Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Структура и функции гена BCR-ABL, метаболические пути, участвующие в патогенезе ХМЛ. Взаимосвязь структуры химерного онкогена BCR-ABL с фенотипом заболевания 11
1.2 Молекулярно-генетическпе основы терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ 18
1.3 Факторы прогрессии заболевания 21
1.4 Молекулярный мониторинг экспрессии BCR-ABL у больных ХМЛ: характеристика метода, его оптимизация и стандартизация 24
1.5 Роль молекулярного мониторинга при терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ 37
1.6 Онкомаркер PRAME - экспрессия при гемобластозах,
иммунологическая роль, исследование функций белка в
клетке 45
1.7 Ген WT1 - строение, функции белка, экспрессия при гемобластозах..51
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
Глава 3. Результаты собственных исследований и обсуждение 68
3.1. Разработка тест-систем, определение характеристик метода ПЦР в реальном времени, стандартизация метода молекулярного мониторинга BCR-ABL 68
3.2 Сопоставление данных молекулярного и цитогенетического анализа .77
3.2.1 Валидация метода молекулярной диагностики 77
3.2.2 Корреляция у больных с ПЦО уровня экспрессии BCR-ABL и стабильности цитогенетического ответа 81
3.2.3 Динамика молекулярного и цитогенетического ответов у больных с разным ответом на терапию 85
3.3 Достижение молекулярного ответа у больных ХМЛ, начавших терапию иматинибом в ранней хронической фазе (РХФ) и в поздней хронической фазе (ПХФ) 88
3.3.1. Общее достижение БМО и ПМО в двух группах за весь период наблюдения 89
3.3.2. Динамика достижения молекулярного ответа в сроки 6-60 месяцев терапии иматинибом 93
3.3.3. Динамика первичного достижения молекулярного ответа за 1-5 годы терапии иматинибом 98
3.4. Взаимосвязь уровня экспрессии BCR-ABL у больных ХФ ХМЛ на ранних сроках терапии и достижения молекулярного и цитогенетпческого ответа на терапии иматинибом 103
3.5 Экспрессия генов PRAME и WT1 у больных ХМЛ 106
3.5.1 Частота встречаемости и уровень экспрессии генов PRAME и WT1 у больных ХФ ХМЛ на разных сроках терапии иматинибом и у больных во 2-й ХФ 106
3.5.2. Соотношение уровней'экспрессии генов BCR-ABL, PRAME и WT1 у больных ХФ ХМЛ на терапии иматинибом 110
3.5.3. Зависимость последующего ответа на терапию иматинибом от уровня экспрессии генов PRAME и WT1 у больных ХФ ХМЛ 111
3.5.4. Экспрессия генов PRAME и WT1 у больных ХФ ХМ, резистентных к терапии иматинибом и больных с оптимальным ответом на терапию. Корреляция с мутационным статусом гена BCR-ABL 113
Заключение 117
Выводы 120
Список использованной литературы 122
- Молекулярно-генетическпе основы терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ
- Роль молекулярного мониторинга при терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ
- Сопоставление данных молекулярного и цитогенетического анализа
- Взаимосвязь уровня экспрессии BCR-ABL у больных ХФ ХМЛ на ранних сроках терапии и достижения молекулярного и цитогенетпческого ответа на терапии иматинибом
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Транс локация (9;22) является специфической генетической аномалией, характерной для хронического миелолейкоза (ХМЛ). В результате этой реципрокной транслокации соединяются 5'-область гена BCR из 22 хромосомы и 3'- область гена ABL из 9 хромосомы, что приводит к образованию химерного онкогена BCR-ABL. Онкоген BCR-ABL кодирует белок с нерегулируемой тирозинкиназной активностью, функционирование этого белка играет решающую роль в патогенезе заболевания (Melo JV, et al, 2004).
Молекулярный мониторинг экспрессии BCR-ABL методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени является в настоящее время обязательным методом контроля лечения ХМЛ у пациентов на терапии ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) 1 и 2 поколения. Достижение большого молекулярного ответа (БМО) признано показателем оптимальной терапии и важным прогностическим фактором безрецидивной выживаемости больных ХМЛ [Baccarani М, et al, 2009, Palandri F, et al, 2009].
Для адекватной оценки уровня транскрипта BCR-ABL применяемый метод молекулярного мониторинга должен обладать достаточной чувствительностью, воспроизводимостью и специфичностью. Множество существующих вариаций метода молекулярной диагностики не позволяют напрямую сравнивать результаты, получаемые в разных лабораториях, затрудняют совместное участие в научных и клинических исследованиях. Наиболее универсальным инструментом стандартизации методики признана концепция международной шкалы (International Scale, IS), переход на которую осуществляется путем обмена образцами с референсными лабораториями и вычисления фактора конверсии. Международная шкала позволяет представлять результаты мониторинга в единых координатах, создает общее информационное пространство для исследователей [Branford S, et al, 2008]. Однако до настоящего времени в России совершенно отсутствовал опыт подобной работы.
Опираясь на факт об одном основном генетическом происхождении ХМЛ, применяемая в настоящее время терапия ИТК позволяет целенаправленно блокировать функционирование белка BCR-ABL. Однако, несмотря на значительные успехи подобной терапии, у части больных не удается добиться оптимального ответа на лечение. По результатам международного исследования IRIS, только 60% больных, у которых терапия иматинибом была начата в ранней хронической фазе (РХФ), оставались на этой терапии через 7 лет после ее начала (O'Brien S G, et al, 2008). Причинами прекращения терапии явились прогрессия заболевания, неэффективность или непереносимость терапии. Полного цитогенетического ответа (ПЦО) на терапии иматинибом достигли 82% пациентов, 17 % из достигших ответа пациентов впоследствии его потеряли.
Клинические различия хронической фазы (ХФ) ХМЛ обусловлены, по-видимому, биологической гетерогенностью заболевания. Известно, что при ХМЛ в опухолевой клетке, по сравнению с нормальной, существенно изменяется уровень экспрессии многих генов. Геномная нестабильность, наблюдаемая при ХМЛ, может являться следствием образования гена BCR-ABL, или наоборот, хромосомная транслокация возникает как последствие ранее существующей геномной нестабильности (Cilloni D, Saglio G, 2009).
Гены PRAME и WT1, по данным литературы, занимают одно из ключевых мест среди ряда генов, экспрессия которых значительно изменяется при ХМЛ. Так, при исследовании профиля экспрессии генов методом микроэрреев, PRAME и WT1 оказались в числе тех 10 генов из 3500 изученных, у которых экспрессия при прогрессии ХМЛ наиболее сильно отличалась от экспрессии в ХФ (Radich JP, et al, 2006).
Экспрессия гена PRAME в норме наблюдается в тканях репродуктивной системы и надпочечников, а гиперэкспрессия обнаружена при многих видах солидных опухолей и при гемобластозах, что позволило отнести белок PRAME к классу канцер-тестис антигенов (Epping МТ, Bernards R, 2006). Экспрессия PRAME хорошо изучена при острых лейкозах, при которых в дебюте заболевания является признаком благоприятного прогноза. Данные о частоте и уровне экспрессии PRAME в разных фазах ХМЛ являются противоречивыми, что не позволяет однозначно определить его роль в прогрессии заболевания. Получены сообщения о негативном влиянии экспрессии PRAME на миелоидную дифференцировку (Oehler VG, et al, 2009).
Экспрессия транскрипционного фактора WT1 ассоциируется со многими злокачественными заболеваниями, в ряде случаев он рассматривается как онкосупрессор, а при гематологических заболеваниях как онкоген (Yang L, et al, 2007). При острых лейкозах повышенный уровень экспрессии WT1 имеет прогностическое значение и ассоциируется с плохим ответом на терапию. По мнению немецких исследователей, уровень экспрессии WT1 в фазе акселерации и бластном кризе ХМЛ может служить индикатором гематологического рецидива (Na IK, et al , 2005).
Однако о значении раннего выявления экспрессии генов WT1 и PRAME у больных ХМЛ на дальнейшее течение этого заболевание ничего не было известно. Кроме того, ничего не было известно о работе этих генов у больных ХМЛ с мутациями BCR-ABL, приводящими к резистентности к терапии ИТК.
Получение информации о дополнительных молекулярных механизмах в патогенезе ХМЛ и анализ их функционирования при прогрессии заболевания может помочь в разработке критериев прогноза эффективности терапии. Изучение динамики экспрессии гена BCR-ABL и других генов, экспрессия которых изменяется при ХМЛ, сопоставление этих параметров для более детальной характеристики биологии заболевания, послужило основанием для проведения собственных исследований.
Цель исследования:
Анализ молекулярно-биологических особенностей хронического миелолейкоза на основе изучения закономерностей экспрессии генов BCR-ABL, PRAME, WT1 у больных, получающих терапию ингибиторами тирозинкиназ.
Задачи исследования:
1.Разработать на основе ПЦР в реальном времени диагностические тест-системы для количественной оценки экспрессии генов BCR-ABL, PRAME, WT1, провести стандартизацию метода определения экспрессии гена BCR-ABL.
Осуществить валидацию метода молекулярной оценки экспрессии гена BCR-ABL путем сравнения параметров молекулярного и цитогенетического ответов.
Определить, как уровень экспрессии BCR-ABL у больных в хронической фазе ХМЛ, получающих терапию иматинибом и достигших полного цитогенетического ответа, коррелирует с дальнейшим течением заболевания.
Изучить закономерности достижения молекулярного ответа у больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом, и оценить прогностическое значение экспрессии BCR-ABL на ранних сроках терапии.
Определить частоту встречаемости и уровень экспрессии генов PRAME и WT1, оценить взаимосвязь уровня экспрессии этих генов с уровнем экспрессии гена BCR-ABL и возможное прогностическое значение их экспрессии у больных ХФ ХМЛ в дебюте заболевания и при терапии иматинибом.
6. Сравнить экспрессию генов PRAME и WT1 у больных ХФ ХМЛ с
оптимальным ответом на терапию иматинибом и у больных, резистентных к терапии,
сопоставить экспрессию этих генов с мутационным статусом гена BCR-ABL у
резистентных больных.
Научная новизна:
Впервые показано, что уровень экспрессии генов PRAME и WT1 отражает наблюдаемые у больных ХМЛ различия в ответах на терапию иматинибом, установлена ассоциация между экспрессией гена PRAME и мутационным статусом гена BCR-ABL. Обнаружен высокий уровень экспрессии гена BCR-ABL у ряда больных ХМЛ с полным цитогенетическим ответом, получавших терапию иматинибом. У больных с уровнем экспрессии гена BCR-ABL равным или превышающим 1% IS, зафиксированным при полном цитогенетическом ответе, продемонстрирована значительная вероятность цитогенетического рецидива. На ранних этапах лечения иматинибом установлены пороговые значения экспрессии гена BCR-ABL, характерные для больных ХМЛ с последующей неудачей данного вида терапии. Показано, что при достижении полного цитогенетического ответа методом, наиболее полно отражающим динамику опухолевого клона, является молекулярный мониторинг экспрессии гена BCR-ABL.
Практическая ценность:
Стандартизация метода молекулярного мониторинга экспрессии гена BCR-ABL позволяет представить данные об экспрессии гена BCR-ABL у больных ХМЛ, полученные в лаборатории генной инженерии ФГБУ ГНЦ, в международной шкале в единицах IS. Пересчет данных молекулярного мониторинга, полученных в лаборатории за несколько лет, в формат международной шкалы, дал возможность объединить данные экспрессии BCR-ABL в регистре больных ХМЛ РФ и оценить результаты мониторинга в течение длительного периода терапии. Использование шкалы IS позволяет применять данные молекулярного мониторинга для оценки эффективности терапии больных ХМЛ в соответствии с общепринятыми критериями ответа на терапию, рекомендованными международным консорциумом European Leukemia Net (ELN) и другими межклиническими и межлабораторными исследовательскими группами.
Опыт лаборатории генной инженерии ФГБУ ГНЦ по проведению молекулярного мониторинга успешно применяется в других российских лабораториях, что ведет к существенному повышению качества диагностики и мониторинга ХМЛ в нашей стране. Применение дополнительных молекулярных маркеров расширяет возможности дифференцированной оценки клинических проявлений ХМЛ и дает возможность выявить неблагоприятные варианты течения этого заболевания.
Внедрение результатов в практику: Лаборатория генной инженерии ФГБУ ГНЦ применяет разработанный метод молекулярной оценки экспрессии BCR-ABL для диагностики и мониторинга ХМЛ у пациентов ФГБУ ГНЦ, городской клинической больницы им. СП. Боткина, МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, и других гематологических отделений и клиник Российской Федерации. Созданные в ходе исследования тест-системы используются в ряде диагностических лабораторий Российской Федерации: ОДКБ №1 г. Екатеринбург, КНИИГ и ПК г. Киров, РостГМУ г. Ростов-на-Дону, ОДКБ г. Архангельск.
Основные положения, выносимые на защиту:
Характеристики стандартизованного метода мониторинга экспрессии BCR-ABL, разработанного в лаборатории генной инженерии, отвечают необходимым международным требованиям по чувствительности, линейности и стабильности.
Уровень экспрессии гена BCR-ABL в периферической крови больных ХМЛ коррелирует с процентным содержанием Ph-позитивных клеток в костном мозге этих же больных. Мониторинг уровня экспрессии BCR-ABL позволяет отслеживать динамику опухолевой нагрузки.
У больных ХМЛ, достигших полного цитогенетического ответа на терапии иматинибом, наблюдается широкий разброс значений молекулярного ответа, при
этом уровень экспрессии BCR-ABL отражает вероятность потери цитогенетического ответа.
Уровень экспрессии гена BCR-ABL у больных ХМЛ на ранних этапах терапии иматинибом позволяет прогнозировать достижение цитогенетического и молекулярного ответа.
Высокая частота гиперэкспрессии гена PRAME характерна для резистентных к терапии иматинибом больных ХФ ХМЛ с мутациями киназного домена гена BCR-ABL, при этом частота гиперэкспрессии PRAME не коррелирует с уровнем опухолевой нагрузки.
Гиперэкспрессия гена WT1 в большей степени характерна для пациентов с высокой экспрессией гена BCR-ABL и служит дополнительным маркером плохого прогноза и резистентности у больных ХФ ХМЛ при терапии иматинибом.
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ в отечественной и зарубежной литературе.
Апробация работы:
Работа апробирована 05.07.2010 г. на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития.
Основные положения диссертационной работы доложены на VI симпозиуме НИИДГ «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (январь 2009г., Москва), на Всероссийском декаднике по гематологии (ГНЦ, апрель 2009г., апрель 2010г., Москва), на 15-м Конгрессе Европейской Гематологической Ассоциации (июнь 2010г., Барселона).
Объем и структура работы:
Молекулярно-генетическпе основы терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ
Накопление знаний о молекулярной структуре и функционировании белка BCR-ABL, о его роли в патогенезе заболевания позволило идентифицировать его как идеальную терапевтическую мишень для лечения ХМЛ. Одним из путей блокирования тирозинкиназной октивности белка могло бы быть использование химического вещества небольшого размера, которое конкурирует с АТФ за место связывания в киназном домене, и таким образом блокирует фосфорилирование BCR-ABL своих субстратов. Наиболее удачным оказалось вещество из группы 2-фениламинопиримидинов, иматиниб мезилат, которое в микромолярных концентрациях ингибирует киназную активность BCR-ABL [3, 50]. Было показано, что кроме BCR-ABL иматиниб ингибирует все ABL тирозинкиназы, такие как cABL, vABL, TEL-ABL. Иматиниб ингибирует также PDGFR и KIT, но имеет минимальную активность в отношении других тирозинкиназ и серин-треониновых киназ, что демонстрирует его высокую степень избирательности [51-53]. Иматиниб функционирует как конкурентный ингибитор связывания АТФ, взаимодействуя с АТФ-связывающим карманом киназного домена BCR-ABL на N-концс молекулы, при этом он контактирует как минимум с 21 аминокислотным остатком. [51]. АТФ-связывающий сайт локализуется между активационной петлей (А-петля) и фосфатсвязывающей петлей (Р-петля) молекулы [48]. А-петля контролирует каталитическую активность ABL, переключаясь между различными состояниями путем фосфорилирования. Иматиниб взаимодействует с ABL в его неактивной конформации, в которой А-петля перекрывает каталитический центр. Стерическпе несоответствия предотвращают связывание иматиниба в открытой, активной конформации А-петли.
Этот способ связывания является определяющим для высокой степени селективности иматиниба, поскольку у -различных киназ строение их активной формы является очень сходным, а неактивная конформация имеет значительные различия [51, 54]. Хотя у большинства пациентов в хронической фазе ХМЛ терапия иматинибом позволяет добиться хорошего и продолжительного контроля заболевания, часть пациентов прогрессирует в фазу акселерации или бластный криз, у части развивается рецидив заболевания [55, 56]. Резистентность к проводимой терапии выражается в увеличении тирозинкиназной активности BCR-ABL, и может быть обусловлена механизмами, которые или предотвращают достижение иматинибом своей мишени, или делают мишень нечувствительной к иматинибу. К первой группе относятся такие механизмы как выведение лекарства из клетки, связывание иматиниба белками, недостаточный уровень лекарства в плазме. Ко второй группе относятся мутации киназного домена BCR-ABL и амплификация гена [3]. Механизмы резистентности могут быть отнесены к группам BCR-ABL зависимых или BCR-ABL независимых. Резистентность к терапии ингибиторами тирозинкиназ разделяется на первичную, обозначаемую также как рефрактерность, и вторичную или приобретенную. При первичной резистентности эффект от терапии отсутствует с самого начала ее применения, при вторичной резистентности изначально полученный ответ теряется после некоторого периода времени разной продолжительности. Резистентность обозначают также как гематологическую, цитогенетическую и молекулярную, в зависимости от того, какой из этих ответов не был достигнут или был потерян [57]. Мутации киназного домена обнаруживаются в 50-90% случаев вторичной резистентности. Они могут располагаться в четырех основных регионах - Р-петле, сайте связывания иматиниба, каталитическом домене, А-петле.
Мутации, наиболее критичные для функционирования иматиниба и возникновения резистентности, обнаруживаются в Р-петле и сайте связывания иматиниба [51, 58]. -Понимание механизмов резистентности к иматинибу привело к быстрому возникновению новых лекарств, которые смогли бы преодолеть эту резистентность. Нилотиниб является модифицированной формой иматиниба, которая связывается с ABL киназой более тесно. У нилотиниба сохраняется та же специфичность к мишеням, как у иматиниба, он также связывается с киназным доменом ABL в его неактивной конформации. Его активность по отношению к большинству мутантных форм в 10-30 раз превышает активность иматиниба [59]. Другой подход к преодолению резистентности связан со сравнением структуры ABL и SRC киназ в их активной и неактивной конформации. Дазатиниб, который изначально был синтезирован как ингибитор киназ семейства SRC, оказался значительно более сильным ингибитором ABL, чем иматиниб [3, 60]. Нилотиниб и дазатиниб ингибируют большинство из мутантных форм ABL, есть несколько мутаций, при которых у одного из препаратов есть преимущество перед другим. Ни один из этих препаратов, включая иматиниб, не способен к ингибированию белка с мутацией T315I. Причиной является прямой контакт с образованием водородных связей между аминокислотным остатком в этом положении и молекулой ингибитора, который разрывается при замене треонина на изолейцин [51,61, 62].
Роль молекулярного мониторинга при терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ
Молекулярный мониторинг приобрел особую значимость в связи с внедрением в клиническую практику лекарств - ингибиторов тирозинкиназ, первым их которых явился иматиниб. На терапии ингибиторами тирозинкиназ большая часть пациентов в хронической фазе (ХФ) достигает полного цитогенетического ответа, и дальнейшее отслеживание динамики опухолевого клона цитогенетическими методами становится невозможным [55, 109, 113-115]. На сегодняшний день молекулярный мониторинг экспрессии BCR-ABL является обязательным атрибутом контроля за лечением ХМЛ у пациентов на терапии иматинибом и НТК 2 линии. В рамках рекомендаций ELN даны определения молекулярного ответа. Большой молекулярный ответ (БМО) - это уровень экспрессии BCR-ABL, который меньше или равен 0,1% по международной шкале. Полный молекулярный ответ (ПМО) - транскрипт BCR-ABL не детектируется методом ПЦР в реальном времени и/или двухстадийной ПЦР в двух последовательных образцах крови, имеющих адекватное качество [61]. Достижение БМО включено ELN в параметры оценки ответа на терапию. Достижение БМО к 18 месяцам терапии гливеком в дозе 400 мг у пациентов в ранней ХФ является критерием оптимального ответа. Пациенты, не достигшие БМО к этому сроку, относятся к категории имеющих субоптимальный ответ [61, 109]. Для терапии дазатинибом и нилотинибом как препаратами второй линии после неудачи терапии иматинибом оптимальным ответом признано достижение БМО к 12 месяцам. Рекомендуемая частота молекулярного мониторинга - каждые три месяца от начала терапии до достижения и подтверждения БМО, далее каждые шесть месяцев [61, 116]. Стабильный или улучшающийся уровень БМО является показателем оптимального ответа, отсутствие БМО к 12 месяцам терапии или возрастание уровня транскрипта рассматривается как предостережение. При возрастании уровня транскрипта, особенно если оно сопровождается потерей БМО, рекомендуется повторить молекулярный анализ через месяц для подтверждения [117]. Изучение практики лечения ХМ Л в США и Европе показало, что 39% врачей в США и 53% в Европе проводят молекулярный мониторинг каждые три месяца, а 38% и 31% соответственно, каждые 6 месяцев [118].
В рамках международного исследования по определению фактора конверсии было осуществлено сопоставление значений молекулярного ответа по международной шкале и цитогенетического ответа. На выборке в 828 образцов было показано, что значение экспрессии BCR-ABL в периферической крови больше 1% и до 10% соответствует большому цитогенетическому ответу в 98% случаев, а значение экспрессии 1% и менее в 96% случаев соответствуют полному цитогенетическому ответу (ПЦО). Были продемонстрированы также значимые различия в медианах уровня транскрипта BCR-ABL у пациентов с разным уровнем цитогенетического ответа [119]. Полагают, что молекулярный мониторинг экспрессии BCR-ABL наиболее необходим после достижения пациентом ПЦО, в этом случае он является наиболее чувствительным и информативным методом для отслеживания статуса заболевания и остаточной болезни [120]. Некоторые исследователи считают, что мониторинг экспрессии BCR-ABL может заменить цитогенетический мониторинг с самого начала терапии, но эта точка зрения является предметом обсуждения [108, 121]. Полагают также, что цитогенетический анализ имеет ограниченную значимость для пациентов с БМО, не у одного из таких пациентов австралийские исследователи не обнаружили цитогенетических аномалий [119]. Однако в случаях, когда цитогенетический анализ оказывается неэффективным из-за отсутствия достаточного количества метафаз или этот анализ недоступен, ПЦР в реальном времени необходим у пациентов на начальных этапах терапии, в том числе и для примерной оценки цитогенетического статуса [62].
Достижение БМО и ПМО отражает оптимальный ответ пациента на терапию имтинибом. По итогам 5-летнего наблюдения в исследовании IRIS, к 1 году лечения иматинибом БМО был достигнут у 53% из 124 пациентов с ПЦО, к 4 годам лечения доля таких пациентов составила 80% [55]. В исследовании терапии иматинибом в дозе 800 мг/день у вновь диагностированных пациентов в ХФ ХМЛ, 63% из 114 пациентов достигли БМО, 28% - ПМО, медиана времени наблюдения составила 15 месяцев [122]. Оценка молекулярного ответа на иматиниб у 261 пациента ХФ после неудачи терапии интерфероном показала, что у 31 % пациентов был достигнут БМО, у 15% - ПМО, медиана срока наблюдения составила 45 месяцев [123]. У пациентов, получавших высокие дозы иматиниба после неудачи терапии интерфероном, 56% и 41% достигли БМО и ПМО соответственно [124]. Итальянские исследователи показали, что среди пациентов в поздней хронической фазе (ПХФ), получавших терапию иматинибом в течение 2 лет, 44% достигли ПЦО, и у 29% из достигших ПЦО уровень молекулярного ответа соответствовал ПМО [125].
Сопоставление данных молекулярного и цитогенетического анализа
Для валидации разработанного метода молекулярной диагностики было проведено сопоставление значений экспрессии BCR-ABL, полученных методом ПЦР в реальном времени в периферической крови больных ХМЛ, и значений процентного содержания Ph-позитивных клеток в костном мозге этих же больных, полученных при СЦИ. Сопоставление данных осуществлялось на 274 образцах больных ХФ ХМЛ, у которых оба анализа были выполнены одновременно.
Образцы были разделены на группы, соответствующие уровню цитогенетического ответа (ЦО). Группа с отсутствием ЦО составила 29 образцов, с минимальным ЦО - 16, с малым ЦО - 18, с частичным ЦО - 43, с ПЦО - 168 образцов. Разброс значений экспрессии BCR-ABL в каждой группе был очень широким, но в целом он уменьшался по мере снижения процентного содержания Ph-позитивных клеток. Медиана экспрессии также
Соотношение долей образцов с разным уровнем экспрессии BCR-ABL, заметно отличалось в группах с разным ЦО. С уменьшением процентного содержания Ph-позитивных клеток, увеличивалась доля образцов с более слабым уровнем экспрессии (Рисунок 4). Каждая группа с определенным уровнем цитогентического ответа неоднородна по структуре молекулярного ответа, в ней есть образцы с более высокой и более низкой экспрессией. В группах с отсутствием ЦО, с минимальным и малым ЦО преобладающими являются образцы с высокой экспрессией BCR-ABL - более 10%, которые составляют в этих группах 88,7%, 81,2% и 77,8% соответственно. В группе с частичным ЦО доля образцов с высокой экспрессией уже не является преобладающей и составляет 34,9%, а среди пациентов с ПЦО эта доля снижается до 8,9%. Образцы с экспрессией BCR-ABL менее 1% и с БМО появляются уже в группе пациентов с малым ЦО, в группе с частичным ЦО доля таких образцов увеличивается. В группе с частичным ЦО появляются и образцы с ПМО, т.е. с недететектируемой экспрессией BCR-ABL. Таких пациентов было 4 из 43 пациентов в этой группе, у всех содержание Ph-позитивных клеток составляло 4-5%. Возможными объяснениями этого феномена является либо наличие другого типа транскрипта BCR-ABL (р190, р230), либо ингибирование экспрессии в клетках пациента.
Группа пациентов с ПЦО наиболее неоднородна по составу образцов с разным уровнем МО. Более 50% в этой группе составляют образцы с БМО и еще около 25% - образцы с экспрессией от 0,1% до 1%. Образцы с экспрессией выше 1% составляют в этой группе немногим более 20% образцов. Такая неоднородность показывает, что при отсутствии цитогенетически детектируемых Ph-позитивных клеток у больных ХМЛ сохраняется некоторый остаточный объем опухолевой массы. Различия в уровне экспрессии BCR-ABL у больных с ПМО могут быть обусловлены как варьированием объема опухолевой массы, так и разной интенсивностю экспрессии BCR-ABL в клетках пациентов, что подтверждает необходимость молекулярного мониторинга у больных с ПЦО.
Было подтверждено наличие положительной корреляции между процентным содержанием Ph-позитивных клеток и уровнем экспрессии BCR -ABL. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена составил 0,713 (р 0,0001).
Мы проанализировали взаимосвязь между цитогенетическим ответом в трех группах (отсутствие БЦО, ЧЦО и ПЦО) и распределением по уровню экспрессии BCR-ABL в каждой из них. Медиана экспрессии BCR-ABL в группах составила 64,4%, 6,1% и 0,07% соответственно (рисунок 5). При попарном сравнении групп по критерию Манн-Уитни было показано, что существуют значимые различия по медиане и среднему между этими группами (р 0,0001), т.е. эти группы не относятся к одной генеральной совокупности. По критерию Краскал-Уоллеса эти три группы также отличались друг от друга с высоким уровнем значимости (р 0,0001).
На основании этих же данных мы определили, что уровню экспрессия BCR-ABL 1% в 91,4% случаев соответствует ПЦО, а уровню экспрессии от 1 до 10% в 82,4% случаев соответствует БЦО. Такое сопоставление позволяет по уровню молекулярного ответа судить об опухолевой нагрузке и при -необходимости проводить примерную оценку цитогенетического ответа, что особенно важно, когда цитогенетический анализ не может быть проведен. Наши результаты вполне согласуются с данными, полученными Ross и соавторами в рамках исследования по сравнению параметров молекулярного и цитогенетического ответов [119]. Коэффициент корреляции Спирмена, полученный этими же исследователями при сопоставлении значений уровня экспрессии BCR-ABL и процентного содержания Ph-позитивных клеток, составил 0,765 (п=828; р 0,001), что ненамного отличается от коэффициента в нашем исследовании. Большая выборка, которой оперировали Ross и соавторы, несомненно, позволяет получить более точное и высокое значение этого коэффициента. Необходимо отметить, что у этих исследователей также наблюдались данные, когда низким значениям экспрессии BCR-ABL соответствовали достаточно высокие значения содержания Ph-позитивных клеток, например значениям экспрессии BCR-ABL, составляющим 2,3-6,7%, соответствовали значения содержания Ph-позитивных клеток 39-65%. Таким образом, не всегда имеется прямое однозначное соответствие количества Ph-позитивных клеток, и уровня экспрессии BCR-ABL. В каждой такой клетке или группе клеток могут действовать как факторы, уменьшающие или ингнбирующие экспрессию гена, так и факторы, интенсифицирующие экспрессию BCR-ABL.
Взаимосвязь уровня экспрессии BCR-ABL у больных ХФ ХМЛ на ранних сроках терапии и достижения молекулярного и цитогенетпческого ответа на терапии иматинибом
Уже на ранних этапах терапии иматинибом у больных ХФ ХМЛ наблюдаются существенные различия в уровне экспрессии гена BCR-ABL. У больных на сроках терапии иматинибом 6 и 12 месяцев уровень экспрессии колебался от не детектируемого уровня до уровня более 100%. Мы решили выяснить, отражает ли уровень экспрессии BCR-ABL в этих временных точках существующую гетерогеность опухолевых клеток больных ХМЛ, проявляющуюся в возможности достижения цитогенетического и молекулярного ответа при терапии иматинибом. Больные в каждой из этих временных точек (п= 25 и п=42 соответственно) были разделены на три группы по уровню экспрессии BCR-ABL: 1%; 1 и 10%; 10%. В каждой группе оценивались два параметра: 1) доля пациентов, достигших БМО к 24 месяцам терапии; 2) доля пациентов, достигших ЦО на терапии иматинибом. Цитогенетический ответ на терапию оценивался на срок 12 месяцев, и интерпретировался как оптимальный, субоптимальный и неудача терапии в соответствии с критериями ELN [61].
На срок 6 месяцев терапии в первую группу вошло 6 пациентов, во вторую - 8 пациентов, в третью - 11 пациентов. В группе с экспрессией 0,1% все пациенты продемонстрировали в дальнейшем оптимальный ответ на терапию, все достигли БМО. В группе с экспрессией от 0,1% до 10% оптимальный ответ получен у 3 пациентов (37,5%), субоптимальный - у 4 (50%), неудача терапии наблюдалась у одного пациента (12,5%), БМО был достигнут у 3 пациентов (37,5 %). В группе с экспрессией выше 10% оптимальный ответ был получен у 3 пациентов (27,3%), субоптимальный ответ не получил ни один пациент, у 8 пациентов зафиксирована неудача терапии иматинибом (72,7%), БМО не достиг ни один пациент (таблица 10).
Группы различаются между собой с высоким уровнем значимости - по доле больных, достигших определенного цитогенетического ответа (р=0,00039), по доле больных, достигших БМО к 24 месяцам терапии (р=0,00022).
На срок 12 месяцев терапии в группу с экспрессией 0,1% вошло 16 пациентов, в группу с экспрессией от 0,1% до 10% - 10 пациентов, в группу с экспрессией 10% - 16 пациентов. В первой группе оптимальный ответ на терапию иматинибом получен у 14 пациентов (87,5%), субоптимальный - у 2 (12,5%), все пациенты достигли БМО. Во второй группе оптимальный ответ получен у 9 пациентов (90%), субоптимальный - у 1 пациента (10%), БМО был достигнут у 7 человек (70%). В третьей группе оптимальный ответ получен у 2 пациентов (12,5%), субоптимальный - у 3 (18,8%), yl 1 пациентов наблюдалась неудача терапии (68,8%), БМО не достиг ни один пациент (таблица 11). По доле больных, достигших цитогенетического ответа, первая и вторая группа не различались, а при объединении этих двух групп в одну и сравнения ее с группой с экспрессией более 10% наблюдаются значимые различия (р 0,0001). При этом все три группы значимо различаются по доле больных, достигших БМО к 24 месяцам терапии иматинибом (р 0,0001).
Большая информативность уровня экспрессии BCR-ABL на ранних сроках терапии, чем на более поздних сроках, подтвердилась при оценке прогностического значения уровня экспрессии у больных ХФ ХМЛ на сроках 6 и 12 месяцев терапии иматинибом. По уровню экспрессии на 6 месяцев терапии пациенты могли быть достаточно четко разделены на три группы, продемонстрировавшие в дальнейшем статистически различающийся ответ на терапию, как цитогенетический, так и молекулярный. На срок 12 месяцев терапии иматинибом уровень экспрессии менее 0,1% уже не являлся однозначным показателем оптимального цитогснетического ответа, распределение по ответу не отличалось между этой группой и группой с промежуточной экспрессией. Здесь граница, разделяющая группы по цитогенетическому ответу на терапию, смещается на уровень 10%. Мы можем сказать, что с увеличением срока терапии становятся значимыми различия экспрессии на более высоком уровне. Прогностическая роль уровня экспрессии BCR-ABL на 12 месяцев терапии по достижению ЦО невелика, поскольку многие больные уже достигли ПЦО, и различия в уровне экспрессии могут отражать вероятность последующей потери этого ответа. Интересно отметить, что по доле больных, достигших БМО, группы на этот срок по прежнему значимо различаются, таким образом, прогностическое значение уровня экспрессии на этот срок по достижению МО остается значительным.
По результатам этой части исследования можно сказать, что уровень экспрессии более 10% на сроки 6 и 12 месяцев с высоким уровнем значимости служит показателем неудачи проводимой терапии, а уровень менее 0,1% на срок 6 месяцев - показателем дальнейшего оптимального ответа.
