Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Состав костного мозга трубчатых костей различных животных, в разных возрастных категориях 7
1.2 Физиологические особенности развития костного мозга в видовом и возрастном аспекте 10
1.3 Препараты белковой природы из костного мозга для повышения общей резистентности и иммунореактивности организма 13
1.3.1 Препараты белковой природы, животного происхождения для повышения резистентности организма и иммунитета 13
1.3.2 Методы получения биологически активных веществ белковой природы животного происхождения 24
1.3.3 Костный мозг- как продуцент биологически активных веществ организма и предпосылки выделения их для использования в производстве...26
2. Материал и методы исследования
2.1 Объект исследования 34
2.2 Биохимические и физиологические методы исследования 36
3. Результаты исследования
3.1 Цитологический состав костного мозга сельскохозяйственных и диких животных разного возраста 39
3.2 Технология изготовления и биохимический состав препарата из костного мозга 54
3.2.1 Технология получения и хранение 54
3.2.2 Белковый состав препарата 57
3.3 Влияние клеточного состава костного мозга различных видов животных на содержание и биологическую активность препарата 64
3.4 Изменение физиологических показателей крови и естественной резистентности у лабораторных животных при воздействии испытуемых препаратов 67
3.4.1 Влияние изготовленного препарата на показатели естественной резистентности белых мышей 68
3.4.2 Сравнительная характеристика влияния ПКМЛ на содержание общего белкаи его фракций в крови белых мышей 72
4. Обсуждение полученных результатов 77
5. Выводы 82
6. Рекомендации для практического применения 83
Список использованной литературы 84
Приложение
- Состав костного мозга трубчатых костей различных животных, в разных возрастных категориях
- Физиологические особенности развития костного мозга в видовом и возрастном аспекте
- Цитологический состав костного мозга сельскохозяйственных и диких животных разного возраста
- Технология изготовления и биохимический состав препарата из костного мозга
Введение к работе
Актуальность исследования. Перспективным в плане иммунокор-рекции является применение белковых биорегуляторов. Костный мозг -один из источников иммунокомпетентных клеток, производными которых являются белки, применяемые в качестве модуляторов для повышения резистентности организма животных (Бударина A.M., 1980). В настоящее время охарактеризован гуморальный фактор костного мозга и изучены ei о некоторые физико-химические свойства (Петров Р.В., 1981). Известно, чго стимулятор антигенных популяций (САП) белковой природы, активность фракций коїоро-го зависит от количества содержащегося в них белка (Захарова Л.А., 1978). Кроме того, важной особенностью фактора костного мозга является то, чго эффект стимуляции антителообразования под влиянием надосадочной жидкости, полученной от культур клеток костного мозга, не зависит от генотипа доноров этих клеток (Петров Р.В., 1981). Получение биологически активных веществ из костного мозга домашних и сельскохозяйственных животных изучено по многим направлениям. Однако костный мозг диких животных Дальнего Востока и возможность использования его биологически активных веществ изучены не достаточно. Это является перспективное направление в дальнейшей работе с активной субстанцией костного мозга в создании новых препаратов для быстрой и направленной стимуляции выработки антител в организме и изучении воздействия данных препаратов на формирование повышенной резистентности и иммунитета.
Настоящая работа выполнена самостоятельно и является составной частью комплексной программы исследований кафедры эпизоотологии, паразитологии и микробиологии Дальневосточного государственного аграрного университета "Ветеринарное благополучие" (номер государственной регистрации 0120.0 503575).
Цель исследований: Изучить особенности влияния препаратов из костного мозга белковой природы на физиологические показатели крови животных.
Задачи исследований. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить клеточный состав костного мозга трубчатых костей лабораторных, сельскохозяйственных и диких животных.
2.Разработать способ получения из стволовых клеток костного мозга лисиц препарата белковой природы и изучить количественные и качественные характеристики препарата.
3. Изучить влияние биологически активных препаратов белковой природы из клеток костного мозга лисиц на физиологические показатели крови лабораторных животных.
Научная новизна. Впервые в условиях Дальнего Востока изучена в сравнении морфологическая структура клеточных популяций костного мозга трубчатых костей одного возраста сельскохозяйственных и диких живо і -ных. Разработана методика изготовления, хранения и использования биологически активных препаратов белковой природы из костного мозга диких и сельскохозяйственных животных. Введение в организм животных препарата из костного мозга лисиц (ПКМЛ) показало существенное влияние на физиологические изменения морфологического состава крови и показателей общей и специфической иммунореактивности организма мышей.
Теоретическая и практическая значимость. Экспериментальные материалы, характеризующие белковый состав препаратов из костного мозга, цитологический состав крови и костного мозга и показатели естественной резистентности животных в их взаимосвязи позволяют расширить и углубить научные знания о механизмах формирования в организме клеточной и гуморальной систем защиты.
Разработаны и предложены производству способы получения препарата белковой природы из костного мозга, взятия крови у лабораторных мышей (приоритетные справки № 2005119822 от 27.06.2005 и № 2006120240 от 08.06.2006 г). Основные положения, вынесенные на защиту
1 .Сравнительная характеристика клеточного состава костного мозга сельскохозяйственных, домашних и диких животных.
2.Влияние цитологического состава костного мозга трубчатых костей животных на содержание в нем белковых фракций, определяющих активность ПКМЛ.
З.Влияние препаратов из костного мозга лисиц на физиологические показатели крови лабораторных животных.
Апробация работы. Основные положения диссертации и экспериментальные материалы доложены и обсуждены на конференции, посвященной 50-летию Дальневосточного государственного аграрного университета (г. Благовещенск, ДальГАУ, 2000); Международной научно-практической конференции (г. Благовещенск, ДальГАУ, 2005); Шестой и Седьмой региональных научно-практических конференциях (г. Благовещенск, ДВВКУ, 2005; БГПУ, 2006); региональной научно-практической конференции «Молодые ученые агропромышленному комплексу Дальневосточного федерального округа» (г. Благовещенск, 2005) и Общеуниверситетских тематических научных и отчетных конференциях ИВМЗ ДальГАУ (г. Благовещенск, 1999, 2000, 2001, 2004, 2005, 2006), региональной научно-практической конференции «Аграрная наука на рубеже веков» (г. Красноярск, 2006).
Внедрение. Полученные результаты используются в учебной и научной работе на кафедре эпизоотологии, паразитологии и микробиологии Дальневосточного государственного аграрного университета, на кафедрах кормления сельскохозяйственных животных Красноярского государственного аграрного университета и Курганской государственной сельскохозяйственной академии, на кафедре терапии и клинической диагностики Бурятской государственной сельскохозяйственной академии, на кафедре внутрен-
них незаразных болезней, клинической диагностики, фармакологии, эпизоотологии и паразитологии Иркутской государственной сельскохозяйственной академии, на кафедре нормальной и патологической физиологии института ветеринарной медицины ОмГАУ, на кафедре биологии и ветеринарии Ярославской государственной сельскохозяйственной академии.
Публикации. Основные результаты научных исследований отражены в 9 печатных работах, в том числе в двух работах в центральной печати.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 103 страницах и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка литературы. Работа включает 22 таблицы, 7 рисунков. Список литературы включает 204 источника, из них 35 иностранных авторов.
Состав костного мозга трубчатых костей различных животных, в разных возрастных категориях
У млекопитающих основным центром кроветворения является красный костный мозг. В нем образуются эритроциты, зернистые лейкоциты, моноциты и тромбоциты. В костном мозге происходит и лимфопоэз.
Известно, что красный костный мозг находится в губчатом веществе плоских костей, позвонков и метафизах длинных трубчатых костей, желтый - заключен в диафизах трубчатых костей. Общий объем красного костного мозга зависит от пола, возраста, вида и физиологических особенностей.
У новорожденных во всех костях находится красный костный мозг. По мере роста организма красный костный мозг в трубчатых костях постепенно превращается в жировой (Фриденштейн, А.Я.,1980). Костный мозг состоит из соединительнотканной основы - стромы, представленной ретикулярной тканью, паренхимы (клетки крови) и кровеносных сосудов (Никитин В.Н., 1956).
Детальное изучение клеточного состава и структуры костного мозга началось с внедрения в клиническую практику метода стернальной пункции, предложенной М.И. Аринкиным в 1927 г., а затем прижизненного гистологического исследования пунктата подвздошной кости с помощью тре-панобиопсии (Аринкин М.И., 1949; Карпуть И.М., 1986). Прижизненное исследование костного мозга позволяет изучить функциональное состояние и особенности кроветворения при различных, и особенно патологических процессах.
В настоящее время стали изучать биологическую активность экстрактов иммунных органов животных (тимуса, костного мозга и селезенки) после убоя (Телишевская Л.Я., 1999), что позволило облегчить методы исследования костного мозга и исследовать клеточный состав и установить биологическую активность экстрактов костного мозга (Никитенко А.И., 1984). Процентное соотношение клеток в костномозговом пунктате называется миелограммой. Ее выводят на основании подсчета 500 или 1000 клеюк в наиболее тонкой части мазка. При этом учитывают все клетки костномозгового кроветворения. Необходимо иметь в виду, что процентное соотношение костномозговых клеток у разных видов животных неодинаково, а также подвержено и в норме в пределах вида большим колебаниям. Это связано с тем, что костный мозг постоянно перестраивается в зависимости от возраста и потребностей организма (Карпуть И.М., 1970; Лабунец И.Ф., 2000).
Наиболее изучен клеточный состав костного мозга сельскохозяйственных животных, для которых установлено, что в миелограмме здоровых животных процентное содержание клеток в одном и том же ряду возрастает соответственно степени дифференциации клеток.
Такая закономерность распределения клеточных форм названа И.А. Кассирским и Г.А. Алексеевым правилом гармонического развития и распределения костномозговых клеток по степени их дифференциации. Исключение из этого правила допускается только в отношении сегментоядерных лейкоцитов, содержание которых обычно ниже количества палочкоядерных вследствие быстрого поступления сегментоядерных лейкоцитов в циркулирующую кровь (Никитин В.Н., 1956).
Клеточный же состав костного мозга диких животных изучен крайне мало и в доступной литературе нами не найдено ни одного источника по данному вопросу. Наиболее же изучены биологические особенности лисиц и енотовидных собак: ареал вида, данные численности, биология популяции (Баранов П.В., 1896; Гептнер В.Г., 1971). К примеру, на Дальнем Востоке найдены следующие популяции лисиц: средне-амурская, зейско-буреинская, различия между которыми достигают высоких параметров. По данным В.Г. Юдина (1986) лисицы Зейско-Буреинской равнины длиннее и выше лисицы среднего Приамурья.
По литературным данным (Юдин В.Г., 1986) из хищных млекопитающих по особенностям строения тела лисица выгодно отличается от єною 9 видной собаки высотой в холке - 45,2 см и высотой в локте - 25,7 см в противовес данным енотовидной собаки - 31,0 см и 15,0 см соответственно. Это означает, что длина ее трубчатых костей больше и можно предположить, что и содержание костного мозга в них большее, а значит и клеточный и белковый состав богаче.
Р.В. Петровым и соавторами (1981) проводились исследования костного мозга другого характера. Был охарактеризован гуморальный фактор костного мозга, стимулирующий выработку антител. Стало известно, что в состав молекулы стимулятора антигенных популяций (САП) входят белковые и рибонуклеиновые компоненты, что было показано с помощью радиоактивной метки (Петров Р.В., 1978). О присутствии в молекуле САП соединений нуклеиновой природы свидетельствует также термостабильность данной субстанции. О присутствии белковых компонентов в молекуле САП свидетельствуют данные Л.А. Захаровой и др., (1978) об отмене стимулирующей активности культур клеток костного мозга после ее обработки про-назой. Показано также, что проявление стимулирующей активности фракции, выделенной из надосадочной жидкости, зависит от количества содержащегося в ней белка (Захарова Л.А. и др., 1978). Ими были проведены опыты по изучению коэффициента стимуляции в регионарном лимфатическом узле при введении активной фракции костного мозга в подушечку одной из задней конечностей мыши в различных дозах, откалиброванных по белку. Было выяснено, что максимальный коэффициент стимуляции (5,0) наблюдается при дозе белка 100 мкг.
Причем особенностью данного фактора костного мозга при реализации его стимулирующего эффекта, является отсутствие барьера гистосовме-стимости. Проводились опыты, в которых клетки костного мозга получали от мышей линии А, крыс линии August, кроликов породы шиншилла, а также ребра теленка. Выяснили, что эффект стимуляции антигелообразования под воздействием надосадочных жидкостей, полученных после культивирования клеточных суспензий костного мозга не зависит от генотипа доноров его клеток, активность которых проявляется при введении мышам надоса-дочных жидкостей, полученных после культивирования как сингенных клеток так и клеток животных других видов (ксенгенные клеток).
Коэффициенты стимуляции синтеза Ig в ксенгенных смесях практически не отличались от коэффициентов стимуляции в сингенных смесях.
Подобные результаты были получены А.А. Власовым (1979) и при исследовании супрессивного влияния клеток костного мозга на индукцию иммунного ответа к эритроцитам барана в культуре клеток селезенки.
Таким образом, активные фракции костного мозга для иммунизации животных с целью иммунокоррекции могут быть получены, от разных видов животных и будут эффективны не взирая на их генотипы. Вопрос относительно возраста доноров этих биологически активных субстанции остается мало изученным.
Физиологические особенности развития костного мозга в видовом и возрастном аспекте
Костный мозг представляет собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из элементов миелоидного, лимфоидного, эритроидного, мегака-риоцитарного и моноцитарного рядов, находящихся в различных стадиях развития (Чертков И.Л., 1977; Петров Р.В. с соавт., 1981) и является первичным источником предшественников иммунокомпетентных клеток и фагоцитов. Недифференцированная стволовая клетка костного мозга, мигрируя в тимус, пролиферирует и дифференцируется в иммунокомпетентную лимфо-идную клетку (Т-лимфоцит), колонизирующую лимфатические узлы, селезенку и другие лимфоидные образования.
Вторая группа лимфоцитов (В-лимфоцитов), которые в большом количестве встречаются во вторичных лимфоидных органах, своим происхождением также связана с костным мозгом (Хрущев Г.К., 1966).
Развитие костного мозга у млекопитающих начинается в период образования хрящевого скелета. В эмбриональный период миелогенному костному мозгу предшествует остеобластический костный мозг. У эмбрионов крупного рогатого скота, овцы и свиньи, как отмечает И.М. Карпуть (1986) в возрасте 8-Ю недель костный мозг начинает функционировать как кроветворный орган (Граков Н.Н., 1981).
Многочисленными исследованиями (Sterzl J., 1971; Лукин Е.И., 1989; Friedenstein A J., 1992) установлено, что способность к иммунному ответу, возникая на определенной стадии онтогенеза, в зрелом возрасте достигает своего максимума, а затем, по мере старения, снижается. Е.А. Клебанова (1966) сообщает, что у особей разных видов и разных экологических условий обитания антителообразующая способность выявляется в различные возрастные периоды.
Следует подчеркнуть, что созревание различных функций указанных систем, так же как и способности особей разных видов отвечать на различные антигены, происходит не одномоментно (Петров Р.В. с соавт., 1981), а постепенно в виде дискретных стадий онтогенетического развития.
A. Silverstein и К. Kraner (1965) отмечают, например, что у овец иммунный ответ к бактериофагу ФХ174 регистрируется на 35-й день эмбрионального развития, к фертину - на 65-й день, к яичному альбумину - на 125-й день, к дифтерийному анатоксину, антигенам сальмонелл или БЦЖ - после рождения. Увеличение количества инъецируемого антигена крольчатам и поросятам обеспечивает продукцию антител в более раннем возрасте (Sterzl J., Trnka Z.,1957; Silverstein A., 1972; Петров Р.В. с соавт., 1981).
J. Sterzl, Z. Trnka (1957, 1971) изучали сравнительное развитие лимфо-идной ткани у особей разных видов. У мышей и кур, характеризующихся созреванием иммунологической реактивности в неонатальном периоде, лимфо-идная ткань по отношению к продолжительности эмбрионального периода развивается значительно позже, чем у человека, свиней и овец, способных к иммунному ответу в течение эмбрионального развития. Это показывает, что способность к иммунному ответу появляется после развития лимфоидной ткани. Различные периоды созревания иммунологической реактивности им-мунокомпетентных клеток и сроки достижения максимальных величин анти-телообразования регистрируются не только у особей разных видов, но и у животных одного и того же вида. Р.В. Петров с соавт. (1981) выяснили, что оппозитность реагирования разных особей одного и того же вида на однозначную иммунизацию совпадает с периодом созревания иммунологической реактивности и сохраняется до старости. Козлов В.А., Р.В. Петров (1970) в своих опытах мышей линии СВА иммунизировали эритроцитами барана в различные возрастные периоды с 1-го дня жизни по 547-е сутки. Определяли число антителообразующих клеток и установили, что по мере старения относительное число этих клеток в селезенке мышей уменьшается и в возрасте 18 месяцев статистически достоверно не отличается от такового в возрасте 12 месяцев. Из исследований, проводимых Р.В. Петровым с соавт., (1981) известно, что в дальнейшем, по мере созревания и старения организма, происходит постепенное снижение относительного числа стволовых клеток.
По данным В.П. Кветкова (1992) при экологически одинаковых или близких условиях существования у разных индивидуумов одной и той же популяции формируются близкие по составу гуморальные и иммуноглоболино-вые системы. При экологически идентичных или сходных условиях существования доноров и реципиентов, сыворотки, полученные от первых, не могут быть эффективными против эндемических инфекций у второй. Подразумевается, что этот принцип значительно усиливается, если в качестве доноров выступают взрослые особи с наиболее длинной антигенной историей, а в качестве реципиентов иммунологически незрелые особи с короткой антигенной историей (Шульга Н.Н., 2005).
Таким образом, становиться ясным, что у особей, не достигших зрелого возраста костный мозг богаче стволовыми клетками, и содержит больше биологически активных веществ, необходимых для получения иммуномоду-ляторов, причем выделенный от животных экологически разных условий обитания и видовой принадлежности (Беляев Д.К., 1992).
Стимулирующие препараты, белковой природы, повышающие жизнедеятельность человека или животных, по своему происхождению могут быть природными или синтетическими. Препараты природного происхождения обладают специфическим и общим неспецифическим положительным действием на весь организм. Ряд авторов (Кивалкина В.П., 1974; Карпуть И.М., 1975, 1979; Селиванов А.В. и соавт., 1980; Попов В.И., 1984; Чекишев В.М., Файзрахманов Ш.Р.,1985; Складчиков Р.В., 1987; Яковлев С.С, 1987) сообщают нам, что среди них широкое распространение получили вакцины, сыворотки, тканевые препараты, лизаты, органопрепараты, антибиотики.
Тканевые препараты были введены в практику В.П. Филатовым (1933). Принцип их получения основан на создании для органов и тканей, отделенных от животного, условий (факторов среды), затрудняющих их жизнь и обеспечивающих биологическую перестройку. В результате вырабатываются вещества, оказывающие стимулирующее действие на организм, которые назвали «стимуляторами биологического происхождения» или «биологическими стимуляторами» (Карташов Н.И., Цупило А.А., 2001; Федоров Ю.Н., 2005).
Используя общие принципы В.П. Филатова, другими авторами (Ка-лашник И.А., 1990) были предложены препараты, отличающиеся по исходному сырью (различные органы и ткани животного), консистенции (кусочки ткани, взвеси, экстракты, мази, порошоки), способу механической подготовки (гомогенизатор, шаровые мельницы, мясорубка, растирание в ступке), использованию определенного органа, ткани или их сочетании в различных пропорциях, методам и срокам стерилизации (автоклавирование при различной температуре и продолжительности, кипячение, дробная пастеризация, ультразвук), фильтровальным материалом (марля, миллипоровые мем 14 браны, сита с различными ячейками) (Карташов Н.И., Цупило А.А., 2001; Беляев В.И. с соавт., 2002).
Цитологический состав костного мозга сельскохозяйственных и диких животных разного возраста
В научной литературе мы нашли информацию, не позволяющую достоверно обобщить сведения о клеточном составе и концентрации белков, отдельных фракций белка в костном мозге трубчатых костей сельскохозяйственных животных, а об их содержании в костном мозге диких животных имеется лишь незначительная информация. В настоящее время этот вопрос вызывает определенный интерес, т.к. клетки костного мозга являются продуцентами биологически активных веществ, но и источником биологически активных веществ белковой природы, действие которых на организм изучено не в полном объеме.
Изучая, морфологическую структуру клеточных популяций костного мозга трубчатых костей мы выяснили, что использование простых методов окраски не достаточно эффективно. Так, клетки эритроидного ряда клеточных популяций кур окрашиваются плохо, а в мазках коз и лошадей практически не окрашиваются клетки как эритроидного, так и лимфоидных рядов. Увеличение экспозиции окрашивания приводило к перекрашиванию мазков и плохой дифференциации клеток (таблица 1). Поэтому мы использовали комбинированный метод окраски с отработанной нами оптимальной экспозицией окрашивания, что позволило дифференцировать не только эритроциты, но также все клетки, входящие в состав костного мозга.
Среди клеток костного мозга различали клетки ретикулярной стромы и клетки кроветворной ткани костного мозга. Анализируя миелограммы исследованных сельскохозяйственных животных, выяснили, что наибольшее количество лимфоцитов у свиней (19%) и коров (9-10%)); моноцитов у коров (1,6%) и свиней (1,2%); эритробластов у лошадей (1,5%), кур (1,4%), коров (0,6%); плазматических клеток у лошадей (1,2%) и коров(0,7%) (таблица 3).
Костный мозг постоянно перестраивается в зависимости от возраста и потребностей организма в связи, с чем наряду с оценкой миелограммы, важное значение имеет порциальная формула различных форм костномозговых клеток (костномозговой индекс созревания нейтрофилов (КИ). Выяснили, что величины костномозгового индекса исследованных животных следующие. У лошадей КИ наибольший и составляет 1,30±0,47, что свидетельствует о задержке созревания клеток, у остальных животных он находится в преде 43 л ах нормы, у поросят составляет 0,41 ±0,03, у крупного рогатого скота 0,44±0,42, что подтвердилось статистически (Р 0,01).
На основании этого было выяснено, что основная масса костного мозі а диких животных представлена активным красным мозгом (70%), тогда как у сельскохозяйственных животных основная часть костного содержимого представлена желтым костным мозгом (60%).
Анализируя миелограммы диких животных в сравнении с сельскохозяйственными, выяснили, что клеточный состав костного мозга лисиц значительно разнообразнее костномозгового клеточного состава енотовидных собак и поросят. Состав клеток костного мозга представлен в таблице 4. Таблица 4 - Сравнительная характеристика миелограмм костного мозга ди ких и сельскохозяйственных животных
Сравнив показатели клеточного состава костного мозга диких и сельскохозяйственных животных, получили следующие результаты. Продуцентами биологически активных веществ являются лимфоциты, моноциты, эритробласты, плазматические клетки костного мозга.
Моноцитов больше у щенков лисиц (4,60%), чем у поросят (1,20%), у щенков енотовидных собак обнаружено наименьшее количество (0,98%) (Р 0,01) (таблица 4). Плазмоцитов больше найдено у щенков енотовидных собак (0,66%) и у поросят (0,64%), у щенков лисиц этот вид клеток обнаружен в единичном количестве (Р 0,01). Эритробластов больше оказалось у щенков лисиц (4,80%о), у поросят их 0,48%), у щенков енотовидных собак этот вид клеток найден в единичном количестве (Р 0,05). Малых лимфоцигов большее количество содержалось у диких животных: у щенков лисиц 20,33%, у щенков енотовидных собак 15,00%), у поросят же их 11,48%. Большее количество средних и больших лимфоцитов содержал костный мозг щенков лисиц (10,16%) и 15,66%) соответственно), у щенков енотовидных собак эти виды клеток не были обнаружены (Р 0,01).
Сравнивая полученные результаты миелограмм щенков лисиц и енотовидных собак между собой, отметили следующее. Достоверно больше интересующих нас клеток содержал костный мозг щенков лисиц (лимфоцитов 20,33%), моноцитов 4,60%, эритробластов 4,80%), исключение составило содержание плазмоцитов (у щенков енотовидных собак их 0,66%). Кроме того, в мазках костного мозга щенков енотовидных собак и лисиц, в отличие от поросят, вообще не были обнаружены остеобласты и метамиелоциты. У щен 46 ков лисиц - плазмоциты и мегакариоциты найдены в единичном количестве. У щенков енотовидных собак - не были обнаружены большие и средние лимфоциты, а эритробласты и миелоциты найдены в единичном количестве.
Моноцитов больше обнаружено у щенков лисиц (4,60%о), у щенков енотовидных собак найдено меньшее количество - 0,98% (Р 0,05). Костный мозг щенков собак содержал наибольшее количество сегментоядер-ных нейтрофилов - 55,0%), палочкоядерных нейтрофилов - меньшее 4,0%).
Базофилов наибольшее количество содержалось в костном мозге щенков енотовидных собак (2,33%) и лисиц (2,16% ), меньшее у щенков домашних собак (0,5% ). Кроме того, в мазках костного мозга всех исследованных животных вообще не были обнаружены остеобласты и метамиелоциты. Мие-лоциты были найдены только у щенков лисиц (6,66%). Мегакариоциты и плазмоциты обнаружены у щенков енотовидных собак (0,66%), у щенков лисиц и собак обнаружены в единичном количестве (Р 0,05).
Большие лимфоциты в мазках щенков енотовидных и домашних собак также не обнаружены.
Количественный и качественный состав клеток костного мозга зависит от возраста, породных, физиологических особенностей, условий обитания и ряда других факторов, как в пределах вида, так и в межвидовом отношении.
Исследование физиологических особенностей развития костного мозга в видовом и возрастном аспекте позволили не только изучить состав и особенности строения костного мозга различных животных, но и подобрать наиболее ценный материал для получения стимуляторов антигенных популяций. В связи с этим мы исследовали клеточный состав костного мозга свиней и крупного скота, а также лисиц, енотовидных собак и домашних собак, находящихся в разных возрастных категориях. В костном мозге свиней, выращенных в Амурской области, преобладающими клетками среди лейкоцитов являются нейтрофилы (таблица 6). Для этих животных количество палочкоядерных нейтрофилов составляет в возрасте 5-8 недель - 25,1%; у 2-3 месячных - 28,0%; у 4-6 месячных - 32,0% различия достоверны (Р 0,01).
Основную массу клеток костного мозга крупного рогатого скога в этих возрастных группах составляют лимфоциты: 6,4%; 7,5% и 9,9% соответственно. В мозге трубчатых костей собак достоверно преобладают сегментоя-дерные нейтрофилы: 14,0; 17,3; 15,2% (Р 0,001) у разных возрастных групп соответственно.
У диких животных, добытых на Дальнем Востоке, соотношение мозговых клеток следующее. Основными клетками в составе костного мозга лисиц и енотовидных собак являются эозинофилы. У лисиц - 4,1; 10,9; 7,0% (различия достоверны) соответственно указанному возрасту. У енотовидных собак: соответственно 4,0 (Р 0,05); 11,6 (Р 0,001); 7,6% (Р 0,05). Кроме того, в достоверно преобладающем состоянии находятся лимфоциты и плазмоциты, синтезирующие различные классы иммуноглобулинов (таблица 6). Сравнивая, межвозрастные показатели цитологического состава исследованных животных обнаружили, что костный мозг молодых особей практически всех изученных видов по содержанию морфологических показателей значительно богаче (различия достоверны - таблица 6).
Технология изготовления и биохимический состав препарата из костного мозга
Нами изготавливались препараты, белковой природы из костного мозга трубчатых костей сельскохозяйственных и диких животных (лисиц). Технология получения препарата включает ряд этапов (рисунок 4). 1.Клетки костного мозга брали от клинически здоровых сельскохозяйственных животных в благополучных по инфекционным болезням хозяйствах и диких животных, добытых охотой. Трубчатые кости отделяли от мышечной ткани. 2.В полученных от лабораторных животных трубчатых костях и небольших диких животных создавали отверстия в верхней и нижней части, от крупных животных и птиц производили распил костей. 3.Мозговое вещество из бедренной кости вымывали в колбу и суспендировали с помощью шприца средой 199 через созданные отверстия, либо распилы. Тщательно перемешивали содержимое колбы до однородного состава пипетированием. Полученную клеточную суспензию пропускали через капроновые фильтры d 10 см для тщательной очистки от желтого костного мозга и отмывали 3 раза охлажденной средой 199 (либо Игла). Фильтры готовили из капроновых изделий текстильной промышленности ГОСТ 8541-94 ТУ-17-09-182-92. Перед употреблением фильтры кипятили в дистиллирован ной воде 3 раза по 15 мин. Фильтрат подвергали центрифугированию в течение 7 минут при 3 тыс. об/мин. 4. Осадок, вместе с надосадочной жидкостью в центрифужных пробирках подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере. 5. Для выделения белка и освобождения от обломков клеток, содержимое центрифужных пробирок фильтровали через капроновые фильтры. Из осадка делали мазки, окрашивали по общепринятым методикам и просматривали под микроскопом - клетки в них не обнаруживали (гомогенная масса). Следовательно, все биологически активные вещества переходили в раствор. 6. Выделение общего белка проводили следующим образом.
В стаканы для центрифугирования с раствором белков добавляли 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУК) из расчета на 5 капель раствора белка 2 капли раствора кислоты. 7. Для лучшего осаждения белков содержимое стаканов нагревали (40-60С). Экстракты для полного осаждения оставляли на 12 часов в холодильнике при температуре +4С. 8. Осадок белков отделяли от раствора центрифугированием при 1700 об/мин в течение 5 мин. 9.0садок в центрифужных пробирках обрабатывали 0,5%-ным рас і вором NaOH, добавляя по каплям до получения нейтральной реакции белкового раствора. 10.Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергали диализу. Для этого раствор белка помещали в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) целлофановой мембраной. Диализ проводили проточной водой в течение 1-2 суток, при непрерывной подаче и в течение нескольких часов в дистиллированной воде. Отсутствие кислоты контролировали нейтральной реакцией с индикатором.
При недостатке в крови животного организма общих белков, в т.ч. иммунных, понижается иммунобиологическая реактивность, что способствует возникновению различных заболеваний. Синтез Jg можно увеличить за счет введения белковых веществ в организм в виде препаратов, способствующих синтезу антител.
Выбор метода. В процессе экстрагирования белков из клеточных суспензий костного мозга мы изучали эффективность различных методов выделения белков (методом осаждения трихлоруксусной кислотой и методом высаливания белков сернокислым аммонием), из одинакового количества костного мозга, которое составило 5,44±0,72 г, от каждого вида животных. Масса выделенных белков из костного мозга свиней, методом осаждения трихлоруксусной кислотой составила 200,0±0,260 мг (100%), тогда как методом высаливания 112,1±0,60 мг (100%) белка. Белок представлял собой сухой аморфный порошок серо-коричневого цвета.
При выделении белков из клеточных суспензий костного мозга исследованных диких животных получили следующие результаты. Большее количество белка было выделено методом осаждения трихлоруксусной кисло і ой. У лисиц экстрагировано 136,6± 8,9 мг (68 %) белка, у енотовидных собак 91,6 ± 4,4 мг (45,8%) белка. А методом высаливания белков сернокислым аммонием было выделено 95,0±2,8 мг (84,7%) и 55,0±2,8 мг (49,0%) белка соответственно.
Эффективность выделения белков костного мозга представлена в таблице 9. Это доказывает, что метод осаждения белка из клеток костного мозга сельскохозяйственных и диких животных трихлоруксусной кислотой достоверно более эффективен, для дальнейшего осаждения белковых молекул мы остановились именно на нем.
Общий белок. С помощью рефрактометра мы определяли процентное содержание общего белка в костном мозге сельскохозяйственных и диких животных, выделенного методом осаждения трихлоруксусной кислотой. Эти значения составили для поросят 5,56±0,02% общего белка, для лисиц и енотовидных собак - 7,14±0,01 и 6,45±0,20 % соответственно (рисунок 5).
Рисунок 5 - Содержание общего белка в костном мозге диких и сельскохозяйственных животных Следовательно, количество и соотношение общего белка в составе костного мозга сельскохозяйственных и диких животных имеет индивидуаль 59 ные видовые колебания, и зависят от физиологического состояния организма. Эти различия статистически подтвердились (Р 0,01).
Белковые фракции. Исследованные нами полученные препараты на фракционный состав белка показали следующие результаты.
На долю иммуноглобулинов в белковом препарате из костного мозга приходится основная часть от общего количества белков. Мы выяснили, что уровень иммуноглобулинов у разных видов животных имеет широкий диапазон индивидуальных колебаний. Так, наименьшее содержание иммунных белков обнаружено у поросят %Е уц_ у2 - 30,0±0,20, а наибольшее у диких животных - лисиц и енотовидных собак: %1 у1+ у2 - 32,0±0,20 и 31,4±0,9 соответственно (Р 0,01), а меньшее содержание а - глобулинов обнаружено у поросят - 19,1 ±0,26 г/л, большее у лисиц и домашних собак - 24,9±0,5 г/л и 23,6±0,23 г/л соответственно. У собак и лисиц также большее содержание р -глобулинов соответственно 15,2±0,20 г/л и 15,1 ±0,28 г/л, меньшее у порося і - 12,7=4= 0,10 г/л (таблицы 10, 11, 12, 13).
Таким образом, ясно, что основным из числа костномозговых белков является у-глобулин. Установлено, что дикие животные содержат в костном мозге большее (31,4±0,90-32,0±0,20 г/л) количество у-глобулина, а и 0-глобулины занимают меньший объем.
