данных признаков все исследованные нами популяции следует отнести к виду С. albula. Однако, в популяциях из озер Большое Красное, Средний и Нижний Перт и Плещеево наряду с типичными представителями С. albula, были обнаружены особи, число позвонков у которых занимало промежуточное положение между значениями признака для двух видов или даже досчитало значений, типичных для сибирской ряпушки (до 60 позвонков в озерах Соловецких островов и до 59 в озере Плещеево) (табл. 5а).
Что же касается второго диагностического признака, то особи с характерным для С. sardinella отношением вентроанального расстояния к антедорсальному (более 62%) встречаются практически во всех исследованных популяциях (за исключением небольшой выборки из озера Гремячее). Судя по всему, данный признак вносит очень небольшой вклад в дифференциацию изученных популяций ряпушки. Это подтверждает и значение критерия Фишера, которое составляет для него всего 3,801.
Полиморфизм митохондриальной ДНК в популяциях ряпушки
Всего по сайтам четырнадцати рестриктаз выявлено 44 индивидуальных гаплотипа, 25 из которых были описаны ранее (Politov et al., 2000). Остальные 19 гаплотипов (по сайтам ферментов BsiN I, Dpn II, Пае III, Rsa I, Msp I, Nci I, Tag I) обнаружены впервые (прил. 5). В большинстве случаев различия между гашютипами для каждой рестриктазы связаны с нуклеотидными заменами в одном — двух сайтах рестрикции, вследствие которых сайты или появляются, или исчезают, что было подтверждено впоследствии результатами секвенирования (см. разд. 4.2.2.).
Комбинация гаплотипов четырнадцати рестриктаз представляет собой комплексный гаплотип, который был определен для каждой исследованной особи. Всего в изученных популяциях ряпушки обнаружено 34 комплексных гаплогипа (табл.9), частоты которых приведены в таблице 10. Число гаплотипов в популяциях варьирует от одного (озера Нижний Перт, Гремячее, Старушечье, Вирмаярви) до шестнадцати- в озере Плещеево. Соответственно, уровень гаплотипического разнообразия оказался наибольшим (0,70±0,06) в популяции озера Плещеево и равным нулю для популяций озер Нижний Перт, Гремячее, Старушечье, Вирмаярви (табл. 10). Максимальное нуклеотидное разнообразие, рассчитанное на основе данных о полиморфизме сайтов рестрикции, также зарегистрировано для ряпушки озера Плещеево. Оно составило в этом случае 0,0170 при среднем значении 0,0031 для всех исследованных популяций, то есть более чем в 5 раз превысило средний показатель (табл. 10).
Почти во всех изученных популяциях преобладающим оказался комплексный гаплотип Е, который первоначально был описан для пеляди и соответствует гаплотипу РЕ2 в работе (Politov et al., 2000). Данный гаплотип выявлен у 80,6% особей ряпушки, взятых в анализ. Исключением является литовское озеро Гальве, где почти половина рыб имеет распространенный в литовских популяциях гаплотип ALBL4 (табл. 9, 10). Еще четыре комплексных гаплотипа - ALB1, ALB2, ALB3 и ALB4, хотя и с более низкими частотами, отмечены в разных популяциях ряпушки, в связи с чем их можно считать характерными для вида в целом. Остальные 28 гаплотипов оказались уникальными для того или иного водоема, где они встречаются с достаточно низкими частотами — от 0,017 до 0,067. Исключение составляют гаплотип ALBL3, частота которого достигает 0,332 в озере Плателяй (Литва), а также гаплотип ALBP6, обнаруженный в озере Плещеево с частотой 0,133.
Уникальные комплексные гаплотипы присутствуют, однако, не во всех популяциях. Так, наибольшее их число характерно для озера Плещеево, где выявлено 12 уникальных комплексных гаплотипов. В то же время, в популяциях озер Варацкое, Сегозеро, Каллавеси, Вирмаярви, Нижний Пер г, Старушечье и Гремячее уникальных гаплотипов нет. Возможно, однако, что отсутствие уникальных комплексных гаплотипов в большинстве перечисленных озер объясняется небольшим объемом выборок из этих локальностей. Вообще же среднее число гаплотипов в исследованных популяциях равно 3,9, причем на каждую популяцию приходится в среднем по 2 уникальных гаплотипа.
Необходимо отметить, что в озере Водлозеро наряду с типичным для европейской ряпушки гаплотипом Е обнаружен комплексный гаплотип S, характерный для ряпушки Сибири (соответствует гаплотипу CS2 в работе Politov et al., 2000) (табл. 10). Данный факт, наряду с обсуждавшимися выше особенностями креатинкиназы в популяции Водлозера, представляет несомненный интерес, так как может свидетельствовать об интрогрессии генов сибирской ряпушки в водлозерскую популяцию. В то же время, поскольку гаплотип S имел, согласно данным ПЦР-ПДРФ анализа, всего лишь одну нуклеотидную замену по сравнению с широко распространенным у ряпушки европейских водоемов гаплотипом Е (в сайте узнавания для рестриктазы Rsa I) нельзя априори исключить, что появление эгого гаплотипа является следствием обратной мутации. Для подтверждения идентичности гаплотипов S типичной сибирской ряпушки и экземпляра из Водлозера впоследствии был применен более тонкий метод анализа - определение нуклеотидной последовательности, или секвенирование (см. ниже разд. 4.2.2.).
Результаты анализа AMOVA показали, ч ю для тестируемых групп, в том числе и для ряпушки Европейского Севера России, характерен высокий уровень внутрипопуляционного полиморфизма, значительно превосходящий уровень межпопуляционного разнообразия (табл. 11). Однако присутствие в большинстве популяций особей с уникальными для каждого конкретного водоема гаплоіипами приводит к тому, что дифференциация между популяциями ряпушки по частотам гаплотипов оказывается высокозначимой (%2=1487,37; df=495; Р 0,001).
Дифференциация популяций двух симпатричных форм ряпушки Онежского озера — мелкой и крупной (килец) — невелика, что свидетельствует о близости этих форм, но значима (р 0,05), что говорит о существовании между ними репродуктивной изоляции (х2=13,75).
Оценка степени изоляции и дивергенции популяций с помощью критерия FST позволяет говорить о значительном отличии от остальных лишь трех популяций ряпушек — озер Плателяй, Гальве и Плещеево (табл. 12). Нуклеотидная дивергенция между исследуемыми популяциями (генетическая дистанция по Нею, DNci), оцениваемая по среднему числу нуклеотидных замен на сайт, изменяется в интервале от 0,000 до 0,787 (табл. 12). Следует отметить при этом, что не все значения нуклеотидной дивергенции значимы. Наибольшее отличие от остальных популяций опять же характерно для литовских озер Плателяй, Гальве, Даугай, а также для озера Плещеево. Интересно, что популяция ряпушки из озера Нижний Перт также значимо дифференцируется от большинства исследованных популяций, но связано это в данном случае, судя по всему, с тем, что данная популяция-мономорфна.
