Введение к работе
Актуальность темы В настоящее время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) успешно применяется при лечении целого ряда заболеваний крови, как онкогематологических [А.Г. Румянцев, А.А. Масчан, 2003], так и неонкологических. Появляются сообщения об успешной трансплантации ГСК при заболеваниях других органов и систем [Y. Liao et al., 2011, А.А. Новик, Р.А.Иванов, 2008].
Следует отметить преимущества получения и использования ГСК пуповинной крови (ГСК ПК) по сравнению с традиционно используемыми источниками- костным мозгом и периферической кровью:
-
Отсутствие воздействия на здоровье матери и ребенка (донора), простота процедуры забора ПК.
-
Возможность использования образцов ГСК ПК не полностью совместимых по HLA системе.
-
Значительно снижается риск передачи некоторых инфекций, передаваемых трансмиссивным путем.
-
Сокращение времени поиска необходимого HLA-типа трансплантата ПК.
-
Меньшая вероятность развития и тяжесть течения реакции «трансплантат-против-хозяина» [W. Arcese et al., 1998].
По данным Всемирной организации доноров костного мозга (BMDW), количество находящихся на хранении для общественного использования образцов ПК составляет 564 тысячи, а по данным Eurocord, на 2011 г. в мире выполнено более 8.500 трансплантаций ГСК ПК.
В России, по сообщению Российского межрегионального регистра трансплантации ГСК, в период с 2000 по 2006 г. было выполнено 272 аллогенные трансплантации ГСК или в среднем – около 20 на 10 млн. человек. Принимая во внимание, что потребность в аллогенных трансплантациях ГСК в России и европейских странах приблизительно одинакова, следует констатировать, что в России данный вид лечения применяется лишь каждому 30-му пациенту от всех нуждающихся.
Одним из основных недостатков использования ПК для трансплантации является ограниченное количество ГСК в образце [S. S. Grewal et al., 2003]. Так как исход трансплантации зависит, в том числе, и от количества трансплантируемых клеток, то существует необходимость максимального увеличения содержания клеток в трансплантируемом образце. Проводимые в банке ПК (БПК) мероприятия по повышению эффективности выделения ядросодержащих клеток и их криоконсервирования являются важными мероприятиями по улучшению исходов трансплантации ГСК ПК.
Сейчас в практике банков пуповинной крови (БПК) используются два способа выделения фракции ГСК ПК: центрифугирование с добавлением седиментирующих веществ [P. Rubinstein et al., 1995] и сепарация с использованием полуавтоматических и автоматических систем [P. Solves et al., 2009]. Опубликованные на сегодняшний день результаты исследований эффективности различных способов обработки ПК, в том числе и сравнительных, не дают однозначного ответа о преимуществе того или другого метода [V. Lapierre et al., 2007]. В связи с этим актуальной является задача выбора оптимального метода обработки ПК в зависимости от исходных показателей образца ПК. Кроме того, недостаточно изучены изменения характеристик выделенной из ПК ядросодержащей фракции (количество и жизнеспособность ГСК) после длительного криохранения. В этой связи также актуальной представляется задача выбора оптимального метода не только для обработки, но и для размораживания и подготовки образца ПК к трансплантации.
В настоящее время в России единственным документом, регламентирующим деятельность банков пуповинной крови (БПК) является Приказ МЗ РФ от 25 июля 2003 г. N 325 "О развитии клеточных технологий в Российской Федерации". Поскольку единого стандарта деятельности банков пуповинной крови в России нет, то для создания хранилища образцов ПК с высоким содержанием ГСК каждый банк разрабатывает собственные алгоритмы и организационно-технологическое обеспечение, ориентируясь, в основном, на зарубежный опыт. Для обеспечения надлежащего качества хранилища необходима стандартизация всех процессов, происходящих в БПК по обработке, тестированию, криохранению и выдаче образцов ПК.
Учитывая нынешнее состояние данного вопроса, сравнительное исследование влияния двух использующихся на практике методов выделения ядросодержащей фракции из ПК на количество и жизнеспособность клеток, а также изменение этих показателей в процессе криоконсервирования представляется актуальным, направленным на разработку единого алгоритма деятельности банка пуповинной крови.
Цель исследования Оптимизация технологических и организационных принципов выделения фракции лейкоцитов из пуповинной крови и их подготовки к трансплантации.
Задачи исследования
-
Провести сравнительную оценку эффективности выделения фракции лейкоцитов пуповинной крови на клеточном сепараторе Sepax S100 (Biosafe) и при помощи метода двойного центрифугирования с 6% раствором гидроксиэтилкрахмала.
-
Провести сравнительную оценку эффективности криоконсервации фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной на клеточном сепараторе Sepax S100 (Biosafe) и методом двойного центрифугирования.
-
Провести сравнительную контролируемую оценку эффективности отмывания фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора при помощи клеточного сепаратора Sepax S100 (Biosafe, Швейцария) и методом центрифугирования.
-
Научно обосновать организационно-технологические подходы к формированию общественного хранилища пуповинной крови.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Выделение фракции лейкоцитов пуповинной крови на клеточном сепараторе Sepax S-100 (Biosafe, Швейцария) в сравнении с методом двойного центрифугирования, позволяет получать большее количество лейкоцитов и обеспечивает лучшую их сохранность при криохранении.
-
Отмывание фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора при помощи клеточного сепаратора Sepax S-100 (Biosafe, Швейцария) по сравнению с методом центрифугирования, минимизирует потерю лейкоцитов.
-
Сохранность важных для трансплантации характеристик фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной, криоконсервированной и подготовленной к трансплантации с использованием клеточного сепаратора Sepax S-100 (Biosafe, Швейцария) позволяет рекомендовать его использование как оптимальную технологию для общественных хранилищ пуповинной крови.
-
Разработанные оптимальные алгоритмы выделения, криоконсервации и подготовки к трансплантации лейкоцитов пуповинной крови позволяют увеличить трансплантационную дозу гемопоэтических стволовых клеток.
Научная новизна Впервые проведены репрезентативные сравнительные исследования важных для трансплантации характеристик фракции лейкоцитов пуповинной крови до замораживания и криоконсервированных, выделенных на сепараторе Sepax S100 (Biosafe) или методом двойного центрифугирования. Установлено, что по ряду показателей (выход ОЯК, жизнеспособность) метод автоматической сепарации эффективнее метода двойного центрифугирования. Кроме того, образцы клеточного концентрата, полученного автоматическим способом, лучше переносят условия длительного криохранения. Проведено сравнительное контролируемое изучение эффективности отмывания фракции лейкоцитов пуповинной крови от криопротектора на клеточном сепараторе Sepax S100 (Biosafe, Швейцария) и с помощью центрифугирования. Выявлено, что использование автоматического метода отмывания ведет к наименьшим потерям ядросодержащих клеток.
По результатам исследований научно обоснованы организационно-технологические принципы формирования общественного хранилища пуповинной крови.
Практическая значимость работы Получены данные о важных для трансплантации характеристиках фракции лейкоцитов пуповинной крови, выделенной, криоконсервированной и подготовленной к трансплантации с использованием клеточного сепаратора Sepax S100 (Biosafe) и при помощи метода двойного центрифугирования с 6% раствором гидроксиэтилкрахмала. Сравнительный анализ результатов исследования, позволяет рекомендовать использование клеточного сепаратора Sepax S100 (Biosafe) для выделения лейкоцитов пуповинной крови и их отмывания от криопротектора, как оптимальную технологию для общественных хранилищ пуповинной крови. На основании сделанных выводов разработаны организационно-технологические принципы формирования
общественного хранилища пуповинной крови, создающие основу для широкого применения клеточных технологий в медицине.
Внедрение в практику Результаты исследований внедрены и используются в научной, педагогической и лабораторной работе в Покровском банке стволовых клеток, НИЛ клеточных технологий СЗГМУ им. И.И. Мечникова.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV Симпозиуме, посвященном памяти Р.М. Горбачевой «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток» (Санкт-Петербург, 2010); на 2 Всемирном конгрессе по пуповинной крови (Марсель, 2010), на международном Симпозиуме «Общественный регистр доноров пуповинной крови. Использование стволовых клеток пуповинной крови при гематологических и негамотологических заболеваниях» (Санкт-Петербург, 2011), на Международной научно-практической конференции «Регенеративная терапия и клеточные технологии. Нано- и биотехнологии в современной медицине» (Санкт-Петербург, 2012).
Личное участие автора в получении результатов Автором с участием сотрудников лаборатории выделения и криохранения стволовых клеток проведена работа по обработке, замораживанию всех образцов (личный вклад- 75%). Автором разработаны и предложены параметры оценки методик обработки ПК и её подготовки к трансплантации, метод криоконсервирования. Проведена статистическая обработка результатов исследований
Публикации По материалам диссертации опубликовано 39 печатных работ, из них 6 в научно-практических журналах, рекомендованных ВАК, получено 2 патента на изобретение по теме диссертационного исследования.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 146 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список литературы содержит 340 источников, из которых 18 отечественных и 322 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 20 рисунками.
