Содержание к диссертации
Введение
1 Введение 7
1.1 Актуальность проблемы 7
1.2 Цель и задачи исследования 10
1.3 Научная новизна исследования 11
1.4 Научно-практическая ценность 12
1.5 Положения, выносимые на защиту 12
1.6 Объем и структура диссертации 12
2 Обзор литературы 13
2.1 Введение 13
2.2 Развитие терапии хронического лимфолейкоза 15
2.2.1 Монотерапия 15
2.2.2 Комбинированная терапия 17
2.2.3 Иммунохимиотерапия 17
2.2.4 Заключение 19
2.3 Определение минимальной остаточной болезни при хроническом лимфолейкозе: методы, принципы и значение 20
2.3.1 Методы определения минимальной остаточной болезни– молекулярная оценка МОБ– аллель-специфичная ПЦР– проточная цитофлуориметрия 20
2.3.2 Роль эрадикации минимальной остаточной болезни при ХЛЛ: результаты клинических исследований 25
2.3.3 Заключение 27
2.4 Анализ свободных легких цепей: характеристика методики и значение. 28
2.5 Лечение пожилых пациентов с ХЛЛ 31
2.5.1 Введение 31
2.5.2 Терапия первой линии у пожилых пациентов 34
2.5.3 Терапия рецидивов ХЛЛ у пожилых пациентов 38
2.5.4 Заключение 40
2.6 Анализ сопутствующих заболеваний 41
2.6.1 Введение 41
2.6.2 Изменения фармакокинетики и фармакодинамики 43
2.6.3 Переносимость химиотерапии пожилыми пациентами 45
2.6.4 Значение индексов коморбидности в онкологии 49
2.6.4.1 Индекс коморбидности M. Charlson 50
2.6.4.2 Кумулятивный индекс коморбидности 51
2.6.4.3 Индекс сопутствующих болезней 52
2.6.4.4 Индекс Kaplan–Feinstein 53
2.6.5 Комплексная гериатрическая оценка 54
2.6.6 Заключение 54
3 Пациенты и методы исследования 55
3.1 Характеристика больных 55
3.2 Показания к началу терапии, определение форм и стадий, критерии эффективности и токсичности 55
3.2.1 Полная ремиссия 58
3.2.2 Полная ремиссия с неполным восстановлением костного мозга/полная цитопеническая ремиссия 59
3.2.3 Нодулярная частичная ремиссия 59
3.2.4 Частичная ремиссия 59
3.2.5 Прогрессия 60
3.2.6 Стабилизация опухоли 61
3.2.7 Фаза наблюдения и временные показатели эффективности 62
3.2.8 Оценка токсичности 63
3.3 Сопроводительная терапия и модификация доз 64
3.3.1 Сопроводительная терапия 65
3.3.2 Модификация доз 66
3.4 Исследования, проводившиеся в рамках протоколов 67
3.4.1 Иммунофенотипирование для первичной диагностики 67
3.4.2 Определение минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии 68
3.4.3 Определение мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов 70
3.4.4 Определение минимальной остаточной болезни с помощью аллель-специфичной ПЦР 70
3.4.5 Определение свободных легких цепей 72
3.5 Статистический анализ 72
3.6 Этический комитет 73
4 Результаты 74
4.1. Введение. Распределение пациентов на терапевтические группы 74
4.2. Оценка минимальной остаточной болезни 76
4.2.1 Сравнение двух методов – аллель-специфичной ПЦР и 4-цветной проточной цитофлуориметрии 77
4.2.2 Оценка результатов ПЦР-РВ 80
4.2.3 Определение специфичности и чувствительности оценки минимальной остаточной болезни методом ПЦР-РВ при помощи ASO-праймеров к генам IgH 80
4.2.4 Сравнение результатов проточной цитофлуориметрии 82 и ПЦР-РВ
4.2.5 Оценка минимальной остаточной болезни методом 4-цветной проточной цитофлуориметрии 84
4.2.6 Обсуждение полученных результатов 86
4.2.7 Выводы 89
4.3 Режим FCR у пациентов моложе 69 лет с хорошим соматическим статусом: эффективность, токсичность, прогностические маркеры и возможность сокращения числа циклов у больных с полным ранним ответом 90
4.3.1 Скрининг и порядок обследования больных 92
4.3.2 Критерии включения и исключения 95
4.3.3 Перечень исследований, проводившихся в рамках протокола 96
4.3.4 Характеристика больных 97
4.3.5 Терапия 98
4.3.6 Результаты 102
4.3.6.1 Характеристика ответа на терапию 102
4.3.6.2 Характеристика осложнений 104
4.3.6.3 Анализ выживаемости 109
4.3.7 Сокращение числа циклов в зависимости от статуса минимальной остаточной болезни 112
4.3.8 Обсуждение 115
4.3.9 Выводы 119
4.4 Анализ свободных легких цепей в сыворотке 120
4.4.1 Характеристика больных 120
4.4.2 Свободные легкие цепи и белок Бенс-Джонса 123
4.4.3 Корреляция избыточной продукции моноклональных легких цепей с другими маркерами неблагоприятного прогноза ХЛЛ 124
4.4.4 Анализ выживаемости 124
4.4.5 Прогностическая модель, основанная на хромосомных нарушениях и данных иммунохимического анализа 126
4.4.6 Обсуждение 130
4.4.7 Выводы 134
4.5 Сравнительное рандомизированное исследование режимов FCR-Lite и ClbR у пожилых пациентов с ХЛЛ 135
4.5.1 Обоснование протокола 135
4.5.2 Критерии включения и исключения 136
4.5.3 Перечень исследований, проводившихся при исходной, промежуточной и финальной оценке 139
4.5.4 Терапия и модификация доз 140
4.5.5 Результаты 143
4.5.5.1 Характеристика больных 143
4.5.5.2 Характеристика осложнений 144
4.5.5.3 Ответ на лечение и выживаемость 145
4.5.5.4 Вторые опухоли 146
4.5.6 Обсуждение 148
4.5.7 Заключение 150
4.6 Исследование коморбидности 151
4.6.1 Введение 151
4.6.2 Анализ сопутствующих заболеваний 152
4.6.3 Сравнение индексов М. Charlson и КИК. Анализ выживаемости 158
4.6.4 Анализ частоты инфекций, нейтропении и кардиальных осложнений в зависимости от индексов коморбидности 163
4.6.5 Список значимых болезней 165
4.6.6 Обсуждение 168
4.6.7 Выводы 172
4.7 Историческое сравнение выживаемости больных ХЛЛ 173
5 Заключение 176
5.1 Выводы 180
6 Список работ, опубликованных по теме диссертации 181
7 Литература 189
8 Приложение. Характеристика и порядок исследования индексов коморбидности 203
- Определение минимальной остаточной болезни при хроническом лимфолейкозе: методы, принципы и значение
- Полная ремиссия с неполным восстановлением костного мозга/полная цитопеническая ремиссия
- Сравнение двух методов – аллель-специфичной ПЦР и 4-цветной проточной цитофлуориметрии
- Перечень исследований, проводившихся при исходной, промежуточной и финальной оценке
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) – самый частый вид лейкоза у взрослых. Частота его составляет 2 - 4:100 000 в год и непосредственно связана с возрастом ]. У лиц старше 80 лет она составляет >30:100 000 в год. В настоящее время хронический лимфолейкоз неизлечим. С учетом того, что большинство заболевших – пожилые люди, цели лечения часто в большей мере определяются возрастом, числом и тяжестью сопутствующих заболеваний, нежели биологическими характеристиками опухолевых клеток. Вследствие этого распределение пациентов на терапевтические группы должно учитывать соматический статус, число и тяжесть сопутствующих заболеваний.
В последние десятилетия в мире происходят значительные демографические перемены. В соответствии с докладом всемирной ассамблеи по старению 2002 года темпы процесса старения населения являются беспрецедентными [2]. Доля пожилых людей ежегодно увеличивается на 2%. К 2050 году число пожилых людей в мире впервые в истории превысит общую численность молодежи. Соответственно этому процессу меняется и отношение медицинского сообщества к пожилому пациенту с онкологическим заболеванием. Многие устоявшиеся каноны прошлого пересматриваются. Сегодня уже доказано, что переносимость пациентом химиотерапии, а также вероятность достижения полной ремиссии зависят не столько от хронологического, сколько от биологического возраста ]. При хроническом лимфолейкозе ключевым препаратом, составляющим основу комбинированной терапии у молодых пациентов, является флударабин. Флударабин-содержащие режимы наиболее эффективны, но и токсичны, что ограничивает возможности их применения у пожилых. В исследование CLL8 немецкой группы по изучению ХЛЛ включались только пациенты с клиренсом креатинина более 70 мл/мин и индексом по кумулятивной шкале коморбидности менее 6 ]. Различий в эффективности у пациентов старше и моложе 70 лет не было. Таким образом, отсутствие значимых сопутствующих заболеваний и адекватная почечная функция позволяют использовать флударабин-содержащие режимы в полном
объеме и добиваться качественных ремиссий независимо от возраста. У очень
пожилых пациентов со множеством сопутствующих заболеваний цель лечения
может быть паллиативной, во избежание неоправданной токсичности. Но где
граница и каким образом сегодня может быть определено понятие «пожилой
пациент»? На основании какой шкалы возможно разграничение пожилых и
молодых пациентов в клинических исследованиях? Каким образом
идентифицировать пожилых пациентов в повседневной клинической практике, у которых проведение флударабин-содержащих режимов небезопасно?
Предложено много шкал для оценки числа и тяжести сопутствующих заболеваний. Лучше всего апробирована в клинических исследованиях шкала «кумулятивный индекс коморбидности» (КИК). Эта шкала основана на оценке 14 систем, в каждой из которых установлено пять степеней тяжести ]. По сравнению с другими шкалами кумулятивный индекс коморбидности наиболее воспроизводим. Опубликовано несколько исследований по изучению КИК у пациентов с онкологическими заболеваниями ] и одно у пациентов с лимфомами ], но все эти пациенты не получали флударабин и ритуксимаб. Характер токсичности этих препаратов отличается от токсичности алкилирующих цитостатиков и антрациклинов. Не ясно, в какой степени кумулятивный индекс коморбидности позволяет дифференцировать больных, у которых целью лечения должно быть достижение ремиссии, и больных, которые обрекаются нами на паллиативное лечение.
Стандартным терапевтическим выбором у пожилых пациентов до сих пор является хлорамбуцил. Показано, что добавление ритуксимаба к хлорамбуцилу повышает эффективность и не сопровождается значительным увеличением токсичности ]. Вместе с тем эффективность комбинации хлорамбуцила и ритуксимаба невысока. У большинства пациентов рецидивы развиваются в течение 2 лет. Возможность оптимизации применения флударабина у пожилых пациентов с высоким индексом коморбидности ранее никогда не исследовалась в рамках рандомизированных исследований. Оптимальный способ лечения пожилых больных с ХЛЛ не определен.
Выживаемость больных ХЛЛ колеблется в широких пределах (от 2 лет до
продолжительности жизни, сопоставимой с общепопуляционной). Такое
различие в течении болезни, в том числе у молодых больных, где хронический
лимфолейкоз является основной причиной смерти, демонстрирует большую
гетерогенность патогенеза ХЛЛ. Возможно, речь идет о существовании
нескольких болезней в пределах группы, которая сегодня называется
«хронический лимфолейкоз». Множество патогенетических путей приводит к
одному последствию – накоплению лимфоцитов с характерным,
повторяющимся фенотипом. Необходимы маркеры, которые позволяли бы стратифицировать пациентов на группы риска. Эти маркеры не должны быть связаны с массой опухоли, возрастом пациента и другими факторами, не имеющими непосредственного отношения к патогенезу. Они должны отражать истинную биологическую гетерогенность хронического лимфолейкоза. Многие факторы прогноза, которые были идентифицированы до появления флударабина, в настоящее время потеряли свое значение ]. Разработанная недавно технология анализа свободных сывороточных легких цепей открывает новый интересный аспект патогенеза ХЛЛ. Соотношение свободных легких цепей никогда не исследовалось в рамках проспективных исследований ХЛЛ. Выявление факторов, значимых при терапии флударабин-содержащими режимами, подразделение пациентов на биологически гетерогенные группы риска и создание новой прогностической шкалы является важнейшей задачей исследования ХЛЛ.
У большинства молодых пациентов ХЛЛ современная терапия приводит к
достижению клинической ремиссии, при которой остаточную опухоль
невозможно выявить физикальным исследованием, ультразвуковыми методами,
компьютерной томографией, а также гистологическим и цитологическим
исследованием. Необходимость в измерении оставшейся опухоли, когда
количество ее находится за пределами возможностей детекции
общеклиническими методами, привело к разработке методов оценки минимальной остаточной болезни (МОБ). Эти технологии нуждаются во
всестороннем изучении. Необходимы данные о частоте эрадикации МОБ при терапии флударабином и моноклональными антителами, исследование оценки МОБ на разных этапах лечения, возможность оптимизации лечения в зависимости от результатов МОБ.
Флударабин-содержащие режимы не безопасны. Главными осложнениями
этих режимов являются инфекции и миелотоксичность ]. Как правило,
наиболее опасны три цикла терапии – первый, пятый и шестой. Если первый
курс опасен инфузионными реакциями, цитопенией, синдромом лизиса
опухоли, то пятый и шестой циклы часто осложняются цитопениями и
инфекциями. Оптимальная продолжительность лечения не определена.
Эффективность комбинированной схемы FCR (флударабин, циклофосфан,
ритуксимаб) настолько высока, что у ряда пациентов полный ответ с
эрадикацией минимальной остаточной болезни достигается уже после 2–3-го
цикла. Нуждаются ли эти пациенты в шести циклах терапии? Возможность
сокращения числа циклов на основании результатов МОБ никогда не
исследовалась.
Таким образом, в настоящее время необходим пересмотр всей тактики ведения пациентов с хроническим лимфолейкозом. Решению этих вопросов посвящена данная работа.
Цель и задачи исследования
Цель исследования: разработка дифференцированной терапии хронического лимфолейкоза, учитывающей соматический статус пациента и биологические характеристики болезни.
Задачи исследования:
-
Подобрать оптимальный метод определения минимальной остаточной болезни и исследовать ее значение в прогнозировании длительности ремиссии у больных, получающих режим FCR (флударабин, циклофосфан, ритуксимаб).
-
Исследовать возможность редукции числа циклов FCR у пациентов с
полным ранним ответом во избежание ненужной токсичности.
-
Исследовать значение сывороточных и генетических маркеров в прогнозировании качества и длительности ответа у больных, получающих режим FCR.
-
Провести сравнительное рандомизированное исследование режимов FCR-Lite и ClbR у пожилых пациентов с высоким индексом коморбидности.
-
Исследовать значение различных шкал коморбидности, оценивающих число и тяжесть сопутствующих заболеваний для определения токсичности и эффективности терапии.
-
Провести ретроспективное историческое сравнение выживаемости больных хроническим лимфолейкозом.
Научная новизна исследования
-
Впервые проведено сравнительное рандомизированное исследование режимов FCR-Lite (дозоредуцированный режим, содержащий флударабин, циклофосфан и ритуксимаб) и ClbR (хлорамбуцил и ритуксимаб).
-
Впервые проведен анализ сывороточных свободных легких цепей в рамках проспективного исследования.
-
Проведено исследование значения минимальной остаточной болезни, определяемой методом 4-цветной проточной цитофлуориметрии. На момент начала работы не были опубликованы работы, изучавшие минимальную остаточную болезнь методом 4-цветной проточной цитофлуориметрии в рамках проспективных иccледований.
-
Впервые исследована возможность сокращения числа циклов терапии на основании результатов оценки минимальной остаточной болезни.
-
Предложена новая схема стратификации пациентов на группы риска, основанная на сывороточных маркерах. Общепринятой стратификации больных ХЛЛ на группы риска не разработано. Множество факторов
прогноза утеряли свое значение с разработкой более эффективных комбинированных схем терапии. Нами показано, что сывороточные маркеры и хромосомные нарушения могут служить надежным способом подразделения больных. 6. Впервые изучено значение числа и тяжести сопутствующих заболеваний у больных хроническим лимфолейкозом. Показано, что коморбидность влияет на исход и должна быть охарактеризована в клинических исследованиях.
Научно-практическая ценность
Разработана тактика ведения хронического лимфолейкоза, учитывающая биологические характеристики опухоли, а также соматический статус пациента. Оценка минимальной остаточной болезни в модифицированной в данной работе методике широко практикуется в Москве. Редукция числа циклов FCR до 4 у больных с полным ранним ответом также нашла свое применение в г. Москва. Режимы СlbR и FCR-Lite используются в лечении пожилых пациентов ХЛЛ в России. В гематологическом сообществе уделяется все больше внимания оценке коморбидности и определению понятия «пожилой пациент». Результаты работы используются в лекционном курсе по онкогематологии на кафедре Гематологии и трансфузиологии Российской медицинской академии последипломного образования.
Положения, выносимые на защиту
-
Режим FCR позволяет достигать полных ремиссий у больных хроническим лимфолейкозом. Более чем у 40% пациентов опухолевые клетки не определяются в крови и костном мозге при чувствительности метода 1 x 10-4. Режим FCR увеличивает продолжительность жизни больных.
-
Количественная оценка минимальной остаточной болезни в крови при финальной оценке предсказывает длительность ремиссии.
-
Содержание свободных легких цепей в сыворотке имеет прогностическое значение. Сочетанная оценка свободных легких цепей и бета-2-микроглоблина может использоваться в качестве прогностической модели.
-
Сокращение числа циклов у больных без отрицательных факторов риска, достигающих эрадикации МОБ после второго цикла, не уменьшает длительность ремиссии.
-
Во всех клинических исследованиях ХЛЛ должны быть охарактеризованы сопутствующие заболевания.
-
Кумулятивный индекс коморбидности не является адекватным способом стратификации больных ХЛЛ в клинических исследованиях.
Апробация работы
Результаты исследований по диссертационной работе представлены на российских и международных конференциях и конгрессах. По результатам работы были сделаны устные доклады на конференциях «Злокачественные лимфомы” (Москва, 2011, 2012, 2013 г), на Конгрессе гематологов России (Москва, 2012), на конференциях «Лимфорум» (Москва, 2011, 2012, 2013 г), European Association of Hematology annual meeting (Stocholm, 2013), Workshop on CLL of the German CLL Study Group (Cologne, 2012), Mabthera Forum (Prague, 2010). Результаты работы представлялись в виде тезисов на International Workshop on CLL meeting (Houston, 2011) и многочисленных российских конференциях.
По материалам диссертации опубликовано 32 статьи в русскоязычных журналах, 9 статей в международной печати, 3 главы в руководствах, 1 методические рекомендации и 32 тезиса на российских и международных конференциях.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 221 странице и содержит 13 рисунков, 11
графиков, 42 таблицы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, приложения и списка литературы, включающего 222 источника.
Определение минимальной остаточной болезни при хроническом лимфолейкозе: методы, принципы и значение
Минимальная остаточная болезнь может определяться теми методами, которые превосходят по чувствительности обычный подсчет миелограммы. В костном мозге здорового человека выявляется до 30% лимфоцитов, причем морфологически они не отличаются от клеток ХЛЛ, что делает морфологическую оценку ремиссии крайне малочувствительной. Принципиально существует два способа выявления МОБ при ХЛЛ – молекулярный и иммунофенотипический. Оценка минимальной остаточной болезни при ХЛЛ возможна и по кариологическим нарушениям, выявляемым с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), однако особенность методики FISH такова, что число клеток с соответствующим сигналом в отрицательном контроле может достигать 10%. Кроме того, цитогенетические аберрации выявляются только у 70–80% больных, поэтому FISH не может применяться для определения МОБ при В-ХЛЛ. Молекулярная оценка МОБ В основе метода лежит выявление клональной популяции лимфоцитов, то есть клеток, произошедших из одной и имеющих одинаковые вариабельные регионы генов иммуноглобулинов. Вариабельные регионы антител кодируется несколькими генами. В ранних предшественниках В-лимфоцитов и всех нелимфоидных клетках эти гены лежат отдельно друг от друга на большом по протяженности участке хромосомы 14. Только в лимфоцитах на ранних этапах созревания происходят физиологические перестройки генов иммуноглобулинов, в результате чего в каждом В-лимфоците из большого числа генетических сегментов (V, D и J) формируется уникальный вариабельный регион, кодирующий антигенсвязывающий участок (рис. 1). Двух лимфоцитов с одинаковым вариабельным регионом не возникает, потому что: 1) перестройки происходят случайно, 2) в них участвует много V, D и J-сегментов, 3) механизмы разрыва и сшивания сегментов разнообразны.
Вариабельный регион тяжелой цепи иммуноглобулина кодируется тремя группами генов. Первая обозначается VH – variability (разнообразие), вторая DH – diversity (разнообразие), третья JH – joining (соединение). Вариабельный регион одной конкретной тяжелой цепи кодируется одним из VH-генов, одним из DH-генов и одним из JH-генов. Белковая последовательность вариабельного региона антитела образует три петли, вершины которых (CDR, complementarity determining region) непосредственно связывают антиген, а промежуточные или каркасные районы FWR (framework) удерживают петли. Как и все опухоли, ХЛЛ возникает из одной клетки, поэтому все клетки опухолевого клона ХЛЛ содержат абсолютно одинаковый вариабельный регион. МОБ выявляют с помощью ПЦР. Праймеры подбирают так, что один из них комплементарен VH-гену, а другой – JH-гену (рис. 2). Результат ПЦР оценивают разными способами, но наиболее нагляден фрагментный анализ. Пример определения клональности фрагментным анализом показан на рисунке 2. В случае клональности виден пик ПЦР-продукта, соответствующего одинаковым вариабельным регионам преобладающей популяции клеток. Если популяция лимфоцитов поликлональна, видно нормальное распределение длин ПЦР-продуктов. Во многих работах, где проводилось изучение МОБ, использовалась так называемая консенсусная ПЦР [69-73]. Консенсусными называют праймеры, которые комплементарны участкам, имеющимся во всех VH-генах или всех JH-генам. Все VH-гены произошли из одного общего предшественника и сохраняют некую общность, поэтому можно подобрать праймер, который будет комплементарен всем VH-генам. Такой праймер называется консенсусным. Соответственно, консенсусной называется и ПЦР. Чувствительность и специфичность консенсусной ПЦР зависят от числа поликлональных В-клеток, поскольку в ДНК из нелимфоидной ткани ПЦР не проходит вообще. В силу конкурентного характера реакции чувствительность метода колеблется в пределах от 1% до 0,1%. При пересчете на В-клетки опухолевый клон выявляется, если он составляет не менее 2% от общего числа В-лимфоцитов.
Аллель-специфичная ПЦР
Аллель-, или пациент-специфичная, ПЦР является трудоемкой и недешевой процедурой, однако благодаря индивидуализации подхода удается достичь гораздо большей чувствительности метода [74, 75]. Анализ начинают с определения клональности в образце крови, взятом до лечения. После выявления с помощью ПЦР доминирующего клона определяют его нуклеотидную последовательность. Рисунок 2. Определение клональности фрагментным анализом.
На рисунке А изображена схема вариабельного региона. Стрелками показаны позиции праймеров. Праймеры могут быть комплементарны районам FWR1, FWR2 и FWR3. На рисунке Б показан результат определения клональности у пациента с опухолью: видны пики, соответствующие одинаковым вариабельным регионам популяции опухолевых клеток. На рисунке В приводится поликлональный результат: видно нормальное распределение длин ПЦР-продуктов.
Далее подбирают клоно-специфичные (или аллель-специфичные) праймеры, которые уникальны для клона клеток В-ХЛЛ у данного пациента. Результаты аллель-специфичной ПЦР можно выявлять в геле или на приборах для ПЦР в реальном времени. ПЦР-РВ позволяет количественно оценить размер опухолевого клона. Чувствительность АС-ПЦР составляет 1:10 000 – 1:100 000. В отличие от консенсусной ПЦР она мало зависит от примеси поликлональных В-лимфоцитов, поскольку праймеры подходят вариабельному региону только опухолевого клона, а не всех В-лимфоцитов. Bruggermann и соавт. удалось стандартизировать АСО-ПЦР, так что это исследование можно сделать у 90% больных, по крайней мере при острых лейкозах [72].
Проточная цитофлуориметрия
Характерный иммунофенотип клеток ХЛЛ позволяет оценивать минимальную остаточную болезнь с помощью проточной цитофлуориметрии. Ранние методы оценки МОБ основывались на анализе связывания с клетками ХЛЛ двух антител с разными красителями (CD19 с фикоэритрином и CD5 с FITC) [69]. В ранних работах иммунофенотипическая ремиссия определялась как менее 25% CD19/CD5 клеток от общего числа лимфоцитов, однако CD5/CD19+ клетки выявляются в норме [76]. Использовалась и другая комбинация – CD20 и CD5 [11] с чувствительностью 5–10%. Включение в анализ антител к каппа- или лямбда-цепям иммуноглобулина не решало проблему: из-за того, что нормальные В-лимфоциты экспрессируют каппа- и лямбда-цепи, вычленить небольшую примесь опухолевых клеток было невозможно. Существенное (до 1%) повышение чувствительности было достигнуто при одновременном использовании трех антител: CD5, CD23 и либо CD20, либо CD19 [77].
Наиболее чувствительным методом оценки МОБ с помощью иммунофенотипирования является одновременная 4-цветная проточная цитофлуориметрия с использованием антител к CD5, CD19, CD20 и CD79b [68]. В основе метода лежит последовательное вычленение опухолевой популяции из других и одновременная оценка коэкспрессии 4 антител. На первом этапе по CD19 и боковому светорассеянию определяется район В-клеток, что позволяет отсечь гранулоциты, неспецифически связывающие CD19. Далее по прямому светорассеянию выделяется популяция клеток определенного размера, что исключает из анализа клетки в состоянии апоптоза. После этого последовательно вычленяется популяция клеток ХЛЛ, коэкспрессирующих с определенной интенсивностью CD5, CD20 и CD79b. Это сочетание антител выбрано не случайно, а путем сравнения интенсивности экспрессии 12 антигенов на клетках ХЛЛ и нормальных В лимфоцитах. Интенсивность экспрессии именно этих антигенов на клетках
ХЛЛ и нормальных В-лимфоцитах различается максимально. В
периферической крови данная методика позволяет обнаружить одну клетку В-ХЛЛ из 100 000 нормальных лейкоцитов, причем чувствительность не зависит от примеси поликлональных В-лимфоцитов. В экспериментах с разведениями было показано, что методика высоковоспроизводима, если клетки В-ХЛЛ составляют 0,01% от общего числа лейкоцитов [68, 78].
При анализе клинических исследований очень важно учитывать способ определения МОБ и вариант терапии. Как видно из предшествующего изложения, чувствительность разных способов определения МОБ различается на три порядка, поэтому сравнивать результаты разных исследований можно, только если известна чувствительность метода определения молекулярной или иммунофенотипической ремиссии. Кроме того, отдаленный результат зависит от варианта лечения. Так, отдаленные результаты после проведения аутологичной и аллогенной трансплантации при В-ХЛЛ различаются очень существенно, несмотря на то, что процент больных, достигших молекулярной или иммунофенотипической ремиссии, приблизительно одинаков. Другими словами, молекулярная ремиссия после аутологичной трансплантации – не то же самое, что молекулярная ремиссия после аллогенной. После аллогенной трансплантации МОБ, как правило, поначалу выявляется, особенно при использовании немиелоаблативных режимов кондиционирования. Эрадикация МОБ происходит постепенно, через несколько месяцев c достижением химеризма. Стойкое выявление МОБ после аутологичной трансплантации говорит о неизбежности рецидива. При терапии алкилирующими препаратами полные клинические ремиссии достигают 10–25% больных. Добиться эрадикации минимальной остаточной болезни невозможно. Иммунофенотипические и молекулярные ремиссии при ХЛЛ стали реальностью только с появлением пуриновых аналогов и моноклональных антител. Клинические исследования, в которых оценка минимальной остаточной болезни проводилась сравнительно малочувствительными методами, суммированы в таблице 2.
Полная ремиссия с неполным восстановлением костного мозга/полная цитопеническая ремиссия
При персистировании цитопении более 3 месяцев, картине гипоплазии или аплазии в костном мозге, взятом через 3 месяца от даты последнего курса, отрицательных результатах тестов на МОБ, отсутствии увеличенных лимфоузлов и органов констатировали полную цитопеническую ремиссию. Отрицательный результат оценки МОБ и отсутствие лимфатической инфильтрации в костном мозге – обязательные критерии ПРц. В таких случаях дожидались восстановления показателей крови и повторяли трепанобиопсию или выполняли ее в любом случае через 6 месяцев, для того чтобы прояснить природу цитопении.
Этот ответ констатировали у больных в полной клинической ремиссии, у которых в костном мозге выявлялась остаточная нодулярная лимфоидная инфильтрация. Данный показатель оказался важен при сравнении эффективности режимов FCR-Lite и ClbR.
Частичную ремиссию констатировали при наличии по крайней мере одного из следующих клинических критериев:
1. снижение уровня лимфоцитов более чем на 50% по сравнению с уровнем до лечения;
2. уменьшение лимфоузлов более чем на 50%, отсутствие новых лимфоузлов:
сокращение более чем на 50% размера суммы наибольших диаметров лимфоузлов; при наличии множественной лимфаденопатии в оценку включали шесть демонстративных лимфатических узлов (если увеличено менее шести лимфатических узлов, учитывали все);
отсутствие новых лимфатических узлов;
отсутствие роста ранее увеличенных лимфатических узлов; если размер лимфатического узла увеличивается на 25%, но не превышает 2 см, такое увеличение не считали значимым;
3. уменьшение размеров печени и селезенки более чем на 50%, считая от величины, на которую эти органы были увеличены исходно; если отмечалось увеличение селезенки при уменьшении размеров лимфоузлов и лимфоцитоза, констатировали прогрессию.
При оценке кроветворения необходимо наличие по крайней мере одного из перечисленных признаков:
1) гранулоциты 1500 в 1 мкл и более или повышение их числа более чем на 50% от исходного уровня без поддержки G-CSF;
2) тромбоциты 100 000 и более или повышение их числа более чем на 50% от исходного уровня без трансфузий;
3) гемоглобин 110 г/л и более или повышение его более чем на 50% от исходного уровня без гемотрансфузий и эритропоэтина.
Частичную ремиссию подтверждали дважды – через 1 месяц и через 3 месяца от даты последнего курса. Если в этом сроке наблюдались рост числа лейкоцитов, увеличение лимфоузлов/селезенки или появление цитопении, связанной с ХЛЛ, констатировали прогрессию. В данном исследовании для оценки рекомендовалось использовать КТ, но допускалось и только УЗИ. Исследование костного мозга было обязательным лишь в том случае, если частичная ремиссия констатировалась по факту цитопении.
Прогрессию констатировали при отрицательной динамике со стороны любого и по крайней мере одного проявления опухоли (рост лимфоцитоза, увеличение лимфоузлов, увеличение селезенки, нарастание цитопении). Кроме случаев с цитопенией, прогрессия констатировалась на момент возникновения. В связи с этим пациентов обследовали перед каждым следующим курсом химиотерапии, а промежуточная и финальная оценка эффекта проводилась в ГНЦ. Цитопения не могла оцениваться во время лечения. Констатация прогрессии по цитопении была возможна только по завершении терапии или при доказанных осложнениях ХЛЛ, развившихся во время лечения, – ПККА, АИГА, ИТП. Назовем шесть признаков прогрессии:
1) увеличение числа циркулирующих лимфоцитов более чем на 50%, при условии, что абсолютное число лимфоцитов в крови 5000 в 1 мкл;
2) рост ранее увеличенных лимфоузлов 50% (узел должен четко пальпироваться и быть больше 2 см), появление новых лимфоузлов 1,5 см; при множественной лимфаденопатии увеличение более чем на 50% суммы диаметров нескольких лимфоузлов;
3) увеличение селезенки и/или печени более чем на 50%, считая от величины, на которую эти органы были увеличены исходно; увеличение этих органов, если ранее их размеры являлись нормальными;
4) появление органных инфильтратов, не выявлявшихся ранее (плеврит, лейкемиды);
5) трансформация (диагностируется по биопсии лимфоузла).
6) появление анемии и/или тромбоцитопении, обусловленных инфильтрацией костного мозга (оценивается после терапии):
– снижение гемоглобина на 20 г/л и более или 100 г/л, не связанное с гемолизом; – снижение тромбоцитов более чем на 50% или менее 100 000; – доказательство наличия инфильтрации костного мозга по трепано-биопсии.
Констатация прогрессии предполагала использование КТ или УЗИ брюшной полости, однако во всех случаях прогрессии она была очевидна по физикальным данным и анализу крови.
Стабилизацию ХЛЛ констатировали у больных, которые не удовлетворяют критериям частичной ремиссии, но не имеют очевидных признаков прогрессии. Стабилизация не имела столь существенного значения в данной работе, поскольку наряду с прогрессией рассматривалась как отрицательный ответ. Этот показатель имеет ценность в исследовании новых лекарственных препаратов, когда важно уловить любой, пусть совсем малый противоопухолевый эффект. В нашем исследовании стабилизация могла быть констатирована у единичных пациентов. В большинстве случаев, когда ответ был меньше, чем частичная ремиссия, уже при следующей оценке через 2–3 месяца выявлялись увеличение лимфоузлов/лимфоцитов, нарастание цитопении. В таких случаях констатировалась прогрессия. У нескольких пациентов в протоколах MLSG08_1 и MLSG08_2 с отсутствием изменений при оценке эффекта в срок 1 и 3 месяца констатирована стабилизация. Пациенты со стабилизацией и прогрессией объединялись в одну категорию – отсутствие ответа.
Временные показатели эффективности являлись главной целью исследования. В связи с этим по завершении терапии пациентов наблюдали 1 раз в 3 месяца на протяжении 5 лет. Использовались временные показатели эффективности:
Беспрогрессивная выживаемость: интервал от первого дня терапии до одного из следующих событий:
– рецидив после полной или частичной ремиссии;
– появление признаков прогрессии на фоне терапии;
– назначение нового варианта терапии по поводу рецидива;
– смерть (от В-ХЛЛ, осложнений В-ХЛЛ или осложнений терапии).
Сравнение двух методов – аллель-специфичной ПЦР и 4-цветной проточной цитофлуориметрии
Выбор оптимальной методики оценки минимальной остаточной болезни сделан на первом этапе протокола. В сравнительное исследование были включены 60 пациентов (37 мужчин и 23 женщины, возраст от 45 до 74 лет). Все пациенты проходили скрининговое, промежуточное и финальные обследование в рамках протокола MLSG08. Образцы периферической крови на МОБ были взяты до начала лечения, после третьего и шестого циклов терапии. Оценка МОБ определялась параллельно двумя методами: пациент специфичной ПЦР и 4-цветной проточной цитофлуориметрией. Контрольную группу составили 10 здоровых доноров. Описание методик оценки МОБ с помощью аллель-специфичной ПЦР и 4-цветной проточной цитофлуориметрией представлены в разделе «Материалы и методы». У 8 из 60 включенных в исследование пациентов (13,3%) провести прямое секвенирование генов IgH не удалось. У 52 пациентов (86,7%) была определена нуклеотидная последовательность генов IgH и подобраны аллель-специфичные олигонуклеотиды (АСО). Примеры подбора праймеров представлены в таблице 12. АСО подбирались к CDR3, гипервариабельной области соединения V-D-J сегментов. У 29 из 52 пациентов (55,8%) удалось подобрать АСО с первого раза, у 18 пациентов из 52 (34,6%) первый праймер оказался неудачным (отсутствовал или был низкий подъем кривой ПЦР, и/или ложноположительные реакции). Если изменение состава реакционной смеси и температурного режима ПЦР не приводили к повышению специфичности, подбирался второй АСО к CDR3. Всего для 52 пациентов было подобрано 76 праймеров. У 7 из 52 пациентов (1,35%) так и не удалось подобрать «работоспособный» праймер. У части пациентов (3 из 7) мы связывали ложноотрицательные результаты с неудовлетворительной работой праймера. В качестве стандарта качества работы олигонуклеотидов вычисляли отношение номера цикла подъема кривой ПЦР-РВ с контрольным геном IGF до лечения и c ACO до лечения (Ct(IGF до)/ Ct(ACO до)). При удовлетворительном качестве подобранных олигонуклеотидов такое отношение примерно было равно единице (0,76–1,38), то есть у этих двух кривых практически совпадало начало подъема флуоресценции. Если подъем флуоресценции АСО запаздывал (Ct(IGF до)/ Ct(ASO до) 1,5), это свидетельствовало о неадекватной работе праймера. Назовем причины неудач при проведении ПЦР-РВ с аллель-специфичными олигонуклеотидами:
1) у одного пациента практически отсутствовал CDR3 (пациент 14, табл.12) и праймер работал неспецифично, то есть давал ложноположительные реакции с отрицательными контролями;
2) у одного пациента (пациент 13, табл. 12) нуклеотидная последовательность CDR3 содержала большое количество G и C оснований, что затрудняло подбор праймера, а подобранный АСО давал низкий и поздний, по отношению к контрольному гену IGF, подъем флуоресценции при ПЦР-РВ; Ct(IGF до)/ Ct(ASO до) = 2,1;
3) у двух пациентов, подобранные АСО также давали поздний, по отношению к IGF, подъем флуоресценции при ПЦР-РВ, что стало причиной ложноотрицательных результатов; Ct(IGF до)/ Ct(АСО до) =1,54 и 1,62;
4) у трех пациентов, несмотря на подбор нескольких вариантов праймеров, получить ПЦР-продукт в образцах, взятых при промежуточной или финальной оценке, не удалось. Мы предполагаем, что в этих случаях последовательность CDR3 была изменена за счет мутаций, обусловленных активной соматической гипермутацией или иным механизмом. Последовательность CDR3 более не соответствовала определенной ранее последовательности гипервариабельного участка CDR3.
Таким образом, общее число пациентов, у которых так и не удалось определить МОБ методом АСО-ПЦР-РВ, составило 15 из 60 (25%): у восьми больных не удалось определить последовательность клонального вариабельного региона IgH, у семи не удалось подобрать аллель-специфичный олигонуклеотид. Пример определения МОБ методом ПЦР-РВ с помощью АСО. Показаны результаты амплификации в образцах, взятых до лечения, после третьего курса, после шестого курса ПХТ. Рост кривой флуоресценции после 40-го цикла совпадает с высокой вероятностью неспецифической амплификации, поэтому появление флуоресценции на 40–45-м циклах расценивалось как положительный результат без возможности количественной оценки. Появление кривой флуоресценции после 45-го цикла расценивалось как отрицательный результат. 4.2.2 Оценка результатов АСО-ПЦР-РВ. Количественная оценка МОБ методом АСО-ПЦР-РВ проведена у 45 пациентов c ХЛЛ, у которых было сделано 55 исследований. Результат оценки МОБ считали отрицательным, если число опухолевых клеток было менее 10-4 , то есть если на 10 000 лейкоцитов определялось менее 1 опухолевой клетки. Подсчет минимальной остаточной болезни осуществлялся относительно иcходного уровня опухолевых клеток. В образцах, взятых до лечения, доля опухолевых клеток приближалась к 100%. Во-первых, исходное содержание лимфоцитов в образцах крови составляло 85%±8%. Во-вторых, ДНК выделяли из фракции мононуклеаров, представленной практически только лимфоцитами. После лечения минимальная болезнь определялась во фракции лейкоцитов. Результаты нормировали относительно контрольного гена «домашнего хозяйства» IGF, который экспрессируется во всех клетках крови и костного мозга. Остаточные клетки ХЛЛ были обнаружены в 30 образцах из 55 (54,5%). В 25 (45,5%) результат определения МОБ был отрицательный, то есть менее 10-4 опухолевых клеток.
Перечень исследований, проводившихся при исходной, промежуточной и финальной оценке
Если на 28-й день цикла имеется глубокая цитопения, начало следующего цикла задерживают до 2 недель.
1. При уровне нейтрофилов 2000 в 1 мкл или тромбоцитов 50 000 в 1 мкл начало курса откладывается до 2 недель. При восстановлении показателей лечение продолжается в тех же дозах.
2. Если восстановление показателей происходит к 4-й неделе, дозу флударабина (перорального) редуцировали до 20 мг/м2 ИЛИ следующий курс FCR-lite проводили в 2-дневном формате.
3. При глубокой персистирующей цитопении, обусловленной, по мнению лечащего врача, именно токсическим действием химиотерапии (нейтрофилы 500 клеток, тромбоциты 20 000 или наличие геморрагического синдрома), лечение отменяли до восстановления показателей. Возобновление терапии – по решению лечащего врача.
При снижении гемоглобина и тромбоцитов на 50–74% от исходного уровня дозу флударабина снижали до 20 мг/м2 (перорально). Альтернативно, режим FCR-Lite проводили в 2-дневном формате. Если гемоглобин или тромбоциты снижались более чем на 75% от исходного уровня (например, падение гемоглобина со 120 г/л до 30 г/л), вопрос о продолжении терапии решался индивидуально. Модификация доз ритуксимаба не проводилась, Допускалось разделить дозу ритуксимаба на два введения (в 1-й и 2-й день).
Схема редукции доз по поводу миелосупрессии при проведении режима хлорамбуцил + ритуксимаб.
В случае цитопении к началу следующего цикла дожидались восстановления показателей крови. Допускалась задержка в 4 недели. При развитии нейтропении III–IV степени дозу хлорамбуцила редуцировали до 50% (5 мг/м2). Если, несмотря на редукцию дозы, цитопения сохранялась, дозу хлорамбуцила редуцировали до 4 мг/м2. Схема редукции доз хлорамбуцила по поводу анемии и тромбоцитопении, наблюдаемой в межкурсовом промежутке, представлена в таблице 27.
При развитии инфекции в межкурсовом промежутке очередной цикл не начинали до ее полного разрешения. Допустимая задержка с началом следующего цикла составляла 4 недели. Если инфекция не завершилась к 4-й неделе, вопрос о продолжении терапии решали индивидуально. При развитии одного эпизода сепсиса лечение прекращали до полного купирования инфекции. Если имелась возможность продолжить терапию, FCR-lite проводили в 2-дневном формате, в схеме ClbR дозу хлорамбуцила снижали на 50%. При развитии тяжелых инфекций на последующих курсах назначали профилактическую антибактериальную терапию. Для профилактики тошноты и рвоты назначали метоклопрамид 2 раза в день по 1 ампуле (или другой противорвотный препарат) в дни введения FC или хлорамбуцила при необходимости. Все больные получали сопроводительную терапию бисептолом в дозе 480 мг 2 раза в день 3 раза в неделю. Профилактическое назначение ацикловира (1200 мг в сутки) или валтрекса (500 мг в сутки) ежедневно было показано пациентам, у которых наблюдался хотя бы один эпизод инфекции, вызванной H. zoster или H. simplex.
Если во время лечения у пациента наблюдался один эпизод бактеральной инфекции или фебрильной нейтропении, рекомендовалось добавление левофлоксацина по 250 мг с 7-го по 12-й день цикла. G-CSF назначался по решению лечащего врача. Перед первым курсом всем больным назначали аллопуринол в дозе 300 мг в день за 48 часов до введения химиопрепаратов и пероральную гидратацию. При нарастающей в динамике анемии и исключении гемолиза рекомендовалось назначение эритропоэтина.
В исследование были включены 100 больных. Характеристика пациентов представлена в таблице 28. 49 больных были рандомизированы на режим ClbR и 51 пациент на режим FCR-Lite. Медиана кумулятивного индекса коморбидности была 8 в обеих группах (разброс от 1 до 17). По 20% больных в каждой группе имели стадию С. Никаких различий в распределении хромосомных нарушений не было. 78% больных в группе ClbR и 73% в группе FCR-Lite имели вариант ХЛЛ без мутаций VH-генов. Уровень бета-2-микроглобулина превышал 4 мг/л примерно у 70% больных в каждой группе.
Один пациент отозвал информированное согласие. Один пациент, рандомизированный на режим FCR-Lite, умер от пневмонии до первого цикла терапии. Три пациента были сняты с протокола из-за ухудшения сопутствующего состояния, не завершив первый цикл терапии. Таким образом, анализу токсичности и эффективности доступны 95 больных.
В группе FCR-Lite пациенты получили в среднем 5,1 курса химиотерапии, а в группе ClbR – 5.4 цикла (табл. 29). Все шесть циклов химиотерапии были завершены у 34 пациентов в группе ClbR (69%) и у 36 больных в группе FCR-Lite (77%). Это различие объясняется неодинаковым числом пациентов, снятых с протокола раньше срока из-за прогрессии. По этой причине были сняты с лечения пять пациентов в группе ClbR и только один пациент в группе FCR-Lite. Из других причин преждевременного завершения протокола была токсичность 3–4-й степени (девять пациентов в группе ClbR и восемь пациентов в группе FCR-Lite), а также вторые опухоли (двое больных в группе FCR-Lite).
Частота всех миелотоксических осложнений была выше в группе FCR-Lite (45%), чем в группе ClbR (34,8%), хотя различия не достигли статистической достоверности (табл. 30_1). Различий в частоте нейтропении 3–4-й степени тяжести не было (38% в группе FCR-Lite и 32% в группе ClbR, p=0,7), анемии (4,4% против 4%) и тромбоцитопении (8,8% против 10,6%), соответственно.
Всего было зарегистрировано 18 случаев тяжелых инфекций (8 бактериальных, 3 вирусные и 7 случаев неуточненных инфекций). Частота инфекций в группах сравнения не различалась (22% в группе FCR-Lite и 17% в группе ClbR (p=0,7) (табл. 30_2).
Их других событий у шести пациентов наблюдались тяжелые реакции на ритуксимаб (по три пациента в каждой группе), у одного пациента развились судороги на фоне приема хлорамбуцила и у одной пациентки после последнего цикла FCR-Lite развился тромбоз глубоких вен бедра, потребовавший стентирования. Другие токсические осложнений 3–4-й степени суммированы в таблице 30_2.
