Содержание к диссертации
Введение
Глава.1. Обзор литературы
1.1. Эпидемиология туберкулеза у детей- подростков 15
1.2. Туберкулиновая диагностика туберкулезной инфекции у детей и подростков 17
1.3. Возрастные особенности туберкулезного инфицирования у детей 22
1.4. Механизмы иммунологической резистентности к туберкулезной инфекции 24
1.4.1. Субпопуляция гамма-дельта уб Т-лимфоцитов 32
1.5. Методы иммунологической диагностики туберкулезной.инфекции 34
1.6. Лечение туберкулеза и иммунный ответ 40
1.6.1.Интерферон-гамма как фактор иммунологической резистентности к туберкулезной инфекции 42
1.7. Иммунотерапия-туберкулезной инфекции 45
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Характеристика клинического материала 52
2.2. Описание методов исследования 72
2.2.1. Антиген-специфическая индукция иммунного ответа ex vivo 72
2.2.2. Фенотипические методы исследования Т-лимфоцитов 74
2.3. Методика использования иммунотерапевтического препарата «Аффи нолейкин» в комплексном лечении туберкулеза легких у подростков 75
Глава 3. Разработка методов иммунодиагностики и контроля иммунного ответа при туберкулезной инфекции у детей и подростков на основе антиген-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов интерферона-гамма (ИФН-у) и фактора некроза опухоли альфа (ФНО-а)
3.1. Разработка-метода иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения интерферона-гамма (ИФН-у) 80
3.2. Разработка тест-системы для определения антиген индуцированного факторанекроза опухоли-альфа (ФНО-а) 87
Глава 4. Эффективность применения тест-системы «Тубинферон» -индукция IFN-y в образцах цельной крови ex vivo специфическим рекомбинантным антигеном ESAT-6 92
Глава 5. Изучение специфического клеточного иммунного ответа в образцах цельной крови ex vivo у больных туберкулезом легких в процессе противотуберкулезной химиотерапии
5.1. Антиген-индуцированная продукция ИФН-у в образцах цельной крови в присутствии туберкулина PPD и специфического антигена ESAT-6 115
5.2. Иммунофенотипирование Т-клеточных субпопуляций при индукции иммунного ответа к специфическим антигенам МБТ в образцах цельной крови ex vivo 124
5.3. Факторы клеточного иммунного ответа в оценке активности туберкулезной инфекции 132
5.3.1. Антиген-индуцированная продукция фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а) в образцах цельной крови exvivo 132
5.3.2.Антиген-индуцированная продукция перфорина в популяции цитотоксических (CD8) Т-лимфоцитов 142
Глава 6. Применение и иммунологический анализ эффективности иммунотерапевтического препарата «Аффинолейкин» при туберкулезе легких 150
Заключение 162
Выводы 177
Практические рекомендации 180
Список литературы 183
- Туберкулиновая диагностика туберкулезной инфекции у детей и подростков
- Разработка-метода иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения интерферона-гамма (ИФН-у)
- Антиген-индуцированная продукция ИФН-у в образцах цельной крови в присутствии туберкулина PPD и специфического антигена ESAT-6
- Применение и иммунологический анализ эффективности иммунотерапевтического препарата «Аффинолейкин» при туберкулезе легких
Введение к работе
Актуальность проблемы. Эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации среди детей и подростков остается весьма напряженной (Аксенова В.А., 2007, Перельман М.И., Михайлова Ю.В., 2008, Шилова М.В., 2008, 2009). Показатель заболеваемости туберкулезом детей и подростков является наиболее чутким индикатором состояния эпидемиологической обстановки. Заболеваемость детей до 14 лет составляет, по данным М.В.Шиловой за 2009 г., 15,4 чел. на 100 тыс. детского населения, а заболеваемость подростков в 2,3 раза выше - 36,0 на 100 тыс. чел. соответствующего возраста. При этом 84,9% случаев приходится на туберкулез легких. Число деструктивных форм туберкулеза легких у подростков составляет 36,8%. В этой возрастной группе отмечается также весьма высокий уровень множественной лекарственной устойчивости.
Современная диагностика первичной туберкулезной инфекции у детей обеспечивается, в основном, с помощью применения туберкулиновых кожных тестов. Инфицированность микобактериями туберкулеза (МБТ) определяется по конверсии («вираж») кожных туберкулиновых проб от отрицательной к положительной. Однако недостаточная специфичность туберкулиновой пробы, отсутствие метода дифференцирования первичного туберкулезного инфицирования от поствакцинальной аллергии не позволяют определить туберкулезную инфекцию с необходимой эффективностью. Недостаточная эффективность диагностики первичной туберкулезной инфекции у детей и подростков, при отсутствии своевременно проводимых профилактических курсов химиотерапии, приводит к развитию локальных форм туберкулеза, главным образом, туберкулеза легких.
Современные методы исследования специфического клеточного иммунного ответа детей и подростков, инфицированных МБТ и больных различными формами туберкулеза, позволяют усовершенствовать диагностику первичной туберкулезной инфекции, значительно повысив ее специфичность, оценить уровень иммунного ответа при различном характере течения туберкулеза легких, а также на основе новых знаний выявить новые подходы к иммунотерапии туберкулеза, которые могут быть использованы в качестве дополнительных по отношению к этиотропной химиотерапии, с целью повышения эффективности лечения пациентов.
Провоспалительные цитокины - интерферон-гамма (ИФН-у) и фактор некроза опухолей -альфа (ФНО-а) представляют собой ключевые факторы протективного иммунитета при туберкулезной инфекции. На основе антиген-индуцированной продукции ИФН^у в
4 образцах цельной крови в присутствии антигенов МБТ, в том числе рекомбинантных, специфичных для M.tuberculosis антигенов ESAT-6 и CFP-10, разработаны новые тесты для определения латентной туберкулезной инфекции (Mori Т. et al., 2004). В частности, разработанные с использованием этих специфичных антигенов диагностические тест-системы QuantiFERON-TB Gold, и QuantiFERON-TB Gold In Tube (образцы крови инкубируются в пробирках), позволяют после количественного анализа ИФН-7 в образцах плазмы определить латентную туберкулезную инфекцию с высокой специфичностью. В подобной тест-системе T-SPOT.TB (Ulrichs Т. et al., 2000; Mori Т. et al., 2004) определяют количество ИФН-у продуцирующих Т-лимфоцитов.
Однако эти методы не позволяют дифференцировать латентную туберкулезную инфекцию от активного туберкулезного процесса/Кроме того, в условиях широкого, по разным оценкам 60-80%, распространения туберкулезного инфицирования в нашей стране, применение этих методов у взрослого населения представляется недостаточно эффективным. В то же время проблема дифференцирования специфической туберкулезной инфекции у детей и подростков от поствакцинальной аллергии весьма актуальна.
Лечение больных туберкулезом легких детей и подростков, особенно с распространенными формами, представляет 'значительную проблему. Несмотря на высокую эффективность (около 90%) лечения (Овсянкина Е.С., Губкина М.Ф. и соавт., 2006), длительность непрерывных химиотерапевтических курсов чрезвычайно велика (12 месяцев и более). Проблема лечения усугубляется наличием множественной лекарственной устойчивости (Емельянова Н.А. и соавт., 2009; Фирсова В.А. и соавт., 2002).
Как известно, существует ряд исследований, демонстрирующих применение различных иммунотропных препаратов в качестве дополнительных средств повышения эффективности лечения туберкулеза, в том числе у детей и подростков (Бармина Н.А., 2008; Позднякова А.С. и соавт., 2010). Однако не всегда используется важный принцип целевого применения иммуноактивного препарата, в зависимости от анализа параметров иммунного ответа у данного пациента и контроля за изменениями иммунологических реакций, ответственных за противотуберкулезный иммунитет.
В связи с этим изучение уровня антиген-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов ИФН-у и ФНО-а, а также субпопуляций Т-лимфоцитов и их специфического ответа на антигены МБТ в условиях анализа ex vivo представляется существенно важным для оценки уровня иммунологической резистентности или характера иммунопатологии при туберкулезной инфекции.
Исходя из вышеизложенного, применение вероятного эффективного иммунотропного
препарата в качестве дополнительного средства лечения туберкулеза легких должно
основано на иммунологическом слежении (мониторинге) за иммунным ответом на
антигены МБТ.
Цель исследования - повышение эффективности диагностики туберкулезной инфекции у детей и подростков на основе применения иммунологических методов исследования и лечения туберкулеза легких с использованием иммунопотенцируїощего препарата.
Задачи исследования:
-
Разработать новую отечественную тест-систему для определения туберкулезной инфекции у детей и подростков на основе антиген-индуцированной продукции интерферона-у в образцах цельной крови ex vivo. Изучить диагностическую эффективность этого метода при первичной туберкулезной инфекции у детей и подростков, в том числе возможности дифференцирования туберкулезной инфекции от поствакцинальной аллергии.
-
Изучить возможности метода антиген-индуцированной продукции интерферона-у в образцах цельной крови ex vivo для анализа уровня иммунного ответа при различных формах туберкулеза легких и в зависимости от эффективности химиотерапии туберкулеза.
-
Оценить результаты применения метода антиген индуцированной продукции факторов клеточного иммунного ответа (фактор некроза опухоли, индукция перфорина) в образцах цельной крови ex vivo для определения активности туберкулезного процесса.
-
Изучить значение иммунофенотипирования субпопуляций циркулирующих Т-лимфоцитов с анализом экспрессии различных факторов иммунологической активности противотуберкулезного иммунитета в периоде химиотерапии туберкулеза легких у подростков.
-
Разработать иммунологические обоснования и изучить эффективность применения иммунотерапевтического препарата аффинолейкина при лечении больных туберкулезом легких подростков.
Научпая новизна. 1. Разработана отечественная тест-система определения первичного туберкулезного инфицирования у детей и подростков на основе антиген-индуцированной продукции интерферона-гамма (ИФН-у) в образцах цельной крови ex vivo. Использование в качестве индуктора ИФН-у, в отличие от широко известной, международно признанной тест-системы QuantiFERON-TB-Gold, не только специфических рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10, но и туберкулина PPD, позволяет определить как первичное
туберкулезное инфицирование, так и идентифицировать поствакцинальную БЦЖ аллергию. Определен пороговый уровень концентрации ИФН-у - 70 пг/мл при индукции специфическими антигенами ESAT-6 и CFP-10, позволяющий установить первичную туберкулезную инфекцию.
2. Изучение антиген-индуцированной продукции ИФН-у при различных формах
туберкулеза легких позволило установить снижение определяемого с помощью этой
реакции уровня специфического иммунного ответа в образцах цельной крови ex vivo при
распространенных и осложненных формах туберкулеза легких у подростков. Показано
восстановление иммунного ответа в процессе эффективной химиотерапии. Отсутствие
положительной клинической динамики при торпидном характере процесса не
сопровождалось восстановлением указанной иммунологической реакции. Полученные
данные открывают возможность проведения иммунологического мониторинга с помощью
разработанной технологии.
-
При анализе антиген-индуцированного в образцах крови фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а) показан значительно более высокий уровень индукции этого провоспалительного цитокина при активном туберкулезе легких по сравнению с завершенным неактивным туберкулезным процессом или при латентной инфекции у инфицированных МБТ детей. Эти факты открывают дополнительные возможности мониторинга излечения туберкулезной инфекции у детей и подростков.
-
Полученные данные об увеличении процентного содержания субпопуляции Т-лимфоцитов, экспрессирующих ИФН-у, субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов, экспрессирующих ИФН-у, а также субпопуляции CD8+ Т-клеток, экспрессирующих перфорин, после индукции антигенами МБТ в образцах крови, при активном туберкулезном процессе по сравнению с латентной инфекцией, позволяют использовать и эти методы для мониторинга специфического иммунного ответа при туберкулезе. Также установлено, что сниженное при активном туберкулезе процентное содержание общей субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов восстанавливается при эффективной химиотерапии.
-
При контролируемом клиническом изучении иммунотерапевтического препарата аффинолейкин было показано достоверно ускоренное рассасывание инфильтративных очагов: 2,73±0,26 месяца против 3,98±0,33 месяца в контрольной группе; р=0,0025 при хорошей переносимости препарата. Открывающаяся возможность увеличения используемых доз и длительности применения аффинолейкина позволяет рассматривать его в качестве перспективного для лечения больных с распространенным туберкулезом легких.
7 6. Впервые был показан иммунопотенцирующий эффект применения аффинолейкина у больных, выразившийся в увеличении антиген-индуцированной продукции интерферона-гамма, увеличении субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов в периферической крови и снижении гамма-дельта Т-клеток, экспресссирующих ИФН-у.
Практическая значимость. Практическое значение работы состоит в том, что по итогам исследования разработана новая тест-система - набор реагентов для определения туберкулезного инфицирования, в том числе для дифференцирования туберкулезной инфекции от поствакцинальной БЦЖ-аллергии у детей и подростков. Новая диагностическая тест-система успешно прошла клинические испытания, по итогам которых рекомендована Ученым Советом ГИСК им. Л.А. Тарасевича для внедрения в практику здравоохранения и проходит необходимые этапы регистрации в качестве нового диагностического препарата.
Практическая ценность применения этой тест-системы заключается также в возможности ее использования для оценки специфического иммунного ответа у больных туберкулезом, позволяющей проводить соответствующее слежение в ходе специфического лечения и определить показания для возможного назначения иммунотерапевтических средств.
Практическая значимость работы состоит также в проведении контролируемого исследования эффективности применения нового в отношении туберкулезной инфекции, иммунопотенцирующего препарата аффинолейкина, оказывающего не только благоприятное влияние на параметры противотуберкулезного иммунитета, но и на клиническую эффективность, выразившуюся в достоверном ускорении рассасывания инфильтративных изменений легочной ткани.
Внедрение результатов исследования. Метод иммунодиагностики и контроля иммунного ответа при туберкулезной инфекции у детей и подростков на основе антиген-специфической индукции провоспалительных цитокинов интерферона-гамма (ИФН-у) в цельной крови внедрены в НИИ Фтизиопульмонологии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, научно-практическом центре «Фтизиатрия» МЗ PC (Я) г. Якутска.
Получен патент на полезную модель №79337 тест-система для иммунофермеитной диагностики «ТВ-гамма-интерферон-тест» 25 июня 2008 г.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Разработанная тест-система определения туберкулезного инфицирования на основе индукции ИФН-у в образцах цельной крови ex vivo в присутствии M.tuberculosis специфических рекомбинантных антигенов ESAT-6 и CFP-10 и определение порогового
8 диагностического уровня индукции ИФН-у позволяют установить первичную туберкулезную инфекцию и дифференцировать ее от поствакцинальной БЦЖ-аллергии с чувствительностью 96,3% при 98,0% специфичности.
2. Уровни антиген-индуцированной продукции ИФН-у в образцах цельной крови ех
vivo в присутствии туберкулина PPD и специфического рекомбинантного антигена ES АТ-
6 у больных распространенными формами туберкулеза легких значительно ниже, чем при
ограниченных формах.
Восстановление антиген-индуцированной продукции ИФН-у у больных в процессе лечения коррелирует с клинической динамикой лечеїшя. При положительной динамике лечения через 2,5-3 мес. лечения уровень антиген-индуцированной продукции ИФН-у увеличивается, тогда как при торпидном течении или отрицательной динамике этот показатель не изменяется.
-
Определение антиген-индуцированной продукции фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а) в образцах цельной крови ex vivo может быть использовано в качестве дополнительного критерия активности туберкулезного процесса у подростков.
-
Метод антиген-индуцированной продукции иммунного ответа в образцах крови ех vivo с последующим иммуяофенотипировшгаем субпопуляций у лимфоцитов позволяет более глубоко оценить характер протективного иммунитета и активность туберкулезной инфекции.
5. Применение аффинолейкина в качестве дополнительного иммунопотенцирующего
препарата в комплексном лечении больных туберкулезом легких подростков обеспечивает
повышение уровня антиген-индуцированной продукции интерферона-у и восстановление
субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов в периферической крови. В клиническом
отношении применение аффинолейкина обеспечивает также ускоренное рассасывание
инфильтративных очагов в легочной ткани.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: Российской конференции по выявлению туберкулеза (Москва, 2006), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), XVI Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006), VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006), Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов (Москва, 2006), III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006), XII международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Паттайя, Таиланд, 2007), VIII Российском съезде фтизиатров (Москва, 2007), конференции НИИФП ММА им. И.М. Сеченова «Новые методы диагностики туберкулеза» (Москва, 2008), обществе фтизиопедиатров г. Москва (2008), 39-й Всемирной конференции по туберкулезу и
9 болезням легких Международного союза борьбы с туберкулезом и другими легочными заболеваниями (Париж, Франция, 2008 г.), научно-практической конференции «Туберкулез у детей и подростков» (Москва, 2009), конгрессе «Лабораторные технологии при организации медицинской помощи» (Москва, 2010), научно-практической конференции, посвященной 60-летию создания Якутского филиала Института туберкулеза АМН СССР (Якутск, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 работы, из них 10 в журналах, включенных в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК. Получен патент на полезную модель №79337 25 июня 2008 г., заявка №2008125419/22
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, заключения и выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Текст изложен на 220 машинописных листах, иллюстрирован 41 таблицей, 32 рисунками. Список использованной литературы включает 344 источника, из них 161 отечественных, 183 зарубежных.
Туберкулиновая диагностика туберкулезной инфекции у детей и подростков
До настоящего времени единственным методом раннего выявления туберкулезного инфицирования является туберкулинодиагностика (Меве Е.Б., 1970; Митинская-ЛА., 1978, 1998, 2003; Довгалюк И.Ф., 1997; Аксенова В.А., 2001, 2002, 2007; Фирсова В.А., 2003; Овсянкина Е.С., 2001, 2004, 2006; Барышникова Л.А., 2004; Сиренко И.А. и соавт., 2004).
Туберкулинодиагностика - это совокупность диагностических тестов для определения специфической сенсибилизации организма к МВТ с использованием туберкулина - автоклавированного фильтрата культур микобактерий туберкулеза. Туберкулин - protein purified derivate (PPD) — комплекс пептидов, при условии предварительной сенсибилизации организма микобактериями в результате инфицирования или вакцинации БЦЖ вызывает специфическую реакцию, относящуюся к аллергии или гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Однако проба Манту обладает низкой специфичностью, так как применяемый очищенный белковый дериват содержит большое количество пептидных микобактериальных антигенов, свойственных как вакцинным штаммам БЦЖ, так и нетуберкулезным микобактериям. Реакция развивается, начиная с 6-8 ч., достигая максимума к 48-72 часам после введения туберкулина в виде различной выраженности воспалительного инфильтрата, клеточную основу которого составляют мононуклеарные клетки - лимфоциты и моноциты. Пусковой механизм ГЗТ -взаимодействие антигена (туберкулина) с рецепторами на поверхности клеток иммунологической памяти - лимфоцитов-эффекторов, в результате чего происходит выделение медиаторов клеточного иммунитета, в.первую очередь, хемокинов, вовлекающихся. в. очаг специфического воспаления. Туберкулинодиагностику подразделяют на массовую и индивидуальную.
Цель массовой туберкулинодиагностиюи - обследование населения- на» туберкулез.
Задачи массовой туберкулинодиагностики:
- выявление больных туберкулезом детей.и подростков;
- выявление лиц, входящих в группы риска заболевания туберкулезом для последующего наблюдения у фтизиатра: впервые инфицированные МБТ с «виражом» туберкулиновых проб, с нарастанием туберкулиновой реакции, с гиперергическими туберкулиновыми пробами, с туберкулиновыми пробами, длительно находящимися на умеренном и высоком уровнях, при необходимости - для проведения профилактического приема препаратов;
- отбор детей и подростков для проведения ревакцинации БЦЖ;
- определение эпидемиологических показателей по туберкулезу (инфицированность населения, ежегодный риск инфицирования).
Для массовой туберкулинодиагностики используют пробу Манту 2ТЕ, применяя только очищенный туберкулин-в стандартном разведении.
Индивидуальную туберкулинодиагностику используют для проведения индивидуальных обследований. Цели индивидуальной туберкулинодиагностики:
- дифференциальная диагностика поствакцинальной и инфекционной аллергии;
- диагностика и дифференциальная диагностика туберкулеза и других заболеваний;
- определение «порога» индивидуальной чувствительности к туберкулину;
- для выявления активности туберкулезного процесса;
- оценка эффективности лечения. Для? различных туберкулиновых проб применяют как очищенный туберкулин в стандартном разведении: (аллерген туберкулезный очищенный в стандартном разведении); так и, сухой очищенный туберкулин (аллерген туберкулезный очищенный сухой): Очищенный- туберкулин- в. стандартном разведении можно использовать в противотуберкулезных учреждениях, детских поликлиниках, соматических и инфекционных, стационарах. Сухой очищенный туберкулин разрешается использовать. только в противотуберкулезных учреждениях (противотуберкулезный диспансер, туберкулезный стационар или санаторий).
Пробу Манту с 2 туберкулиновыми единицами (2 ТЕ) проводят всемдетям и подросткам, вакцинированным БЦЖ, независимо от предыдущего результата раз в год. Первую пробу Манту ребенок должен- получить в- 12-месячном возрасте. Детям, не вакцинированным- БЦЖ, пробу Манту проводят с 6-месячного возраста раз в полгода до получения ребенком прививки БЦЖ, в дальнейшем — по общепринятой методике раз в год.
Противопоказания к проведению пробы Манту с 2ТЕ следующие:
- Кожные заболевания, острые и хронические инфекционные и соматические заболевания (в том числе эпилепсия) в период обострения.
- Аллергические состояния, ревматизм в острой и подострой фазах, бронхиальная астма, в стадии обострения, идиосинкразия с выраженными кожными проявлениями и в период обострения.
- Не допускается проведение туберкулиновых проб в детских коллективах, где имеется карантин по детским инфекциям. Пробу Манту не ставят в течение месяца после проведения других профилактических прививок (АКДС, прививки против кори и т.д.). Пробу Манту проводят через 1 месяц после исчезновения клинических симптомов или сразу после снятия карантина.
Результат оценивают через 72 ч. Результаты пробы могут быть отрицательными, сомнительными (инфильтрат (папула) 2-4 мм или гиперемия), положительными (инфильтрат (папула) размером 5 мм и более, наличие везикул, лимфангита, отсевов). При» проведении» индивидуальной туберкулинодиагностики используют различные туберкулиновые пробы: кожную пробу Пирке, градуированную кожную пробу Гринчара-Карпиловского, внутрикожные: проба Манту с 2ТЕ, проба Манту с различными разведениями сухого очищенного туберкулина и подкожное введение туберкулина (проба- Коха) в разных концентрациях туберкулина до 50 ТЕ.
При активной туберкулезной инфекции чаще встречаются выраженная и гиперергическая чувствительность к туберкулину, вираж туберкулиновых реакций и нарастание туберкулиновой чувствительности (Губкина М.Ф. и др., 2007). Отмечается, корреляция гиперергическои чувствительности к туберкулину с фазой неполной кальцинации у больных туберкулезом внутригрудных лимфатических узлов, что может свидетельствовать о состоянии гиперсенсибилизации макроорганизма у пациентов с медленно текущими репаративными процессами.
Выраженная, и гиперергическая туберкулиновая чувствительность, изменения характера туберкулиновой, чувствительности в виде «виража» или нарастания ГЗТ являются отражением пограничного состояния между заболеванием туберкулезом и инфицированием микобактериями туберкулеза (Ставицкая Н.В. и др., 2003; Овсянкина Е.С., 2004).
В последние годы по результатам туберкулинодиагностики определена новая группа риска - давно инфицированные дети с усиливающейся туберкулиновой чувствительностью на 6 мм и более. Доказано, что у 70% давно инфицированных МВТ детей усиление туберкулиновой реакции наблюдается перед развитием заболевания (Митинская Л.А., 2003). По результатам массовой туберкулинодиагностики было выявлено 64,7% детей с гиперергическои чувствительностью, что подтверждает актуальность данного метода в раннем выявлении туберкулеза у детей, у подростков с гиперергическои чувствительностью данный метод был реализован в меньшей мере - в 12,1% случаев. В основном, туберкулез у подростков с гиперергическои чувствительностью к туберкулину был выявлен рентгенологическими методами (Кузьмина И:К., Губкина М.Ф., 2009).
Однако- на результаты туберкулиновых проб оказывают влияние различные факторы внутренней и внешней среды организма: Отмечено, что «многие острые инфекции (корь, краснуха, мононуклеоз, коклюш, скарлатина и др.), лимфогранулематоз, саркоидоз, новообразования, кахексия, снижают чувствительность к туберкулину вплоть до анергии. Интенсивность туберкулиновых проб может снижаться при- лечении1 гормонами, антигистаминными препаратами (Греймер М.С., Фейгин М.И., 1986), наоборот, в условиях экзогенной суперинфекции; при. гипертиреозах, аллергических, сопутствующих заболеваниях, хронических очагах инфекции, на фоне введения некоторых белковых- препаратов, приема тиреоидина туберкулиновые реакции усиливаются (Митинская Л.А. с соавт., 1987; Шакуров И:Г. и др., 2008). В связи с данными о влиянии неспецифических прививок на результаты туберкулиновой пробы рекомендуется проведение туберкулинодиагностики.за 10-12 дней до проведения неспецифических прививок (Гусева Е.М. и др., 2001). В результате проведенного анализа туберкулиновой чувствительности у детей с аллергодерматозами выявлено, что около половины детей взято на диспансерный учет по поводу виража туберкулиновых проб из-за гипердиагностики, что обусловлено-феноменом парааллергии (Козлова О.Ф. и др., 2003; Бородулина Е.А., Бородулин Б.Е., 2006).
Разработка-метода иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения интерферона-гамма (ИФН-у)
Ранее в ООО «Мона» были получены, мышиные гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МАТ) к ИФН-у человека.
С целью создания системы ИФА для количественного определения ИФН- у, основанной на использовании двух МАТ к ИФН-у, специфичным к различным антигенным детерминантам (эпитопам), проведено изучение взаимной конкуренции МАТ. Аликвоты каждого из изучаемых МАТ метили биотином. Мечение МАТ биотином проведено следующим образом: 5 мг белка антитела диализовали в течение ночи против карбонат-бикарбонатного (КББ) буфера рН 8,5, доводили до концентрации 1 мг/мл в 0,1М КББ буфере и добавляли реагент для мечения биотином (biotin-amidocaproate-N-hydroxysuccinimide ester) - 1,5 мг, растворенный в 0,3 мл DMSO (диметилсульфоксид); смешивали быстро на шейкере и инкубировали при перемешивании в темноте 2 часа при 22 С. Соотношение биотин - белок по весу - 1:4; по объему - 1:20. Избыток биотина удаляли с помощью диализа против забуференного до 7,4 физиологического раствора в течение 2 суток со сменой среды. Для анализа специфичности изучаемых антител рекомбинантныйИФН-у из E.coli (продукт фирмы Endogen; США) сорбировали на планшетах Titertek из раствора (5 мкг/мл) в ОДМ бикарбонате натрия, рН 8,0.
Затем добавляли»смесь двух МАТ, одно из которых было биотинилировано (его добавляли в постоянной концентрации 1 мкг/мл), а другое-МАТ оставалось интактным. Концентрация немеченых антител варьировала от 100- до 0.001. мкг/мл), иі инкубировали планшеты 1 ч. при 25С. На следующей стадии планшеты инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидазаі (Dako, Япония). Количество связавшейся пероксидазы, следовательно, и связавшихся1 биотинилированных МАТ оценивали путем добавления ВІ лунки тетраметилбензидина (ТМБ) с перекисью водорода с последующей остановкой реакции и, спектрофотометрических измерений при длине волны 450 нм. Между стадиями планшеты промывали раствором ФСБ-1%БСА-0 05%Т\уееп 20. Было изучено 8 пар МАТ. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 9.
Приведенные данные, полученные с помощью прямого ИФА, дают представление об эпитопной специфичности МАТ. В планшет с сорбированным ИФН-у вносили смесь немодифицированных МАТ (указаны в столбце) и биотинилированных МАТ (указаны в строке), как описано выше. Подавление связывания МАТ-биот (--) говорит о том, что эпитопы МАТ и МАТ-биот перекрываются. Подавление связывания биотинилированных МАТ расценивалось как свидетельство идентичной специфичности МАТ. Отсутствие подавления или неполное подавление при высокой концентрации 2-х антител свидетельствовало о специфичности антител к различным антигенным детерминантам. Затем были выбраны МАТ с максимальной эффективностью связывания к ИФН-у. В результате была выбрана пара МАТ со специфичностью к различным эпитопам (ЗС11 и 5В5), связывавшаяся со стандартным ИФН-у с высокой эффективностью.
Проведение иммунометрического анализа количественного иммуноферментного определения ИФН-у проводили по следующей схеме. В лунках планшета сорбировали моноклональные антитела к ИФН-у ЗС11, разведенные в КББ буфере. При внесении в лунки образцов плазмы крови или соответствующих контролей происходит связывание иммобилизованных антител с содержащимся в образцах ИФН-у. Несвязавшийся материал удаляется из лунок путем отмывки. На следующем этапе реакции вторые моноклональные антитела к у-интерферону 5В5 меченые биотином (реагент для анализа) соединяются с иммобилизованным ИФН-у. Образовавшийся комплекс выявляется с помощью конъюгата стрептавидина с пероксидазой (рис. 3).
Для построения калибровочной кривой использовали калибровочные пробы, полученные путем последовательных двукратных разведений стандартной калибровочной пробы, содержащей 280 пг/мл ИФН-у. После внесения в первые 2 ряда лунок планшета ряда по 100 мкл последовательных двукратных разведений калибровочной пробы ИФН-у от 280 пг/мл до 8,75 пг/мл в разводящей, жидкости, а также контрольных лунок, содержащих по ЮО мкл разводящей жидкости без ИФН-у, анализируемые образцы плазмы, разведенные 1:1, также вносили в лунки планшета и инкубировали на.шейкере в течение 1 часа. После стандартной процедуры отмывки вносили биотин меченые антитела (реагент для анализа) и инкубировали на шейкере в течение 30 мин. После стандартной отмывки использовали конъюгат - стрептавидин-пероксидазу с инкубацией 30 мин на шейкере. Для проявления реакции использовали субстратный буферный раствор, содержащий перекись водорода и тетраметилбензидин. Реакцию после 5 минут инкубации останавливали 10% фосфорной кислотой.
Результаты анализа учитывались после считывания оптической плотности (ОП) в лунках планшета с помощью спектрофотометра для ИФА при 450 нм против воздуха на основании анализа калибровочной кривой, используя специальную компьютерную программу «Zemfira» фирмы «Биорад» для обсчета количественного ИФА.
Набор реагентов «Тубинферон» включает в себя набор для количественного иммуноферментного определения ИФН-у и компоненты, необходимые для постановки реакции антиген-специфического индуцирования ИФН-у в образцах цельной крови изучаемых пациентов.
В состав набора реагентов для определения ИФН-у входят следующие компоненты:
96-луночный планшет для иммуноанализа (фирма «Nunc») с иммобилизованными на нем мышиными моноклональными антителами к интерферону-у;
- калибровочная проба (КП) лиофилизированная, содержащая известное количество интерферона-у;
- контрольная плазма крови человека с известным содержанием интерферона-у;
- реагент для анализа - концентрат конъюгата мышиных моноклональных антител 5В5 к у-интерферону, меченых биотином; - концентрат конъюгата (фирма."SDT", кат. № SP80C): стрептавидин, меченый полимерной пероксидазой;
- буферный раствор для разведения; образцов - фосфатно-солевою буфер рН 7,2, содержащий- детергент Твин-20 и бычий сывороточный-, альбумин- (ФЄБ-БСА Т);
- буферный раствор для. разведения, концентрата конъюгата - фосфатно-солевой буфер рН 7,2, содержащий, детергент Твин-20 и бычий сывороточныйальбумин (ФСБ-БСА-Т);
- концентрат реагента для отмывки (20-кратный)1 фосфатно-солевой буфер рН 7,2, содержащий детергент Твин-20(ФСБ-Т);
- раствор тетраметилбензидина (ТМБ) 1мМ/л в диметилформамиде;
- субстратный буферный раствор - 0,05М цитратный.буфер рН4,8, содержащий перекись водорода;
- стоп-реагент - фосфорная кислота (ГОСТ 6552-80), 5%.
В состав набора «Тубинферон», рассчитанного на 13 исследований для определения туберкулезного инфицирования, помимо отмеченных выше реагентов для количественного анализа ИФН-у, входят стерильные криопробирки с завинчивающимися крышками объемом 5 мл, предназначенные для инкубации образцов крови; всего 39 криопробирок. В набор также входят препарат туберкулина PPD в концентрации по белку 1мг/мл, а также препарат, содержащий смесь антигенов ESAT-6 и CFP-10 в равных пропорциях в концентрации 2 мг/мл.
Антиген-индуцированная продукция ИФН-у в образцах цельной крови в присутствии туберкулина PPD и специфического антигена ESAT-6
В настоящем разделе представляем результаты применения тест-системы у больных подростков с различными формами, туберкулеза легких в процессе химиотерапии. Полученные данные позволяют рассматривать этот метод как возможный способ оценки специфического клеточного иммунитета и использовать его в дальнейшем для контроля эффективности лечения больных туберкулезом легких.
Обследовано 122 детей старшего возраста и подростков с впервые выявленным туберкулезом легких. Среди больных активным туберкулезом легких большую часть составляли пациенты с инфильтративной формой туберкулеза (105 чел. - 86,0%), с диссеминированным туберкулезом - 8 (6,6%), с очаговым туберкулезом легких - 6 (4,9%), с казеозной пневмонией - 3 (2,5%). Среди больных туберкулезом преобладали городские жители - 73,0%, жители села - 27,0%. Превалировали лица женского пола - 66 (54,1%). Наибольшее число больных активным туберкулезом легких пришлось на возрастную группу от 15 до 17 лет-83,6%.
Большинство больных были выявлены активными методами при проверочных и плановых обследованиях детского и подросткового населения на туберкулез (55,7% - 68 человек). Активное выявление чаще происходило при проведении проверочных флюорографических обследований (38,5%), что объясняется возрастным составом обследованных пациентов. По обследованию по контакту - 18 (14,7%), по результатам массовой туберкулиновой диагностики - 3 (2,5%). При обращении за медицинской помощью были выявлены 54 (44,3%) больных с остро и подостро протекавшими-туберкулезными процессами.
Проведенный анализ показал, что. из 122 наблюдаемых в данном исследовании пациентов- у 54 (44,3%) имел место очевидный контакт с больным туберкулезом. Преобладающее число из них 45 (83;3%) находились в тесном, длительном близкородственном1 контакте. 8 из 54 (14,8%) больных подростков были выявлены из очага «смерти» больного туберкулезом. Кратковременный, не постоянный контакт с больным туберкулезом наблюдался только у 9 (16,7%) подростков. У 43 (35,2%) пациентов были указания на сопутствующую патологию в анамнезе. Среди заболеваний чаще всего имели место бронхолегочная патология - 15,6%, патология ЖКТ- 12,3%, аллергическая патология - 12,3%, патология мочевыделительной системы -5,3%. Перенесенные инфекционные болезни встречались в 23,8% случаев, 36,1% детей страдали ОРВИ.
При поступлении в клинику 47 из 122 (38,5%) подростков являлись бактериовыделителями. 15 (31,9%) подростков выделяли ЛУ штаммы МБТ. Изучение спектра лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза у подростков выявило преобладание резистентности к 2 и более препаратам (14 пациентов - 93,3% из 15), устойчивость к 1 химиопрепарату - 6,7% (1 пациент).
В исследуемой группе больных ограниченные процессы (в пределах 1-2 сегментов легочной ткани) встречались у 63 (51,6%) пациентов, распространенные поражения легких были диагностированы у 59 человек (48,4%).
Пациенты были распределены на 2 группы по распространенности процесса.
1-я группу составили 59 больных с относительно распространенным процессом туберкулеза легких: объем поражения - более 2 сегментов. Инфильтративный туберкулез легких диагностирован у 47 (79,6%), казеозная пневмония у 2 (3,4%), диссеминированный туберкулез легких у 8 (13,6%), очаговый туберкулез легких у 2 (3,4%) подростков. С помощью методов раннего выявления (туберкулинодиагностика и флюорография) заболевание
H7 установлено у 14 (23-7%);, по контакту с больным туберкулезом у 5 (8;5% человек, оставшееся большинство - 40 (67,8%) подростков выявлены, по жалобам при обращении в лечебные учреждения и; при; госпитализации! в-стационары после дифференциальной, диагностики; Эти данные показывают, что имеются негативное отношение к плановым: проверочным осмотрам (туберкулинодиагностика и; флюорография) и невнимание: к собственному здоровью, что является одной из значимых причин поздней диагностики туберкулеза у подростков;
Контакт с больным; туберкулезом был установлену 23 (39,0%), в том числе семейный- 21 (35;6%), из очагов смерти. — 4 (6,8%) пациента. Клинические симптомы заболевания: были выявлены у всех больных. В 100% случаев имели место симптомы интоксикации: слабо выраженные в 18,6%, умеренно выраженные в.22,0%, выраженные.в 59,3%. Чаще других легочных симптомов встречался кашель, сухой или с мокротой (78,9% - 30 больных). Показатели лейкоцитарной формулы были изменены у большинства подростков (78;9%- 30 человек). Лейкоцитоз выявлен у 40,7% подростков,.показатель интоксикации — моноцитоз - у 55,3%, нейтрофильный сдвиг влево - у 13,2%, увеличение GCG (28,8±2,1 мм/ч.) у 74,6%, гипохромная анемия - у 47,4% больных. Изучение чувствительности к туберкулину у больных показало, что средний размер папулы на пробу Манту 2ТЕ с ППДЛ составил 10,9±0,9 мм. У обследованных пациентов в большинстве случаев - 19 (32,2%) характерна умеренная чувствительность (10-13 мм), в 13 (22,0%) - выраженная (14-16 мм), в 16 (27,1%) слабая, в 6 (10,2%) встречается гиперергическая проба (17 мм и более) и отрицательная или сомнительная проба в 5 (8,5%).
Бактериовыделение - у 44 (74,6%) пациентов, МЛУ МБТ - у 8 (27,6%), полирезистентность — у 1 (3,4%) больных.
При рентгенологическом исследовании установлено, что у подавляющего большинства больных (67,8%) специфический процесс носил односторонний характер, с преимущественной локализацией в правом легком (47,4%), у 19 (32,2%) изменения определялись в правом и левом легких. Течение туберкулезного воспаления.осложнилось распадом легочнойткани у 33 (86,8%) пациентов. Чаще отмечались, микрораспады и. полости до 2 см в диаметре (69,7%), реже встречались полости более 2 см (30;3%).
Во 2-й. группе с ограниченным туберкулезным процессом было 63 подростка. Инфильтративный туберкулез легких был диагностирован1 у 59 (93,7%) больного, очаговый туберкулез легких у 4 (6,3%) чел. Объем поражения не превышал 2 сегментов легочной- ткани, бактериовыделение не определялось у большинства пациентов - 93,7%. Специфический, процесс носил односторонний характер, с преимущественной локализацией в правом легком (58,7%) и в верхней доле. При проведении профилактических осмотров у подростков туберкулез выявлен флюорографически у 35 (55,6%) чел., по туберкулиновым пробам у 1 (1,6%) чел., при обследовании по контакту выявлено 12 (19,0%) подростков. По обращаемости в соматические стационары у 16 (23,8%) пациентов. Симптомы интоксикации в большинстве случаев отсутствовали или были слабо выраженные (19,0% и 39,7% соответственно) и умеренно выраженные и выраженные (35,0% и 6,3% соответственно). Лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы влево выявлен у 4 (19,0%), моноцитоз у 17 (27,0%), ускоренная СОЭ (20±3,4 мм/час) у 19 (30,2%) больных, что достоверно ниже, чем у больных с распространенным процессом туберкулеза легких (р 0,05). Гипохромная анемия диагностирована у 7 подростков.
Изучение чувствительности больных к туберкулину показало, что средний размер папулы пробы Манту 2ТЕ с ППД-Л составил 12,4±1,2 мм. У обследованных пациентов в большинстве случаев - 21 (33,3%) отмечена умеренная чувствительность, у 18 (28,6%) больных - слабая, у 10 (15,9%) -выраженная, в 12 (19,0%) случаях - гиперергическая проба, и отрицательная или сомнительная проба оказались у 2 (3,2%) больных.
Всем больным проводили противотуберкулезную терапию по стандартным схемам, установленным приказом №109 Минздрава России от 21.03.2003 г. (I или III режим) до определения лекарственной чувствительности МБТ, далее лечение продолжали в соответствии с полученными- результатами. После установления МЛУ М. tuberculosis у больных проводили коррекцию схемы лечения с включением, препаратов второго ряда, к которым чувствительность возбудителя1 была сохранена: В первой группе с распространенным туберкулезным процессом больные химиотерапию получали, по I режиму - 25 чел. (42,4%), по II режиму - 30 чел. (50,8%), по III режиму - 2 чел. (3,4%), по IV режиму - 2 чел. (3,4%). Во второй группе с ограниченным туберкулезным процессом больные химиотерапию получали по I режиму - 50 чел. (79,4%), noil режиму - 10 чел. (15,9%), по III режиму - 3 чел. (4,7%).
Для оценки уровня специфической индукции ИФН-у в образцах цельной крови ex vivo использовали метод и тест-систему для определения туберкулезной инфекции у детей.
Уровни индукции ИФН-у в образцах цельной крови в присутствии антигенов МВТ - туберкулина PPD и специфического ESAT-6 у 122 больных туберкулезом легких подростков составляли- (медиана и 25-75% межквартильные различия): 213 (91-374) пг/мл и 47 (19-161) пг/мл соответственно. Эти уровни индукции при индукции PPD и ESAT-6 были существенно ниже, чем у подростков с первичной туберкулезной инфекцией (конверсия кожной туберкулиновой пробы Манту, туберкулез внутригрудных лимфатических узлов, экссудативный плеврит туберкулезной,этиологии), и по результатам исследования индукции ИФН-у с PPD и ESAT-6 у ранее изученных 84 пациентов составили соответственно 554 (324-896) пг/мл и 356 (154-603) пг/мл О 0,01).
Применение и иммунологический анализ эффективности иммунотерапевтического препарата «Аффинолейкин» при туберкулезе легких
Дети подросткового возраста - являются; одними из весьма уязвимых групп населения в силу большого напряжения и гормональных, и психо эмоциональных факторов, очевидно, оказывающих значительное влияние на эффективность клеточного иммунного ответа на туберкулезную инфекцию (Єиренко И.А., 2001; Русакова Л.И, 2006; Позднякова А.С., 2008). Изучение возможностей применения иммунотерапевтических препаратов в качестве дополнительных средств, с целью повышения эффективности специфической химиотерапии туберкулеза, особенно с учетом распространения-лекарственно устойчивых штаммов возбудителя, является весьма актуальной задачей. Одним из перспективных путей решения этой задачи представляется использование низкомолекулярных антигенспецифичных Т-клеточных пептидов (субъединицы растворимых антигенсвязывающих Т-клеточных молекул) - так называемых трансфер-факторных препаратов. Отдельные клинические наблюдения их успешного клинического применения у взрослых были продемонстрированы в работах 70-х - начала 80-х годов (Rubinstein А., Melamed J., Rodescu D., 1977; Whitcomb M.E., Rocklin R.E., 1973). Интерес к ним вновь возникает в последние годы. При экспериментальном туберкулезе легких у мышей эти препараты не только потенцировали специфическую химиотерапию, но и проявляли собственную терапевтическую активность (Fabre R.A. et al., 2004).
Отечественный препарат этого ряда - Аффинолейкин (АФЛ) -разработанный в НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН и выпускаемый филиалом ФГУП НПО «Микроген» МЗСР РФ Пермское НПО «Биомед», обладает активностью в переносе ГЗТ к туберкулину ППД и представляет собой комплекс низкомолекулярных белков (5-8 кДа), экстрагированных и очищенных по оригинальной технологии, из лейкоцитарных мембран человека (Мац.А.Н., Перепечкина Н.П:, Райхер Л.И: и др., 1998, Мац А.Н., 2004). Для приготовления серии1 препарата1 образцы лимфоцитов, собирают не менее чем- от 3000 доноров- крови. Номинальная единица активности «трансфер-факторного препарата» - активность, эквивалентная не менее полмиллиарду лимфоцитов донорской-, крови; АФЛ относится» к группе биофармацевтических препаратов, выпускаемых за. рубежом- под коммерческими названиями LeukoNorm (Германия), Immodin (Чехия), Hebertrans (Куба), Imunor (Словакия), Immunepotent CRP (Мексика) и Transfer factor (КНР). Эти препараты используются для иммунотерапии разнообразных форм недостаточности противоинфекционного и противоопухолевого клеточного иммунитета, в частности, для лечения хронических и персистентных вирусных, бактериальных, грибковых инфекций и паразитарных инвазий (Мац А.Н. и др. 1998; Мац А.Н:, Боков М.Н., Кузьмина М.Н., 2008).
Целью.работы явилось изучение клинико-иммунологической эффективности Аффинолейкина при лечении больных туберкулезом легких подростков в.ходе открытого рандомизированного исследования. Иммунологический анализ был акцентирован на изучении влияния Аффинолейкина при исследовании активности субпопуляции гамма-дельта Т-лимфоцитов, играющей особо важную роль в противотуберкулезной защите (Boom W.H., 1999; Chen Z., Letvin N.. 2003).
Обследовано 46 больных туберкулезом подростков в возрасте 11-17 лет, находившихся на обследовании и лечении в отделении по профилактике, выявлению и лечению туберкулеза у детей и подростков клиники фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова. У значительного большинства пациентов впервые выявлен инфильтративный туберкулез легких (40 чел. -91,3%), диссеминированный туберкулез легких (2 чел. - 4,3%), казеозная пневмония и первичный туберкулезный комплекс по 1 случаю - по 2,2%.
Методом случайной выборки были сформированы две группы (основная и 152 контрольная) по 23 пациента, в" основном, с инфильтративным туберкулезом легких (по 21 случаю).
Возрастно-половой состав групп представлен в табл. 31.
Из табл. 33. видно, что у большинства пациентов туберкулез был выявлен при обращении за медицинской помощью в связи, с выраженным ухудшением состояния, здоровья - 60,9%, так как туберкулез легких у большинства пациентов протекал под маской» ОРВЩ острого бронхита или пневмонии. По данным Овсянкиной Е.С., 2008, в г. Москве 50% больных туберкулезом детей и подростков выявляются при обращении- за медицинской помощью. В группе наших больных при прохождении очередного профилактического флюорографического обследования туберкулез выявлен у 14 (30,4%) пациентов, по результатам туберкулинодиагностики - у 1 (2,2%).
В клинической картине у больных преобладали симптомы умеренной и выраженной интоксикации (слабость, адинамия, субфебрильная или фебрильная температура тела, потливость, плохой аппетит, дефицит массы тела) и бронхолегочная симптоматика (кашель с выделением слизистой или слизисто-гнойной мокроты, притупление легочного звука, жесткое или ослабленное дыхание, сухие, чаще разнокалиберные влажные хрипы). В анализах крови были выявлены лейкоцитоз, палочкоядерныи сдвиг влево, лимфопения, моноцитоз, ускорение СОЭ (до 45 мм/ч).
У пациентов из основной группы чаще встречались выраженные симптомы интоксикации - по 56,6% и одинаково часто умеренно и слабо выраженные, а в контрольной группе у больных регистрировались одинаково часто выраженные и слабо выраженные симптомы интоксикации — по 39,1%.
Бронхолегочная симптоматика чаще наблюдалась у детей основной группы -у 14 (60,9%) чел., в контрольной группе у 13 (56,6%) детей (табл. 34).
Чувствительность к туберкулину (реакция Манту с 2 ТЕ ГШД-Л) у подавляющего большинства подростков.была положительной: в 4,3% случаев — гиперергической; у 21,1% подростков - выраженной; у 41,3% - умеренной; в 24,0% случаев - слабо выраженной; в 8,7% - сомнительной или отрицательной (табл. 35).
Распространенный» туберкулезный процесс чаще- наблюдался» в основной-группе - у 12 (52,2%) чел., а в- контрольной группе у 8 (34,8%) больных. У большинства подростков имелись, деструктивные изменения легочной ткани. Деструктивные изменения определялись в основной и контрольной группах одинаково часто - в- 65,2% случаев. Бактериовыделение установлено у 27 (60,9%) пациентов; в основной группе — 13 больных, в контрольной! - 14 больных. Из них лекарственно-устойчивые штаммы бьииг выявлены у 9х (34,6%), в,том числе с МЛУ - у 8 (88,9%).
Больным основной группы, начиная со второго месяца» интенсивного лечения, наряду с антибактериальным лечением проводили» иммунотерапию Аффинолейкином. Пациенты контрольной группы получали только специфическую противотуберкулезную химиотерапию. Всем больным проводили противотуберкулезную терапию по стандартным схемам, установленным Приказом МЗ РФ от 21 марта 2003 года №109 до определения лекарственной, чувствительности МБТ, далее лечение продолжали в соответствии с полученными результатами.
Пациентам основной группы, начиная со второго месяца специфической химиотерапии, наряду с антибактериальными препаратами вводили Аффинолейкин: подкожно один раз в день по 2 ед. (содержимое 1 ампулы растворяли в 1 мл физраствора NaCl) 3 раза в неделю через день, всего 10 инъекций. Исследование было одобрено Межвузовским комитетом по этике при ассоциации медицинских и фармацевтических вузов. У пациентов было получено информированное согласие.
Изучали уровень антиген-индуцированного синтеза интерферона-гамма (ИФН-у) в образцах цельной крови. Исследование антиген-индуцированной продукции ИФН-у проводили до начала применения. Аффинолейкина и затем не ранее, чем через две недели после окончания курса. В контрольной группе исследования проводили в те же сроки.
Иммунологическое исследование включало в себя также определение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов периферической крови после краткосрочной. инкубации с антигенами- PPD и. ESAT-6. Изучали общее содержание Т-лимфоцитов (СШ+), ИФН-у-продуцирующих Т-лимфоцитов (СОЗ ФН-у ), субпопуляциитамма-дельта.Т-лимфоцитов СОЗ уб ) и-ИФН-у продуцирующих гамма-дельта Т-лимфоцитов (СОЗ+у5ІИФН-у+).
