Содержание к диссертации
Введение
Глава I Современные представления о влиянии отрицательных температур на структурно функциональное состояние клеток (обзор литературы) 13
1.1 Факторы криоповреждения и криозащиты клеток. Гипотезы, теории, концепции 13
1.2 Криопротекторы и криоконсерванты 28
1.3 Методы оценки функционального состояния клеток, подвергнутых криовоздействию 40
1.4 Методы криоконсервирования лейкоцитов 48
Глава II Материалы и методы исследования 55
2.1 Характеристика объекта исследования 55
2.2 Разработка новых комбинированных криозащитных растворов, обеспечивающих сохранность лейкоцитов при различных отрицательных температурах 55
2.3 Методы исследования физико-химических свойств криозащитных растворов 61
2.4 Биологические методы исследования криозащитных растворов 62
2.5 Разработка программ замораживания и отогрева лейкоцитов 64
2.6 Методы оценки структурно-функционального состояния лейкоцитов, подвергнутых воздействию отрицательных температур 70
2.7 Методы статистического анализа 75
Глава III Результаты исследования 76
3.1 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10С) 76
3.2 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20С) 90
3.3 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (-40С) 100
3.4 Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие низкой температуры (-80С) 111
3.5 Физико-химические и биологические свойства эффективных криозащитных растворов 123
Глава IV Обсуждение результатов 136
Выводы 162
Практические рекомендации 164
Список литературы 166
- Криопротекторы и криоконсерванты
- Разработка программ замораживания и отогрева лейкоцитов
- Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20С)
- Физико-химические и биологические свойства эффективных криозащитных растворов
Введение к работе
Актуальность исследования. Для создания общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, а также эффективных научно обоснованных методов их криоконсервирования важным является всестороннее изучение структурно-функциональных изменений биологических мембран (плазматических, ядерных, лизосомальных и др.) и метаболических процессов, протекающих с их участием. Изменения окружающей среды (понижение температуры, вымерзание воды, рН, электролитный баланс, вязкость, появление чужеродных молекул и др.) первыми воспринимают плазматические мембраны. Основной причиной их первичных повреждений являются нарушения распределения липидов, обеспечивающих высокую пластичность и растяжение мембраны. С трансформацией липидных компонентов взаимосвязаны фазово-структурные переходы фракций клеточной воды (свободной, связанной, фиксированной), каждая из которых имеет свою зону кристаллизации с определенной степенью замедления метаболизма (Сведенцов, 2004). С учетом того, что существенное снижение метаболических процессов в клетке наступает при низкой температуре (–70 –98С) общепринятым является консервирование клеток при температурах ниже указанных с применением жидкого азота.
Для повышения криоустойчивости биообъекта используют криопротекторы и стабилизирующие добавки. Действие первых основано на способности создавать прочные связи с молекулами воды (вне и внутри клетки, более прочные, чем связи воды между собой) и на способности снижать концентрацию солей, что делает минимальным риск повреждения белковых структур клеток, а также образовывать связи со структурными компонентами мембраны, предохраняя их от разрушения кристаллами льда. Всего в мире обнаружено и создано более 120 криофилактических средств с экзоцеллюлярным, эндоцеллюлярным и смешанным криозащитным действием. Однако выраженными криопротекторными свойствами обладают: глицерин, ДМСО (диметилсульфоксид), ДМАЦ (диметилацетамид), 1,2-ПД (пропандиол), ПЭО-400 (полиэтиленоксид), которые имеют определенную токсичность и требуют отмывания после размораживания биообъекта, что дополнительно травмирует клетки. С 2003 г Минздравом РФ разрешено использование высокоочищенного ДМСО для криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток периферической крови и костного мозга. Производство криоконсервантов в России осуществляется главным образом в лабораторных условиях с использованием зарубежных протекторов.
В последние годы положительно зарекомендовало себя применение комбинированных криозащитных растворов, состав которых по причине видоспецифичности биологического объекта весьма вариабелен: классические экзо- и эндоцеллюлярные протекторы (Корниенко, Бондаренко, 2008; Сведенцов, 2010); обладающие протекторным действием антифризные протеины, гликопротеины (Андреев и др., 2008) и клатратные соединения инертных газов (Тельпухов, Щербаков, 2006; Sheleg et al., 2008); антиоксиданты и стабилизаторы биологических мембран, усиливающие устойчивость клеток к эндо- и экзогенным факторам физико-химического воздействия (Dalvit et al., 1988; Carrol J. et al., 1993), активаторы энергетического метаболизма клеток - гетерозиды (Кабачный, Горбунова, 2004); стабилизаторы температур замораживания и отогрева - наночастицы ферромагнетика (Сукач и др., 2008). Однако, несмотря на достигнутые успехи, продолжается поиск универсального для различных клеток и тканей криопротектора. Актуальным остается разработка эффективных технологий длительного хранения биообъектов в нетоксичных криоконсервантах при широком диапазоне отрицательных температур.
Степень разработанности темы исследования. Для эритроцитов и тромбоцитов крови человека используют способы консервирования (Чечеткин и др., 2005) при температурах от –20С до –80С в электрорефрижераторах под защитой моно- и бикриоконсервантов. В зависимости от используемой температуры срок хранения клеток составляет от 1 года до 5 лет. Применение электрических холодильников позволяет отказаться от громоздкого, дорогостоящего оборудования и не зависит от периодического восполнения запасов азота, кратковременные колебания в них температур не являются фатально губительными для клеточного материала. Все это имеет важное значение в практической деятельности криобанков. Возможность сохранности ядросодержащих клеток при температурах выше –196С остается малоизученной, что связано с быстрым истощением энергетических запасов и накоплением продуктов метаболизма. На основании выше сказанного обозначены цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования – определить сохранность функций лейкоцитов при температурах от –10С до –80С с применением комбинированных криоконсервантов.
Задачи исследования:
-
Разработать комбинации криозащитных растворов, содержащие криопротекторы с различной проникающей способностью и реставрирующие компоненты, не требующие отмывания после отогрева биообъекта.
-
Сравнить влияние комбинированных криозащитных растворов на степень устойчивости лейкоцитов к воздействию отрицательных температур: переохлаждения (–10С), субумеренно-низкой (–20С), умеренно-низкой (–40С), низкой (–80С).
-
Установить возможные сроки структурно-функциональной сохранности лейкоцитов в условиях указанных отрицательных температур под защитой разработанных криозащитных растворов.
-
Определить влияние эффективных криозащитных растворов на характер перекисных процессов в мембранах лейкоцитов на разных этапах криоконсервирования и при варьировании сроков хранения.
-
Изучить физико-химические и биологические особенности (токсичность, пирогенность) эффективных криозащитных растворов и определить переносимость лабораторными животными внутривенных аутогемотрансфузий криоконсервированных с данными растворами лейкоцитов.
-
Разработать способы электрорефрижераторного криоконсерви-рования лейкоцитов крови в нетоксичных ограждающих растворах при температурах от –10С до –80С.
Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании на примере лейкоцитов крови человека показана эффективность комбинирования в замораживаемой клеточной среде непроникающих и проникающих криопротекторов, реставрирующих компонентов, что обеспечивает сохранность биологического объекта при температурах от –10С до –80С и позволяет снизить токсичность ограждающего раствора, что доказано в опытах на экспериментальных животных.
Предложено охлаждение лейкоцитов до –10С по нелинейной программе в незамерзающем криоконсерванте, содержащем проникающий протектор глицерин (в исходной концентрации 7%), непроникающий протектор желатин со средним молекулярным весом 16 кДа (7,5%) и антигипоксант-антиоксидант ОМЭПС (сукцинат гидроксиметилэтил-пиридина; 0,3%), что обеспечивает криоустойчивость более 75% лейкоцитов по разным тестам в течение 9 суток хранения.
Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ (гексаметиленбистетрагидроксиэтилмочевина) обеспечивает указанную сохранность лейкоцитов в широком диапазоне температур: при –20С в исходной концентрации 28% совместно с ОМЭПС (0,2%) в течение 21 суток; при –40С в концентрации 30% совместно с антигипоксантом фумаратом натрия (2,8%) и лимонной кислотой (0,06%) в течение 30 суток; при –80С в концентрации 22% совместно с проникающим протектором ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,4 %) в течение 180 суток (срок наблюдения). На основании полученных данных, а также имеющихся сведений об эффективности применения указанного криопротектора при ультранизком замораживании тромбоцитов и клеток костного мозга сформулирована концепция об универсальном криозащитном действии данного вещества.
Найден новый вид непроникающих криопротекторов – растительные полисахариды, которые наряду с иммуномодулирующими свойствами способны оказывать криозащитный эффект за счет своих функциональных групп и не обладают токсичностью. Впервые показана перспективность использования лемнана пектинового полисахарида ряски малой в составе комбинированной криозащитной среды для –10С. Установлено, что криоконсервант, содержащий глицерин (в исходной концентрации 7%), лемнан со средним молекулярным весом 400 кДа (0,3%) и ОМЭПС (0,3%) обеспечивает сохранность исходных морфофункциональных параметров у лейкоцитов в течение 1 суток.
Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения о возможности хранения ядросодержащих клеток не только в условиях ультранизкой (–196С) температуры, но и при температурах от –10С до –80С, что является ценным для трансфузиологии, ветеринарной медицины, микробиологии, ихтиологии.
Результаты проведенных исследований вносят вклад в создание общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, т.к. указывают на то, что в используемых нетоксичных комбинациях консервантов каждый протектор проявляет защитное свойство при определенных температурных условиях, что в итоге позволяет устранить несколько причин криоповреждения клеток с сохранением аддитивной криопротекторной эффективности выбранной комбинации ингредиентов.
Показана эффективность применения электрорефрижераторной технологии консервирования биообъектов при температурах от –10С до –80С в нетоксичных комбинированных консервантах, которая отличается от традиционной с использованием жидкого азота простотой выполнения и не требует дорогостоящего оборудования. С практической точки зрения важным является использование электрических морозильников и щадящих нелинейных программ замораживания, предупреждающих выброс кристаллизационного тепла и последующую рекристаллизацию, вызывающую гибель клеток. Особую значимость представляют предложенные криозащитные растворы (патенты РФ: № 2184449, 2002; № 2240000, 2004; № 2261595, 2005; № 2290808, № 2301524, 2007; № 2439877, 2012), которые не уступают по своей эффективности существующим консервантам, но при этом являются нетоксичными и не требуют отмывания клеток перед применением, что увеличивает число жизнеспособных лейкоцитов и снижает экономические затраты. Предложенные технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток периферической крови являются доступными широкому кругу учреждений и могут быть использованы при создании запаса клеток для его одномоментного использования при ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций вследствие техногенных причин, природных явлений, террористических актов и вооруженных конфликтов, частота появления которых увеличивается в последние годы, а также для сохранения биоматериала во время космических перелетов, в длительных научных экспедициях.
Методология и методы исследования. В работе использованы общенаучные методы: анализ (проспективный и ретроспективный), синтез (сравнительно-сопоставительный), частно-научные методы (лабораторный, инструментальный), методы математической статистики.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Комбинирование в замораживаемой биосреде непроникающих и проникающих криопротекторов, антиоксидантных и противогипоксантных компонентов обеспечивает высокую криоустойчивость лейкоцитов периферической крови при замораживании – отогреве и позволяет снизить токсичность ограждающего раствора.
-
Предложенные комбинированные криоконсерванты не вызывают активацию перекисного окисления липидов в мембранах лейкоцитов и обеспечивают сохранность морфофункциональных параметров у более 75% клеток по разным тестам при –10С в течение 9 суток (патент РФ № 2261595, 2005), при –20С - 21 суток (патент РФ № 2240000, 2004), при –30С - 30 суток (патент РФ №2184449, 2002) и при –80С в течение 180 суток (срок наблюдения; патент РФ № 2290808, 2007).
-
Комбинированные криозащитные растворы нетоксичны, апирогенны и хорошо переносятся лабораторными животными в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.
-
Способы электрорефрижераторного криоконсервирования лейкоцитов крови при температурах от –10С до –80С являются эффективными, доступными для широкого использования и рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.
Внедрение. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГБОУ ВПО «Вятский государственный гуманитарный университет» и в ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздрава РФ.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала и использованием современных методик статистической обработки. Результаты работы доложены и обсуждены на Международных конференциях: «Сохранение генетических ресурсов» (С.-Петербург, 2004), «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), «Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии» (Гродно, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2010); на XVIII и XIХ Съездах Всероссийского физиологического общества им И.П.Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004); на Всероссийских научно-практических конференциях «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (С.Петербург, 2002, 2007); на Всероссийских совещаниях «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Киров, 2008, 2012); на научной сессии Кировского филиала РАЕ и Кировского областного отделения РАЕН (Киров, 2004).
Апробация диссертации состоялась 27.02.2013 г. на заседании Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 200 машинописных страницах, содержит 34 таблицы и 31 рисунок. Список литературы включает 342 источник, в том числе 124 статьи зарубежных авторов.
Криопротекторы и криоконсерванты
Криопротекторы - вещества, обладающие способностью предупреждать развитие криоповреждений биологических объектов и обеспечивать их сохранность в жизнеспособном состоянии после замораживания. К таким веществам относятся (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994) различные классы соединений: спирты, оксиды, аминоксилоты, амиды кислот, углеводы, белки, полимерные соединения. Коллигативные криопротекторы природного происхождения представляют собой низкомолекулярные соединения, содержащие гидроксильные группы. К ним относятся, например, полигидрооксиспирты (глицерин, инозитол, сорбитол, маннитол, рибитол и др.), сахара (глюкоза, фруктоза, арабиноза, манноза, трегалоза и др.) и другие (Каранова М.В., 2003).
Несмотря на то, что криопротекторы являются предметом исследований на мировом уровне более 50 лет, механизмы их действия и взаимодействия с различными биологическими структурами окончательно не выяснены (Нардид О.А., 2009). Выделяют следующие механизмы: подавление возрастания концентрации солей в растворах (Moiseyev V.A., Nardid О.A., Belous A.M., 1982), снижение повреждения клеток и клеточных мембран при дегидратации (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994), уменьшение количества кристаллов образовавшегося льда внутри клетки (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994) и другие (Бауст Дж.Г., Бауст Дж.М., Шнайдер К. и др., 2008).
Криопротекторы, по предложению J. Е. Lovelock (1954), разделяются на экзоцеллюлярные (непроникающие в клетку) и эндоцеллюлярные (способные проникать в клетку). Позднее Н.С. Пушкарь (1978) предложил еще хладоограждающие растворы смешанного типа.
К проникающим в клетку относятся: гицерин, диметилсульфоксид -ДМСО (Пушкарь Н.С, Шраго М.Н., Белоус A.M., Калугин Ю.В.., 1978; Makino М., Baba М. А, 1997), диметилацетамид - ДМАЦ (Трошина В.М., Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А., 1977), 1,2-пропандиол - 1,2-ПД.
Непроникающие криопротекторы: поливинилпирролидон - ПВП (Лаврик С.С, Когут Г.И., Афанасьева Е.Ю., 1971), полиэтиленоксид - ПЭО-1500 и с более высокой молекулярной массой (Лобынцева Г.С., Щербак Г.М., Полякова А.И., 1974).
К криопротекторам смешанного действия относятся ПЭО-400 (Пушкарь Н.С, Шраго М.Н., Белоус A.M., Калугин Ю.В., 1978; Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994), ГМБТОЭМ (Сведенцов Е.П., 1995 - 2005), которые обезвоживают клетки, обволакивают их мембраны и могут в небольшом количестве проникать в клетки.
Защитное действие внутриклеточных криофилактиков выражается в том, что, обладая низкой молекулярной массой, эти вещества легко проникают в клетку, связывают воду, способствуют переохлаждению клеток, изменяют кристаллообразование, стимулируя образование преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. Кроме того, являясь хорошими растворителями, они снижают концентрацию солей внутри и вне клеток, этим самым, предохраняя их от обезвоживания и уменьшая повреждение белковых структур клеток (Цуцаева А.А., 1983; Белоус A.M., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф., 1987). Также эти вещества образуют связи со структурными компонентами мембраны клеток, что ведет к снижению степени ее повреждения при замораживании (Виноград - Финкель Ф.Р., Киселев А.Е., 1970; Смольянинова Е.И., Липник Т.Н., Гордиенко О.И., 2004; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976).
Механизм действия экзоцеллюлярных криопротекторов основан на их способности образовывать прочные связи с внеклеточной водой, вызывать дегидротацию клеток, замедлять скорость образования кристаллов и изменять их структуру, взаимодействовать с клеточной мембраной, следствием чего является повышение ее устойчивости к повреждающему действию кристаллов (Цуцаева А.А., 1983; Pushkar N.S., Itkin Yu.A., Bronshtein V.L. et al., 1976). Однако применение непроникающих криопротекторов связано с трудностями выбора условий эквилибрации: температуры, скорости введения криопротектора, его концентрации и др. (Mazur P., Cole K.W., 1989; Dutheil D., Underhaung G., Petit-Paris I. et al., 2009).
Всего в мире обнаружено и создано более 120 криофилактических соединений, однако выраженными криопротекторными свойствами обладаю всего 6: глицерин, ДМСО, ДМАЦ, 1.2-ПД, вещество А-378 или ГМБТОЭМ и ПЭО-400. Слабее указанные свойства у ПВП. Самые слабые у многоатомных спиртов, Сахаров, гидроксиэтилкрахмала, сывороточных белков и других органических соединений. К сожалению, у всех названных выше криопротекторов выявлено свойство оказывать токсическое действие на клетки. Так, например, ЛД5о при внутривенном введении ГМБТОЭМ для мышей составляет 15,5±0,6 г/кг массы тела животного (м.т.) (Сведенцов Е.П. и др., 1987; 1999). 1,2-ПД ЛДзо для мышей - 15-18 г/кг м.т. (Гучок В.М. и др., 1984, 1987). Летальная доза ПВП для мышей при внутривенном введении 25% раствора препарата составляет от 12 до 15 г/кг м.т. (Михайлов В.Г., 1975, 1979; Пушкарь Н.С. и др., 1978, 1981). ЛД5о глицерина составляет 4,57±0,14 к/кг м.т. (Andersen К.С. et al., 1950), ЛД50 ДМСО - 3,8±0,1 г/кг м.т. (Ashwood-Smith M.G., 1961), для ПЭО-400 ЛД50=12,5 г/кг м.т. (Пушкарь Н.С. и др., 1978), для ДМАЦ ЛД50=4,2 г/кг м.т. (Дудаева А.А. и др., 1983).
В настоящее время к криопротекторам предъявляют следующие требования (Сведенцов Е.П., 2010): эффективный криозащитный эффект; хорошо растворяться в воде и стабилизировать ее молекулы; способствовать образованию мелких кристаллов льда и стеклованию вне- и внутриклеточной воды; участвовать в процессах метаболизма; должен быть нетоксичным (не требующим отмывания от размороженного биообъекта); не накапливаться в организме и быстро выводится из него; не разрушать клеточные мембраны и органеллы; не приводить к развитию побочных эффектов при гемотрансфузиях и др.
Ниже приведена краткая характеристика наиболее часто применяемых криопротекторов.
Глицерин - многоатомный спирт с молекулярной массой 92,1. СзН80з-Чаще всего для замораживания используют 15% раствор. К положительным эффектам глицерина относят (Пушкарь Н.С. и др., 1978; Луговой В.И. и др., 1981) его способность уменьшать размер кристалла льда, так как способность глицерина сжиматься при замерзании способствует тому, что превращение воды в лед не сопровождается увеличением его объема. При этом идет образование мелкокристаллического льда с переходом в стеклование. Защитные свойства глицерина связаны также с его способностью поддерживать переохлажденное состояние клетки, поскольку его молекулы образуют стабильные водородные связи с водой. При обычных температурах (22-37С) глицерин легко проникает в клетки и защищает мембрану и внутриклеточные структуры, действуя как противосолевой буфер. Кроме того, глицерин уравнивает осмотическое давление по обе стороны мембраны, то есть предупреждает развитие осмотических градиентов на мембране. А также он формирует комплексы с солями и металлами и с активными центрами ферментов, вызывая временную блокаду функциональной активности ряда ферментных систем в клетке. Образует гидратную и частично из молекул глицерина защитную оболочку вокруг молекул белков, что предотвращает их коагуляцию.
Однако при действии глицерина на ядросодержащие клетки было замечено набухание митохондрий, отрыв внутренних мембран и их частичный лизис, а иногда появление «вуали» и сглаживание структуры ядра (Терентьева Э.И. и др., 1966). Существует мнение, что глицерин не обеспечивает полноценной криозащиты лейкоцитов, вызывает их необратимую агрегацию и лизис, требует применения отмывающих растворов (Утемов СВ. и др., 1995). В связи с токсичностью глицерина, для его удаления из клеток используют разнообразные методы: диализ, отмывание гипертоническими растворами глюкозы, хлорида натрия и цитрата, непрерывное отмывание и центрифугирование, разведение или осаждение декстраном, агломерацию с неэлектролитами или дисагрегацию в солевых растворах. В процессе отмывания глицерина в клетках возникают дополнительные повреждения, которые устраняют с помощью различных реабилитационных средств.
В настоящее время глицерин широко используется в качестве моноэндоцеллюлярного криоконсерванта для эритроцитов при -196С (Нечеткий А.В. и др., 2005), в диапазоне от -60С до -80С (Виноград-Финкель Ф.Р., Гинзбург Ф.Г., Федорова Л.И. и др., 1973), от -25С до -38С (Мельникова В.Н., Замалетдинова Т.В., Кирьянова Г.Ю., 1995), а также для консервирования клеток косного мозга при -70С (Федотенков А.Г., 1967).
Разработка программ замораживания и отогрева лейкоцитов
Перед замораживанием лейкоконцентрат смешивали с комбинированным консервантом в соотношении 1:1 в полимерном контейнере «Компопласт 300» и экспонировали при комнатной температуре в течение 20 минут.
Охлаждение лейкоцитных концентратов, смешанных с растворами №1-3 до температуры переохлаждения (—10С) проводили 45±1,6 мин по трехступенчатой программе (рис. 2.5.1) в хладоносителе (45% этиловый спирт; —10С), находящемся в камере электроморозильника Криостат, созданного Институтом проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины и Кировским НИИ гематологии и переливания крови. На 1-ом этапе со скоростью 12 /мин до 0С, на 2-ом этапе со скоростью 0,9 /мин до -7С, на 3-ем - 0,3/мин до температуры -10С. После этого переносили для хранения в охлажденную до -10С спиртовую ванну морозильной камеры бытового электрического холодильника «ЗИЛ» (Россия), где выдерживали от 1 до 14 суток.
В растворе №.4 охлаждение лейковзвеси проводили по аналогичной схеме (рис. 2.5.2): со скоростью 15 /мин до 0С затем 1,4 /мин до -6,2С и в последующие 22 минуты до -10С (0,3 7мин ). После этого переносили для хранения в охлажденную до -10С спиртовую ванну морозильной камеры бытового электрического холодильника «ЗИЛ» (Россия), где выдерживали от 1 до 14 суток.
Для замораживания лейкоцитов до —10С в растворах №5-7 биообъект помещали в охлажденную до -10С спиртовую ванну морозильной камеры бытового электрического холодильника «ЗИЛ» (Россия), где выдерживали 1 сутки.
Замораживание лейкоцитов до субумеренно-низкой температуры (-20С) в растворах №8-10 проводили в течение 10±1,8 мин по двухступенчатой нелинейной (экспоненциальной) программе (рис. 2.5.3) в камере электроморозильника «Криостат» (96% этиловый спирт охлажден до -20С): на 1-ом этапе со скоростью 10 7мин до точки эвтектики (-2,1 С -температура, при которой весь раствор застывает в сплошную массу, состоящую из тонких прослоек льда из воды и застывшего растворенного вещества), на 2-ом - 2-3 7мин до температуры -20С. Хранили замороженные образцы в электроморозильнике на -20С «Derby» (Дания) от 1 до 90 суток.
Замораживание лейкоцитов до -20С в растворе №11 проводили по аналогичной методике в течение 19,5±6,5 мин (рис. 2.5.4): на 1-ом этапе со скоростью 1 /мин до точки эвтектики (-2,1 С), на 2-ом - 1-2 /мин до температуры -20С. Хранили замороженные образцы в электроморозильнике на-20С «Derby» (Дания) 1 сутки.
При замораживании смеси лейкоцитов в хладоограждающих растворах №12-14 до умеренно-низкой температуры (—40С) общее время составляло 18±0,7 мин. Охлаждение лейкоцитов производили в три этапа (рис. 2.5.5): на 1-ом этапе со скоростью 7-87мин до точки эвтектики (-2,6С), на 2-ом - 1-27мин до температуры -28С и на 3-ем этапе 3-47мин до -40С. Для первого и второго этапов замораживания биообъекта использовали электроморозильник «Криостат» (хладоноситель - 96% этиловый спирт, охлажденный до -28С), для третьего - электроморозильник на -40С «Derby» (Дания), в котором срок хранения биообъекта составил от 1 до 60 суток.
Замораживание лейкоцитов до -40С в растворах №15-17 проводили по аналогичной методике: образцы выдерживали 15 мин в спиртовой охлажденной (-28С) ванне электроморозильника «Криостат» и переносили для дальнейшего замораживания и хранения (1 стуки) в электроморозильник на -40С «Derby» (Дания). и Замораживание лейкоцитов до -40С в растворе №18 проводили по аналогичной методике в течение 17±1,0 мин (рис. 2.5.6): на 1-ом этапе со скоростью 10-137мин до точки эвтектики (-13,6С), на 2-ом - 1-27мин до температуры -28С и на 3-ем этапе 3,57мин до -40С. Для первого и второго этапов замораживания биообъекта использовали электроморозильник «Криостат» (—28С), для третьего - электроморозильник на -40С «Derby» (Дания), в котором срок хранения биообъекта составил 1 сутки.
В опытах с низкой температурой (-80С) общее время замораживания лейкоцитов по экспоненциальной программе составляло 62±0,5 мин. Охлаждение биообъекта в растворах №19-21 производили в три этапа (рис. 2.5.7): на 1-ом этапе со скоростью 6-7/мин до точки эвтектики (-2,6С), на 2-ом - 1-27мин до температуры -28С и на 3-ем этапе - 2-37мин до -80С. Для первого и второго этапов замораживания биообъекта использовали электроморозильник «Криостат» (хладоноситель - 96% этиловый спирт, охлажденный до -28С), для третьего - электроморозильник на -80С MDF-3086S «Sanyo» (Япония) в котором срок хранения биообъекта составил 1 и 180 суток.
Замораживание лейкоцитов до -80С в хладоограждающих растворах №22-24 проводили по экспоненциальной программе по аналогичной методике: образцы выдерживали 18 мин в спиртовой охлажденной (-28С) ванне электроморозильника «Криостат» и переносили для дальнейшего замораживания и хранения (1 стуки) в электроморозильник на -80С MDF-3086S «Sanyo» (Япония)
Следует отметить, что во всех опытах время и скорость замораживания были идентичны.
В дополнительной серии исследований лейкоциты в криозащитном растворе №20 были заморожены по линейной программе с применением жидкого азота в программном аппарате УОП 00.00.00 (Украина): на 1-м этапе со скоростью 1С/мин от +22 до -7С, на 2-м этапе - 10С/мин от -7 до -40С, на 3-м этапе - 20С/мин от -40 до -80С. Общее время замораживания составило 37 мин. После этого образцы переносили для хранения в электроморозильник на -80С MDF-3086S «Sanyo» (Япония) где хранили в течение суток.
Температуру в каждой экспериментальной серии регистрировали с помощью прибора ГСП-04, датчик ТСМ-3-02 которого был установлен в одном из контейнеров с имитатором - криозащитным раствором с конечной концентрацией его ингредиентов. Скорость движения ленты самописца составляла 240 мм/ч.
Быстрое размораживание лейкоконцентрата производили в 20-литровой водяной ванне при температуре +38С в течение 35-50 с (в зависимости от объема биообъекта), а в опытах с температурой переохлаждения (-10С) - в течение 2-3 сек при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в секунду) до температуры биообъекта +2 + +4С
Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20С)
При изучении функционального состояния лейкоцитов крови человека, подвергнутых воздействию отрицательной температуры -20С в течение 1 суток в хладоограждающих растворах №8-11 (табл. 2.2.1) установлено (табл. 3.2.2.1), что абсолютное и относительное число клеток снижается (р 0,05) только в опытах с раствором №11. Количество клеток с неповрежденной мембраной после отогрева снижается при использовании всех вариантов хладоограждающих растворов, однако в меньшей степени это характерно для раствора №9, под защитой которого сохраняется 86,9±1,4% (от исходного уровня) эозинорезистентных клеток.
Оценка популяции лейкоцитов до замораживания и после отогрева указывает на лучший криозащитный эффект также хладоограждающего раствора №9, при его использовании абсолютное число гранулоцитов достоверно не изменилось после отогрева. В остальных случаях снижение числа гранулоцитов сопровождалось увеличением количества лимфоцитов и/или моноцитов.
При изучении фагоцитарной способности нейтрофилов (рис. 3.2.2.1) установлено, что хладоограждающие растворы №9 и № 11 способствуют восстановлению данной функции соответственно у 75,7±7,9% и 76,0±12,9% клеток (от исходного уровня) после отогрева.
Следовательно, по большинству показателей хладоограждающий раствора №9, содержащий в исходной концентрации ГМБТОЭМ - 28%, ОМЭПС - 0,15% и бидистиллированную воду до 100 мл проявляет лучшие криозащитные свойства в условиях субумеренно-низкой температуры (-20С) в течение 1 суток.
Исследование содержания в нейтрофилах активированных кислородных метаболитов (АКМ) с помощью НСТ-теста показало, что у нейтрофилов, находящихся в хладоограждающем растворе №9 в течение 1 суток при -20С наблюдается существенное повышение содержания АКМ. Если исходное количество НСТ-положительных клеток составляло 19,7±5,6% (М±о; п=7), то после размораживания оно повысилось и составило 52,3±10,6%, т.е. увеличивалось примерно в 2,6 раза.
Установлено, что под защитой хладоограждающего раствора №9 после размораживания через 1 сутки отмечалось тенденция к увеличению численности популяции Т-лимфоцитов (86,2±7,б%; М±а, п=5) в сравнении с уровнем до замораживания (75,0±8,4%). Вероятно, это связано с повышением активности антигенспецифических рецепторов Т-лимфоцитов, вызванной воздействием холодового стресса. Количество В-лимфоцитов достоверно не изменялось: исходно - 8,7±2,7% (М±о, п=5), после отогрева 6,7±2,5%, следовательно, эта популяция лимфоцитов при данных условиях проявляет большую стабильность.
Также установлено, что содержание растворенного в среде кислорода через 1 сутки данного холодового воздействия не изменяется по сравнению с исходным (до замораживания) уровнем (рис. 3.2.2.3).
На основании того, что хладоограждающий раствор №9 в лучшей степени обеспечивает сохранность лейкоцитов при -20С в течение 1 суток при его использовании было проведено изучение морфо-функциональных показателей клеток через следующие сроки холодового воздействия - 14, 21, 28, 42, 56, 70, 80 и 90 суток.
Установлено (табл. 3.2.3.1), что абсолютное и относительное число клеток статистически значимо (р 0,05) снижается через 80 суток экспозиции при -20С в растворе №9. Количество эозинорезистентных лейкоцитов после 28 суток падает ниже 90% от исходного уровня. Достоверное снижение количества гранулоцитов после отогрева происходило также спустя 28 суток и способствовало повышению относительного количества лимфоцитов и моноцитов. Количество нейтрофилов, способных к фагоцитозу (рис. 3.2.3.1) при воздействии субумеренно-низкой -20С температуры 21 сутки оставалось на уровне выше 70% от исходного. Число нейтрофилов с темно-синими гранулами восстановленного формазана увеличивалось через 1-28 суток в 2,5-3 раза.
Таким образом, при использовании хладоограждающего раствора №9 показатели функционального состояния лейкоцитов при —20С остаются на высоком уровне в течение 21 суток, после чего отмечается их ухудшение.
Данные полученные в лизосомально-катионном тесте свидетельствуют о том, что уровень среднего цитохимического коэффициента (СЦК) у размороженных нейтрофилов при их хранении в растворе №9 после 21 суток холодового воздействия (-20С) не изменяется -исходный уровень СЦК составляет 2,3+0,6 у.е (п=10, М±о), после отогрева -1,9+0,4 у.е. Следовательно содержание микробицидных белков в клетке остается на прежнем уровне (рис. 3.2.3.2). Под защитой хладоограждающего раствора №9 после размораживания через 21 сутки сохранялась тенденция к увеличению численности популяции Т-лимфоцитов (85,2±3,3%; М±а, п=5) в сравнении с уровнем до замораживания (75,0±8,4%), однако количество В-лимфоцитов уменьшалось (р 0,05): исходно - 8,7±2,7% (М±о, п=5), после отогрева 1,7±0,9%, т.е. данная популяция лимфоцитов теряет свою стабильность.
Определение содержания растворенного в биосреде кислорода показало, что через 21 сутки нахождения лейкоцитов при -20С отмечается снижение (р 0,05) концентрации кислорода в среднем на 0,7 мг/л (рис. 3.2.3.3).
Применение хладоограждающего раствора №9, содержащего в исходной концентрации ГМБТОЭМ - 28%, ОМЭПС - 0,15% и бидистиллированную воду до 100 мл позволяет сохранить лейкоциты в условиях субумеренно-низкой температуры (-20С) в течение 21 суток.
Физико-химические и биологические свойства эффективных криозащитных растворов
Стерильные хладоограждающие растворы №4, №9, №13 и №20 разливали по флаконам объемом по 50 мл и подвергали ускоренному старению, при котором образцы выдерживали в течение 45 суток при +60С, что соответствовало двум годам хранения при +4С (согласно «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре (1983)» и оценивали прозрачность и рН растворов. Результаты исследований показали, что все растворы по истечении срока хранения оставались прозрачными. Изменение кислотности наблюдали только в серии с раствором №20 (исходное значение рН=7,29; после хранения - 6,05). В виду того, что рН данного раствора изменяется в кислую сторону, его приготовление необходимо осуществлять непосредственно перед процедурой замораживания.
После проведения метода ускоренного старения со всеми хладоограждающими растворами (в растворе №20 перед использованием уровень рН доводили до 7,2) были заморожены лейкоциты и оставлены на хранение при соответствующих температурах (раствор №4 при —10С; №9 при -20С; №13 при -40С; №20 при -80С) в течение суток.
Полученные результаты показали, что растворы №9, №13 и №20 сохраняют морфологическую полноценность клеток и их функциональную активность на том же уровне, что и соответствующий раствор, не подвергавшийся «старению».
В опытах с раствором №4 после «ускоренного старения» функциональная активность лейкоцитов снижалась. Было выдвинуто предположение, что это связано с возможным гидролизом ингредиента раствора - желатина - при хранении (45 суток при +60С). Была проведена дополнительная серия исследований, в которой «ускоренному старению» подвергался раствор без желатина, последний добавляли в раствор непосредственно перед охлаждением клеток и хранением в течение 1 и 12 суток. В этом случае морфологические и функциональные показатели клеток соответствовали показателям лейкоцитов, хранившихся при —10С в растворе, не подвергавшемуся «старению» как в течение одних, так и в течение 12 суток,
Таким образом, результаты проведенных исследований демонстрируют стабильность хладоограждающих растворов №9 (в конечной концентрации ГМБТОЭМ 14% и ОМЭПС 0,075%) и №13 (ГМБТОЭМ 15% и фумарат натрия 1,4%) в течение 2 лет.
Испытание на мышах проведены согласно методике ХН-ой Государственной Фармакопеи РФ (2007). Тест-дозу (табл. 3.5.2.1.1), в количестве 0,5 мл одного из исследуемых хладоограждающих растворов (с конечной концентрацией ингредиентов) вводили однократно внутрибрюшинно белым лабораторным мышам (по 5 животных для каждого раствора) со скоростью 0,1 мл/с. Срок наблюдения за животными после введения хладоограждающего раствора составил 5 суток. Установлено, что все животные оставались живыми, каких-либо отклонений в поведении и внешнем виде не выявлено. На основании полученных данных сделано заключение об отсутствии «острой токсичности» у криозащитных растворов №4, №9, №13 и №20 при однократном внутривенном введении лабораторным мышам.
Испытание на мышах. Стерильный криозащитный раствор в тест-дозе 0,5 мл вводили ежедневно впутрибрюшинно белым лабораторным мышам (20 животных для каждого раствора) весом 19-20 г в течение 10 дней.
В эти же сроки контрольным группам мышей (по 5 мышей для каждого раствора) весом 19-20 г впутрибрюшинно вводили аналогичный объем 0,9% раствора хлорида натрия в дозе 0,5 мл
Все животные хорошо перенесли 10-ти дневное ежедневное внутрибрюшинное введение тест-дозы испытуемых растворов и аналогичных доз изотонического раствора хлорида натрия. Их поведение и внешний вид не отличались от обычных.
После 10-ой инъекции мыши и опытных, и контрольных групп подвергались эвтаназии эфиром. Данные гистологических исследований во всех опытных группах мышей не выявили деструктивных изменений в паренхиматозных органах после 10-дневного введения определенного хладоограждающего раствора. В ряде случаев отмечалось полнокровие сосудов, а также незначительные кровоизлияния, что связано с посмертными изменениями в организме животных опытных и контрольных групп.
Испытание на кроликах. В опытных сериях один из тестируемых хладоограждающих растворов в конечной концентрации (табл. 3.5.2.1.1) вводился кроликам-неальбиносам весом 2,3-2,4 кг ежедневно в течение 10 дней в краевую вену ушной раковины в тест-дозе 6,6 мл/кг со скоростью 0,05 мл/с. В контрольных сериях (по 5 кроликов-неальбиносов для каждого раствора) - аналогично вводился 0,9% раствора хлорида натрия.
Общее состояние животных опытных и контрольных групп после 10-ти дневного введения растворов не изменилось. Поведение и внешний вид кроликов также не претерпели каких-либо изменений. Признаки токсического влияния растворов: снижение массы тела (табл. 3.5.2.2.2), анорексия и др. отсутствовали.
При изучении влияния многократного внутривенного введения хладоограждающих растворов на показатели периферической крови кроликов (содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов; цветовой показатель; СОЭ; лейкоформула) статистически значимых отклонений от исходного уровня показателей гемограммы животных в контрольных и опытных группах не выявлено (табл. 3.5.2.2.3 - 3.5.2.2.6)
Влияние многократного внутривенного введения исследуемого хладоограждающего раствора на функцию почек исследовано на 10 кроликах (для каждого раствора). У животных двукратно до и после 10-дневого внутривенного введения определенного испытуемого раствора собиралась моча, и производился ее общий анализ. Результаты исследования свидетельствуют, что после 10-дневного введения любого хладоограждающего раствора цвет, прозрачность, относительная плотность мочи не изменились по сравнению с исходными данными. До и после инфузий криоконсерванта белок в моче не обнаружен, рН мочи оставалась щелочной. Осталось без изменения содержание в осадке мочи эритроцитов, лейкоцитов, трипельфосфатов.
Данные вскрытия и гистологического исследования микропрепаратов легких, сердца, печени, почек, надпочечника, селезенки, головного мозга, тонкого кишечника, яичника (яичка) животных опытных и контрольных групп свидетельствует о том, что патоморфологических изменений, свидетельствующих о негативном влиянии на организм кроликов хладоограждающих растворов, не выявлено.
На основании полученных данных сделано заключение об отсутствии «хронической токсичности» у криозащитных растворов №4, №9, №13 и №20.
