Введение к работе
Актуальность исследования.
Температура тела является константой организма, определяющей постоянство скорости физиологических процессов – одного из важнейших условий жизнедеятельности организма. Проблема адаптации к холоду занимает одно из ведущих мест среди актуальных проблем биологической науки (Гуляева Н.В., 1989 г; Пашкова И.Г. и соавт., 1996; Барбараш Н. А., 1996; Гасангаджиева А. П., 1997; Колосова Н.Г.и соавт., 1999; Суворов В.В. и соавт., 2002; Поздняков О.Г. и соавт., 2003; Ахалая М.Я.и соавт., 2006).
Современные исследования доказывают, что уже повторное воздействие охлаждения перестраивает исходные связи в системе гомеостаза (Леутин В.П., Николаева Е.И., 1988; Ахалая М.Я.и соавт, 2006) и создает предпосылки для новой адаптации. В результате общей интенсификации окислительных процессов при холодовом воздействии (Артюхов В.Г., Наквасина М.А., 2000) у гомойотермных организмов происходит активация процессов свободнорадикального окисления (Панин Л.Е. и соавт., 1995), которую P. Kovacs с соавторами (1996) рассматривает как основное патогенетическое звено стресса. В ответ на интенсификацию свободнорадикальных процессов формируются защитные механизмы, которые снижают вероятность развития патологических процессов (Зайчик А.Ш. и соавт., 1999). Одним из элементов защитной антиоксидантной системы является ферментативное звено антиоксидантной системы (АОС). Нормализация уровня продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) активно используется в качестве необходимого и достаточного критерия эффективности адаптивных преобразований (Эмирбеков Э.З., Львова С.П., 1985). Таким образом, эффективность адаптации к стрессорным воздействиям определяется согласованностью изменений антиоксидантной ферментативной активности с интенсивностью ПОЛ (Нилова Н.С., Полежаева Л.Н., 1992). Динамика процессов свободнорадикального окисления (СРО) и антиоксидантной активности на ранних этапах охлаждения в процессе адаптации изучена недостаточно.
В отличие от постоянного, периодическое охлаждение в естественных условиях встречается чаще и способствует быстрой выработке адаптации к холоду (Radomski MW, Boutelier C., 1982; Golden F.S., Tipton M.J., 1988). Большой интерес представляет и возрастной аспект адаптации, так как возрастные отличия проявляются и в реакциях свободнорадикальных процессов (Imre S., Juhasz E., 1987; Matsugo S. et al, 2000), и в активации АОС (Воскресенский О.Н. и соавт., 1982; Selman C. et al, 2000).
Цель работы – исследовать возрастную специфику свободнорадикальных и антиоксидантных процессов и особенностей ориентировочно-исследовательского поведения при адаптации к периодическому охлаждению.
Основные задачи исследования:
-
Изучить изменение параметров ориентировочно-исследовательского поведения у половозрелых и неполовозрелых самцов белых крыс в процессе 20-тидневного периодического холодового воздействия.
-
Определить возрастные особенности динамики показателей сердечного ритма на ранних этапах охлаждения у адаптированных к периодическому охлаждению неполовозрелых и взрослых животных.
-
Исследовать динамику промежуточных продуктов перекисного окисления липидов (ПП ПОЛ), перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ), уровня окислительно-модифицированных белков, активности супероксиддисмутазы (СОД), церулоплазмина и каталазной активности в плазме крови неполовозрелых и половозрелых самцов крыс в условиях адаптации к периодическому охлаждению.
-
Исследовать тканеспецифические особенности динамики накопления малонового диальдегида (МДА) в ткани печени и в миокарде на ранних этапах охлаждения (15, 30, 45, 60 и 90 минут) в условиях адаптации к холоду неполовозрелых и взрослых самцов крыс.
Научная новизна
Впервые установлено, что динамика ориентировочно-исследовательского поведения в процессе 20-дневного охлаждения имеет общие черты у неполовозрелых и взрослых животных: на 5-15 дни отмечено снижение исследовательской активности, а к 20-му дню охлаждения поведение обеих возрастных групп возвращается к показателям интактных животных.
Уточнена степень вовлечения звеньев про- и антиоксидантной системы в изменение окислительного гомеостаза после 20-дневного периодического охлаждения в зависимости от возраста животных. Впервые установлено, что у половозрелых животных происходят более значительные изменения уровня активности отдельных ферментов АОС, чем у неполовозрелых животных, а реакция показателей ПОЛ на 20-дневное периодическое охлаждение не зависела от возраста.
Установлено, что для периодически охлаждавшихся крыс по сравнению с неадаптированными животными характерны меньшие по амплитуде колебания интенсивности процессов СРО. После 20-дневной периодической адаптации половозрелые самцы быстрее и в полном объеме восстанавливают функциональные показатели. Впервые установлено, что в организме периодически охлаждавшихся половозрелых животных формируются новые корреляционные взаимосвязи между процессами свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты.
Новизной работы является факт установления значительных возрастных особенностей в динамике параметров свободнорадикальных процессов. Для половозрелых самцов характерна консолидация всех параметров СРО, а у молодых животных динамика отдельных параметров отличалась разнонаправленностью и не всегда была согласованной. В ответ на охлаждение у адаптированных животных обеих возрастных групп происходила активация ферментативного звена АОС, степень которой также зависела от возраста животных. Установлено, что увеличение продуктов ПОЛ в процессе длительной адаптации не всегда отражает развитие деструктивных изменений, более значимыми являются данные о ранней динамике свободно-радикальных процессов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты расширяют представления о возрастных аспектах развития свободнорадикальных процессов при развитии адаптации животных к периодическому охлаждению и могут быть использованы при оптимизации состояния организма людей, подверженных периодическому охлаждению по характеру работы, схемы физиотерапевтических процедур, связанных с охлаждением. В работе разработаны критерии адаптации к 20-дневному периодическому охлаждению на уровне свободнорадикальных параметров, параметров работы сердца и поведения животных в тесте открытое поле. Материалы диссертации включены в лекции курсов по физиологии, биохимии и экологии человека и животных Астраханского государственного университета.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Критериями адаптированности животных на уровне свободнорадикального гомеостаза к 20-дневному периодическому охлаждению является увеличение скорости нормализации показателей и отсутствие колебаний этих параметров на раннем этапе охлаждения (1,5-часовое охлаждение).
-
Критерием перехода к периоду долгосрочной адаптации к периодическому охлаждению является восстановление параметров исследовательского компонента ориентировочной реакции и уменьшение уровня тревожности.
-
Вегетативным критерием адаптированности к периодическому охлаждению является частоты сердечных сокращений. Этот критерий имеет зависимость от возраста.
Апробация работы
Результаты исследования докладывались и обсуждались на IХ Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы Бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2006), в материалах научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань – Волгоград – Москва, 2006), на итоговых научных конференциях студентов, аспирантов и преподавателей Астраханского государственного университета (Астрахань, 2006, 2007), на Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт Петербург, 2007), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов–2008» (Москва, 2008), в материалах IV Международной научно-практической конференции «Человек и животные» (Астрахань, 2008) и 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, 3 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению и обсуждению результатов собственных исследований, выводов. Общий объем диссертации – 126 страниц, работа иллюстрирована 17 таблицами, 24 рисунками и 7 таблицами приложения. Библиографический список включает 243 источников, из них 102 – иностранных.
Проведено две серии экспериментов. В первой серии использовано 80 неполовозрелых 7-недельных (средняя масса в начале эксперимента – 65 г, к концу эксперимента – 95 г) и во второй – 77 половозрелых 18-недельных (со средней массой в начале эксперимента – 203 г и к концу эксперимента – 242 г) самцов беспородных белых крыс. Классификация животных соответствует классификации, предложенной И.П. Западнюк и соавторами, 1983. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к пище и воде. Проводимые эксперименты соответствуют этическим нормам, изложенным в Женевской конвенции (1971), «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985). Декапитация проводилась после наркотизации животных путем внутрибрюшинного введения этаминала натрия в дозе 4 мг/100 г массы тела.
Холодовая адаптация. Для охлаждения крыс в индивидуальных клетках, не ограничивающих их подвижность (Линчевская А.А. и соавт., 1986), помещали в освещенную холодильную камеру в течение 3 часов на протяжении 20 дней при температуре +4оС (Кормильцина Н.К., 1990). На 21-е сутки крыс охлаждали 15, 30, 45, 60 и 90 минут. Одна группа служила контролем, адаптированным к холодовому воздействию. Отдельная группа животных, не подвергавшихся охлаждению, являлась неадаптированным контролем.
Оценивалась динамика ориентировочно-исследовательской активности животных (Буреш Я.И. и соавторы, 1991), для чего крыс тестировали перед началом охлаждения и на 2-е, 5-е, 10-е, 15-е и 20-е сутки ежедневного охлаждения. Контрольную группу животных (n = 20 и n = 17 у неполовозрелых и половозрелых животных соответственно), тестировали в том же режиме, но без охлаждения. Для анализа уровня исследовательского компонента и коэффициента тревожности в процессе ежедневного охлаждения был использован метод Н.Р. Григорьева, 2007.
Динамику показателей сердечной деятельности регистрировали у адаптированных к периодическому холодовому воздействию животных до и после воздействия холодом различной длительности. Запись ЭКГ проводили на аппаратно-программном комплексе «Варикард» (Рамена, Россия), миниатюрные электроды-зажимы фиксировали в области хвостовой и правой и левой подключичных артерий. Рассчитывались частота сердечных сокращений (ЧСС), мода (Мо), амплитуда моды (АМо), индекс напряжения (ИН), рассчитывали по формуле (Баевский Р. М. и соавт., 1984), с учетом ширины класса гистограммы (7,8 мс), по которой определяется АМо: ИН = (AMo / 2 x Х x Mo) x (50/7,8).
Для определения степени перекисного гемолиза эритроцитов использовалась методика А.А. Покровского и соавт. (1964) в модификации, предложенной А.Е. Лазько, Р.И. Асфандияровым и А.А. Резаевым (1993).
Уровень ПП ПОЛ определяли в плазме крови. Интенсивность образования промежуточных продуктов ПОЛ с изолированными двойными связями (ИДС) (220 нм), диеновых коньюгатов (ДК) (232 нм), кетодиенов и сопряжённых триенов (КДСТ) (278 нм) изучали спектрофотометрически по методу И.А. Волчегорского с соавт. (1989).
Интенсивность ПОЛ в тканях печени и миокарда определяли по исходному уровню и динамике накопления ТБК-активных продуктов по методу И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977) в модификации Е.А. Строева и В.Г. Макаровой (1986).
Для определения интенсивности окислительной модификации белков сыворотки крови определяли уровень алифатических альдегид-денитрофенилгидразонов (АДФГ) при 460 нм и алифатических кетон-денитрофенилгидразонов основного характера (АКФГ) при 540 нм по методу Е.Е. Дубининой и соавторов (1995).
Каталазную активность в плазме крови и эритроцитах определяли по методике М.А. Королюка и соавторов (1988). Активность церулоплазмина - по методике Э.В. Тэна (1981). Активность супероксиддисмутазы исследовали по методу С. Чевари и соавторов (1985).
Полученные данные подвергнуты статистической обработке с использованием критерия Стьюдента, дисперсионного анализа по Фишеру и корреляционного анализа (MS Excel) (Лакин Г.Ф., 1990; Козак М.Ф., 1995).
