Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Ферменты, их функциональное значение 8
I.I.I. Лактатдегидрогеназа (К.Ф. 1*1.1.27) 8
1.1/2. Аминотрансферазы (К.Ф. 2.6.I.I. и К.Ф. 2.6.1.2) 14
1.1.3. Холинэстераза (К.Ф. 3.1 Л.8) 20
1.1.4. Щелочная фосфатаза (К.Ф. 3.1.3.1) 23
1.2. ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТА, ПОЛА И СЕЗОНА ГОДА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ 31
1.2.1. Характеристика онтогенетических изменений активности энзимов 31
1.2.2. Сезонные колебания активности ферментов.. 41
1.2.3. Изменение активности ферментов у особей разного пола , 45
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 50
3. ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТОВ СЫВОРОТКИ В ПОСШАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ 60
3.1. Особенности обмена веществ и энергии в онтогенезе 60
3.2. Динамика общей активности и изменение изофер-ментного спектра лактатдегидрогеназы..., 63
3.3. Динамика активности аспартатаминотрансферазы... 71
3.4. Динамика активности аланинаминотрансферазы 73
3.5. Динамика активности холинэстеразы 75
3.6. Динамика активности щелочной фосфатазы.. 77
4. ВЛИЯНИЕ СЕЗОНА ГОДА НА УРОВЕНЬ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ У ПЕСЦОВ 81
4Л. Сезонные биоритмы биологических процессов у песцов 81
4.2. Сезонные изменения общей активности лактатде-гидрогеназы и ее изоферментного спектра Ь4
4.3. Сезонные изменения активности аспартатамино-трансферазы 93
4.4. Сезонные изменения активности аланинаминотранс-феразы 93
4.5. Сезонные изменения активности холинэстеразы... 95
4.6. Сезонные изменения активности щелочной фосфатазы 97
5. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ У ЩЕНКОВ И ВЗРОСЛЫХ ЗВЕРЕЙ...
6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..
6.1. Некоторые закономерности и особенности возрастных изменений активности ферментов у песцов...
6.2. Особенности сезонной динамики активности ферментов у песцов 117
6.3. Половые различия активности ферментов 123
ВЫВОДЫ 132
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 135
ЛИТЕРАТУРА 138
ПРИЛОЖЕНИЕ ... 177
- Ферменты, их функциональное значение
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Особенности обмена веществ и энергии в онтогенезе
- Сезонные биоритмы биологических процессов у песцов
- ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ У ЩЕНКОВ И ВЗРОСЛЫХ ЗВЕРЕЙ...
Ферменты, их функциональное значение
Лактатдегидрогеназа (ДЦГ) катализирует последний этап гликолиза в клетке:
пируват + НАД Н+ -g- - лактат + НАД + В результате этой реакции пируват восстанавливается до лактата; равновесие реакции смещено в сторону образования лактата, который является конечным продуктом гликолиза в анаэробных условиях (Ленинджер, 1976).
Известно, что лактатдегидрогеназа (ЛДГ) существует в нескольких молекулярных формах. По решению комиссии по номенклатуре Международного биохимического союза термин "множественные молекулярные формы фермента" (ШШ) рекомендуется использовать как наиболее широкий термин для обозначения всех ферментов, обладающих одинаковым ферментным действием и свойственных одному и тому же виду, а термин "изофермент", или "изозим" - применять лишь в том случае, когда множественные формы фермента обусловлены генетически детерминированными отличиями в первичной структуре ( IUPAC-JUB, 1972).
Изоферменты ЛДГ представляют собой тетрамеры с молекулярным весом 134000 (Appella, Markert, 1961), каждый из которых состоит из четырех полипептидных цепей. Пять изоформ фермента соответствуют комбинациям двух разных типов полипептидных цепей: М4, М3Н, М ,. МН3 и Н4 (Appella, Markert, 1961,; Markert, 1963; vessel, 1965) , которые кодируются двумя неаллельны-ми структурными генами LDH-AMLDH-B (Серов, 1968; Masters, Holmes, 1972, Корочкин и др., 1977). Помимо этих генов, расположенных в соматических клетках, в семенниках птиц и млекопитающих обнаружен генЬДН-С, который активируется в ходе сперматогенеза и контролирует синтез субъединицы С (Zinkham et al., 1964). Комбинация субъединиц С образует шестой изофермент лак-татдегидрогеназы - ДЦГ-х, играющий определенную роль в оплодотворении (Zinkham et al. , 1963; Goldberg, 1965; Lindahl, Mayeda, 1975).
Кроме того, на спектр ДЦГ могут оказывать влияние и другие неаллельные гены. Например, ген Ldr-I у мышей контролирует фе-нотипическое проявление гена В в эритроцитах (Riles, 1965; Shows, Ruddle , 1968). В эритроцитах овец и диких кроликов имеются гены, регулирующие фенотипическое проявление гена А. У рыб найдены гена, локализирующиеся в Х-хромосоме и модифицирующие проявление гена В ДЦГ в мьшечной ткани (Хлебодарова и др., 1978).
Изоферменты ДЦГ различаются электрофоретической подвижностью, аминокислотным составом, ферментативной активностью и другими свойствами. Наибольшей электрофоретической подвижностью обладает ЛДГ-І (Н ), т.е. анодная фракция. Медленней всех движется катодная фракция (М ), или ДЦГ-5; ДЦГ-х выявляется между ДЦГ-3 и ДЦГ-4 (Zinkham et al, , 1963; Goldberg, 1965).
Объект исследований. В связи с поставленной задачей в 1974--1980 гг. на базе Кондопожского и Пряжинского племзверосовхозов Карельской АССР были проведены 3 серии опытов, которые предусматривали :
1. определение активности ферментов в сыворотке крови песцов в 10, 20, 30, 60, 90, 120, 150 и 180-суточном возрасте;
2. определение активности изучаемых компонентов крови у взрослых зверей в разные сезоны года: зимой (январе), весной (апреле), летом (июле) и осенью (сентябре-октябре);
3. одновременное определение активности ферментов у щенков и взрослых зверей (самок) в период с июля по октябрь, т.е. с момента отсадки молодняка и до забоя.
Все опыты были поставлены на песцах обоего пола, что дало возможность выявить половые различия ферментов.
Всего под наблюдением находилось 347 здоровых зверей, о чем судили по результатам клинического осмотра и определению морфологического и биохимического состава крови (содержанию эритроцитов, гемоглобина, общего белка и др.) (Берестов, 1971, 1981). Песцы содержались на сбалансированном рационе питания, составленном по рекомендации НИШЗК.
Методы. Кровь, необходимую для анализа, получали из план-тарной вены (у IO-30-суточных щенков путем декапитации) утром до кормления. Сыворотку приготавливали обычным способом (Берестов, 1971, 1981). Общий белок, гематологические показатели крови и соотношение изоферментов лактатдегидрогеназы определяли в день взятия крови, активность ферментов - через 24 часа после него.
Для определения активности изучаемых ферментов использовали микроэкспрессметоды в системе ультрамикроэкспрессанализа А.А.Покровского (1962а), преимуществом которых является то, что при высокой точности и простоте вьшолнения анализов расходуется относительно небольшое количество крови (0,6 мл сыворотки для определения 10 показателей при выполнении параллельных проб) Это особенно важно при обследовании щенков. Активность лактат-дегидрогеназы (ДЦГ, К.Ф. I.1.1.27) определяли по методу Б.Ф.Коро вкина (1965), активность аспартат- и аланинаминотрансфераз (ACT, К.Ф. 2.6.I.I. и АЛТ, К.Ф. 2.6.1.2) -А.А.Покровскому (1962а), активность холинэстеразы (ХЭ, К.Ф. 3.I.I.I.8) - по На-телсону ( Natelson, 1963) и щелочной фосфатазы (ЩФ, К.Ф. 3.1. 3.1.) - по Джуду и Квоку (Judd, Kwok, 1964).
Общий белок в сыворотке крови определяли рефрактометрическим методом, его фракционный состав - методом электрофореза на бумаге (Берестов, 1971, 1981), концентрацию гемоглобина - по Г.В.Дервизу и Л.Н.Воробьевой (1959) в модификации Х.О.Григорьевой и Н.И.Кацнельсон (1969), количество эритроцитов подсчитывали при помощи автоматического электронного счетчика "Пикоскел" (ВНР).
Особенности обмена веществ и энергии в онтогенезе
Постнатальный онтогенез у животных, как правило, включает 3 основных этапа развития: период роста, зрелости и старости. Период роста существенно отличается от последующих, так как именно в это время организм интенсивно растет, формируются морфологические и биохимические его особенности, происходит адаптация к новой среде обитания и новому типу кормления (Аршавский, 1975).
У песцов период роста включает первые шесть месяцев пост-натального развития (Поздняков, 1954; Трубецкой, 1967; Берестов, 1971; Ильина, 1975). Щенки рождаются слабыми, недоразвитыми, с закрытыми глазами, без зубов, со слабо развитым волосяным покровом. На 14-17-й день прорезаются глаза и появляются молочные зубы, формируется первичный волосяной покров, в 3-4 месяца молочные зубы заменяются постоянными (Ильина, 1975; Данилов и др., 1979).
В естественных условиях песцы питаются молоком самки до 1,5-месячного возраста. В 40-дневном возрасте они могут забивать мышей и съедать их, а начиная с 2-х месяцев питаются той же пищей, что и взрослые звери (Данилов и др., 1979). С 2,5--3,5-месячного возраста щенки покидают нору и охотятся самостоятельно (Поздняков, 1954).
При клеточном разведении зверей приучают к подкормке с 3--недельного возраста, а на 40- 45-й день отсаживают от самки (Ильина, 1975).
Рост и развитие песцов протекает неравномерно: в первые 2-3 месяца отмечается наибольшее увеличение массы тела, затем темпы роста снижаются (Поздняков, 1954; Трубецкой, 1967; Анти-пов, 1968; Нагрецкий, 1971; Михайлова, 1975; Глазов, 1977). Завершается рост, в основном, к 6-месячному возрасту, дальнейшее увеличение массы тела связано с накоплением резервного жира, способность к отложению которого у данного вида животных чрезвычайно велика (Поздняков, 1954; Ильина, 1975).
Рост внутренних органов наиболее интенсивен в первые 3 месяца. К 6-месячному возрасту абсолютная масса сердца увеличивается, по сравнению с периодом новорожденности в 47 раз, легких -в 15, печени - в 45, почек - в 44 и селезенки - в 17 раз (Трубецкой, 1967).
В течение первых 4-х месяцев существенные преобразования происходят в биохимическом и морфологическом составах крови. Как у большинства млекопитающих в процессе индивидуального развития песцов в крови нарастает концентрация общего белка и глобулинов, относительное содержание альбуминов, напротив, уменьшается (Берестов, 1971). Число эритроцитов и концентрация гемоглобина к 3-месячному возрасту увеличивается в 1,4 раза (от 5,6 до 7,9 млн и от 58 до 83 мг%). В дальнейшем (4-5-месячный возраст) наблюдается повышение этих показателей. Возрастная динамика числа лейкоцитов характеризуется высоким уровнем в 1-месячном возрасте (8,7 тыс.) и снижением его в 4-месячном (до 5,8 тыс.) (Берестов, 1971; Узенбаева, 1979).
Сезонные биоритмы биологических процессов у песцов
Песцы клеточного разведения, несмотря на 80-летний период доместикации, в основном сохранили динамический стереотип своих диких сородичей. Для них характерна строгая последовательность основных биологических процессов - размножения, линьки и обмена веществ (Афанасьев, Перельдик, 1966; Берестов, 1971; Ильина, 1975; Данилов и др., 1979).
Периоды созревания репродуктивной системы, гона, продолжительности беременности, сроков щенения имеет у зверей четко выраженный сезонный характер. Гон проходит в конце февраля - начале марта, беременность длится 51-54 дня, в апреле-мае появляются щенки, которые к началу зимы практически становятся взрослыми (Ильина, 1975).
По физиологическому состоянию репродуктивной системы у пушных зверей различают 3 основные фазы: анаэструс (июнь-ноябрь), проэструс (декабрь-февраль) и эструс (февраль-март) (Абрамов, 1974). Анаэструс, или период .относительного покоя, продолжается около 5 месяцев. В это время пролиферативные процессы в половых органах замедлены, наблюдается атрезия фолликулов, сперматогенез отсутствует, уровень стероидных гормонов незначителен. В конце ноября начинается период проэструса. В это время активизируются пролиферативные процессы в половых органах, усиливается деятельность эндокринной системы. По данным А.Ф.Орлова (1952), в период предтечковых изменений в половой сфере зверей передняя доля гипофиза песцов (и лисиц) обладает наибольшей гонадотропной ак - 82 -тивностыо. Период проэструса сменяется стадией эструса, или течки; после чего у самок наступает беременность, а затем щенение, лактация и вновь период физиологического стерлитета (анаэструс).
Волосяной и кожный покров у песцов сменяются дважды в год. В январе и феврале мехообразовательные процессы находятся в состоянии относительного покоя. С конца февраля и в течение последующих 4-х месяцев (март-июнь) начинает стареть и выпадать зимний волос и развивается летний. В мае активная линька. К концу июня звери полностью очищаются от зимних волос. В это время они покрыты редкими подрастающими волосами летнего типа, развитие которых начинается еще в апреле. В июле и первой половине августа полностью вырастает летний волос. Начиная с конца августа и на протяжении последующих нескольких месяцев (сентябрь-ноябрь) осуществляется осенняя линька (выпадение летнего покрова и замена его зимним). К концу сентября мех голубых песцов полностью очищается от летних волос. Созревание зимнего волоса завершается к концу декабря (Калетина и др., 1957).
Летний мех отличается от зимнего. По данным Л.Г.Комарова (1968), летний волосяной покров песцов (вуалевых) в 1,5-2 раза короче зимнего, кроме того, у него тоньше кроющие волосы. Летом уменьшается густота волос на огузке (в 3 раза), спине (в 2 раза), боках и чреве (в б раз). Несмотря на то, что количественное соотношение волос различных категорий в летних и зимних шкурках остается примерно равным, в первых преобладают остевые волосы I, П-и 111 категории, а во вторых - ІУ категории.
Характеристика ферментов у щенков и взрослых зверей
Материал, представленный в предыдущих главах, убедительно свидетельствует о том, что как у щенков, так и у взрослых зверей активность изучаемых компонентов крови подвержена определенным изменениям. Основной причиной изменений у щенков являются особенности обмена веществ в период роста и развития животных. Однако не исключено, что определенное влияние оказывают и другие факторы - уровень кормления, качество пищи (Мосякин, 1979; Звягина, Нестерин, 1980; Бабак, 1983), резкие перепады температуры, не связанные со сменой времени года (Wojcik et al., 1979), сезонные биоритмы (Олейник, 1980) и др. В связи с чем для выявления возрастных особенностей ферментов и установления сроков их стабилизации на дефинитивном уровне была проведена серия опытов по одновременному определению активности ферментов у зверей, находящихся в одинаковых условиях, но отличающихся по возрасту, то есть у щенков и взрослых (самок).
Результаты этих исследований представлены в настоящей главе в виде таблицы 15 и рисунка 10.
Анализ полученных данных показал, что активность лактатде-гидрогеназы в период с июля по октябрь у щенков находилась в пределах 3,4-5,6 , у взрослых -3,0 5,0 мкмоля/мл (табл. 15). Динамика активности фемента, независимо от возраста животных, характеризовалась высоким уровнем в июле, снижением в августе--сентябре и повышением в последующие два месяца. Однако у щенков в 2-, 4-й 5-месячном возрасте активность фермента была выше, а в б-месячном - ниже, чем у взрослых (рис.Ю), причем, в первых двух случаях (в 2- и 4-месячном возрасте) различия достоверны, активность ЛДГ у щенков в эти периоды превышала уровень у взрослых в 1,3 и 1,2 раза (Р 0,01 и Р 0,05).
Молодняк отличался от половозрелых особей более высоким уровнем активности аспартатаминотрансферазы (табл. 15, рис. 10). Так,у 2-, 5- и б-месячных щенков ее величина равнялась 77,1 2,4, 58,3-2,3 и 89,0 4,2 ед. соответственно, у взрослых - 64,2 1,7, 48,1 2,5 и 74,6 2,4 ед. Следовательно, у молодых зверей по сравнению со взрослыми активность ACT была выше в 1,2 раза. Различия достоверны с вероятностью не менее 99,9 и 99%. В 4-месячном возрасте данный показатель соответствовал дефинитивным значениям.
Активность аланинаминотрансферазы у песцов в 2-месячном возрасте равнялась 42,8 1,5 ед., в 4-месячном понизилась до 35,5 1,8 ед., а затем повысилась до 37,9 3,2 в 5-месячном и 41,4 3,29 ед. в б-месячном возрасте, у взрослых зверей за этот период ее величина увеличилась от 31,6 1,2 до 40,5 2,2 ед. Таким образом, в период интенсивного роста зверей (2-месячный возраст) активность аланинаминотрансферазы была повышена по сравнению с уровнем во взрослом организме в 1,4 раза (Р 0,001). На последующих этапах развития данный показатель стабилизировался на дефинитивном уровне (Р 0,05).
