Содержание к диссертации
Введение
1. Снижение сократительных свойств 17
2. Уменьшение мышечной массы и размеров мышечных волокон 21
3. Изменения миозинового фенотипа и системы электромеханического сопряжения в условиях микрогравитации 23
Факторы гравитационной разгрузки, влияющие на снижение сократительных свойств 27
Сократительные свойства в условиях тренировки 31
Методы обработки и анализа материала 35
Забор и хранение экспериментального материала 35
Обработка экспериментального материала 36
1. Анализ сократительных свойств единичных скинированных мышечных волокон 36
2. Иммуногистохимический анализ мышечных срезов, окрашенных моноклональными антителами против SERCAI и SERCA И 40
3. Измерение базальной концентрации ионов кальция в миоплазме мышечных волокон ти. soleus 43
Статистическая обработка результатов 46
4. Организация исследований, результаты 47
4.1. Видовая специфичность сократительных характеристик одиночных волокон млекопитающих 47
4.2. Эффекты гравитационной разгрузки 50
4.2.1. Исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц космонавтов до и после длительного космического полета 50
4.2.2. Исследование сократительных характеристик единичных волокон т. soleus крыс в период 3-х и 7-дневного восстановления после 2-недельного снятия опорной нагрузки 54
4.2.3. Системные механизмы. 7-ми суточная «сухая» иммерсия 59
4.2.4. Клеточные механизмы. Накопление ионов кальция в разгруженном волокне 65
4.3. Эффекты тренировки. Аэробная тренировка на велоэргометре в
интервальном режиме 72
5. Обсуждение 81
5.1. Видовая специфичность сократительных характеристик одиночных волокон т. soleus млекопитающих 81
5.2. Эффекты гравитационной разгрузки 83
5.2.1, Исследование сократительных свойств и некоторых параметров
системы электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц
космонавтов до и после длительного космического полета 83
5.2.2. Исследование сократительных характеристик единичных волокон т. soleus крыс в период 3-х и 7-дневного восстановления после 2-
недельного снятия опорной нагрузки 87
5.2.3. Системные механизмы. 7-ми суточная «сухая» иммерсия 90
5.2.4. Клеточные механизмы. Накопление ионов кальция в разгруженном волокне 93
5.3. Эффекты тренировки. Аэробная тренировка на велоэргометре в
интервальном режиме 97
6. Заключение 101
Список литературы
- Снижение сократительных свойств
- Уменьшение мышечной массы и размеров мышечных волокон
- Факторы гравитационной разгрузки, влияющие на снижение сократительных свойств
- Видовая специфичность сократительных характеристик одиночных волокон млекопитающих
Введение к работе
Актуальность проблемы
Пребывание в условиях реальной или моделируемой гравитационной разгрузки приводит к значительным изменениям сократительных характеристик мышечных волокон млекопитающих (Mounier et al., 2000, Stevens et al., 1993, Widrick et al., 1998-2000). Некоторые авторы связывают изменение сократительных свойств с изменением объёма миофибриллярного аппарата (Mounier et al., 2000, Stevens et al., 1993). В то же время, показано, что изменение силы изолированных волокон оказывается более глубоким, чем изменение их структурных параметров (Widrick et al., 1998-2000). Итак, сократительные свойства отдельных мышечных волокон могут зависеть от: объёма сократительного аппарата; качественного и количественного состава миофибриллярных белков; от параметров системы электромеханического сопряжения (в том числе, от кальциевой чувствительности миофибрилл); жесткости мышечных волокон.
Роль каждого из этих факторов в процессе снижения сократительных свойств мышечных волокон и клеточные механизмы такого снижения при гравитационной разгрузке в значительной степени остаются неизученными.
В мышечном волокне кальций не только участвует в регуляции метаболических процессов, но и выполняет основную роль в электромеханическом сопряжении, обеспечивающем передачу сигнала о мышечном сокращении на миофибриллы. Согласованная работа кальциевых каналов и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума обеспечивает тонкую регуляцию сократительной активности мышечных волокон.
О чувствительности миофибрилл к ионам кальция обычно судят по характеристикам кривой «кальций-сила», отражающей зависимость изометрического напряжения изолированных, как правило, скинированных волокон от концентрации кальция в растворе (Goblet et al., 1987). При этом, сдвиг кривой вправо (в сторону меньших значений рСа и соответственно больших значений концентрации ионов кальция) свидетельствует о снижении чувствительности миофибрилл к ионам кальция. Известно, что, как у животных (крыс и обезьян), так и у человека после космического полета наблюдается снижение Са-чувствительности миофибрилл (Mounier et al., 2000, Stevens et al., 1993, Widrick et al., P98). Такой же сдвиг кривой «Са-сила» впразо был выявлен и в условиях моделирования действующих факторов невесомости на Земле: в экспериментах с вывешиванием крыс (McDonald et al., 1995) и в условиях антиортостатической гипокинезии в исследованиях с участием добровольцев (Widrick et al., 1998). В то же время, механизмы внутриклеточной сигнализации, зависимые от сократительной активности волокна in vivo, и запускающие цепь событий, ведущую к снижению Са-чувствительности миофибрилл до сих пор неизвестны.
Цель работы состояла в изучении закономерностей и механизмов изменений сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц человека и животных при гравитационной разгрузке и тренировке.
і БИБЛИОТЕКА j
Задачи работы:
исследовать сократительные свойства изолированных мышечных волокон, а также характеристики клеточных маркеров электромеханического сопряжения у человека и животных, подвергнутых воздействию реальной и моделируемой гравитационной разгрузки;
оценить роль системных и клеточных механизмов в изменении сократительных характеристик волокон познотонических мышц в условиях гипогравитации;
исследовать сократительные свойства и кальциевую зависимость сокращений изолированных мышечных волокон при физической тренировке у человека.
Научная новизна работы:
впервые обнаружено, что гравитационная разгрузка приводит к перераспределению экспрессии изоформ белков Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, а именно увеличивается SERCAI типа (быстрого типа);
впервые установлено, что в 3-х и 7-дневный период возвращения к опорной нагрузке после 14-дневной гравитационной разгрузки не происходит восстановления сократительных возможностей одиночных мышечных волокон;
впервые показано, что в группах реадаптации как в течение 3, так и 7 дней увеличилась доля гибридных волокон, экспрессирующих SERCA медленного и быстрого типа (I и II);
впервые выявлено, что стимуляция опорного входа стопы позволяет предотвратить уменьшение сократительных возможностей волокон т. soleus человека;
впервые показано и доказано, что опорная стимуляция предотвращает уменьшение чувствительности миофибрилл к свободным ионам кальция;
впервые обнаружено, что применение кальций-связывающего агента позволяет полностью предотвратить снижение кальциевой чувствительности миофибриллярного комплекса в условиях гравитационной разгрузки;
впервые показано, что внутрибрюшинное введение ЭГТА на фоне гравитационной разгрузки приводит к предотвращению процессов изменения экспрессии кальциевых помп саркоплазматического ретикулума;
впервые установлено, что 4-недельная тренировка в интервальном режиме приводит к увеличению удельной силы одиночных мышечных волокон т. vastus lateralis человека.
Научная и практическая значимость
Полученные результаты расширяют представления о роли некоторых факторов, влияющих на сократительные свойства одиночных волокон скелетных мышц в условиях гравитационной разгрузки и тренировки. Эти результаты имеют большое практическое значение, поскольку исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения в мышцах человека при моделируемой и реальной гравитационной разгрузке позволяет оценить эффективность подходов, направленных на уменьшение или предотвращение негативного влияния невесомости на мышцы.
Результаты исследования используются в учебном процессе аспирантов ГНЦ РФ - Института медико-биологических проблем РАН.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Снижение максимальной силы скинированных волокон т soleus в условиях гравитационной разгрузки обусловлено устранением опорного стимула.
-
Снижение сократительных возможностей мышечных волокон при гравитационной разгрузке связано с накоплением ионов кальция в миоплазме.
-
Тренировка на велоэргометре в интервальном режиме, которая часто используется в подготовки спортсменов разных специализаций, приводит к увеличению удельной силы единичных волокон.
Апробация работы
Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на 32-ой и 34-ой Европейских мышечных конференциях (Монпелье, Франция, 2003; Дебрецен, Венгрия, 2005); 24-ом, 25-ом и 26-ом Международных гравитационных физиологических съездах (Санта-Моника, США, 2003; Москва, 2004; Кельн, Германия, 2005); 5-м Конгрессе Итальянской ассоциации миологии (Неаполь, Италия, 2005); Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2004); 2-ой и 3-ей Международных конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2004, 2005); Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная дню космонавтики (ИМБП, Москва, 2002-2005).
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая биология и физиология» 27 сентября 2005 года
Публикации
По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания организации экспериментов, изложения результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 123 страницах печатного текста, включает 24 рисунка, 9 таблиц и список литературы из 129 наименований.
Снижение сократительных свойств
Сокращением мышечного волокна управляют двигательные нейроны, которые выделяют нейромедиатор ацетилхолин в нервно-мышечные соединении (синапсы). Ацетилхолин диффундирует через синаптическую щель и взаимодействуют с ацетилхолиновыми (холинэргическими) рецепторами плазматической мембраны мышечных клеток. Это вызывает открывание трансмембранных ионных каналов и деполяризацию клеточной мембраны (образование потенциала действия). Потенциал действия быстро распространяется по всем направлениям от нервно-мышечного соединения.
Переносу потенциала действия на саркоплазматический ретикулум (СР) индивидуальной миофибриллы способствуют поперечные трубочки Т-системы, представляющие трубчатые впячивания клеточной мембраны и находящиеся в тесном контакте с индивидуальными миофибриллами [7]. Деполяризация плазматической мембраны передается через Т-трубочки на потенциал-управляемый мембранный белок прилегающей мембраны СР, который открывает Са-каналы (Рис. 1). Результатом является выброс ионов Са2+ из СР в пространство между филаментами актина и миозина до уровня 10"5 М. В конечном итоге выброс ионов Са2+ является пусковым механизмом процесса сокращения миофибрилл. Количественная зависимость между концентрацией свободного Са2+ в саркоплазме и силой мышечного сокращения была установлена сравнительно недавно. Для проведения анализа частично или полностью разрушали поверхностную мембрану и оголенные миофибриллы обрабатывали растворами кальция различной концентрации. Сила возрастает от нуля при концентрации кальция около 10"8 М до максимального значения при концентрации кальция около 5хЮ"6М. Данная зависимость между силой и концентрацией Са2+ аналогична зависимости между АТФазной активностью (скоростью гидролиза АТФ) гомогенизированных миофибрилл и концентрацией Са "\ Такое совпадение характеристик наводило на мысль, что Са2+ служит кофактором АТФазной активности миозина. Но оказалось, что это не так. АТФазная активность чистого раствора миозина довольно низкая, но сильно возрастает при добавлении очищенного актина. Это указывает на то, что АТФазный центр миозина активируется при связывании миозина с актином. В интактной мышце активация АТФазного центра миозина осуществляется при присоединении поперечного мостика к активному филаменту. Эксперименты, проведенные в лаборатории Эбаши, показали, что тропонин и тропомиозин, лежащие вдоль актиновой спирали, препятствуют присоединению миозиновых поперечных мостиков к актину [8]. Тропонин - единственный белок в актиновых и миозиновых филаментах поперечнополосатых мышц позвоночных животных, имеющий высокое химическое сродство к Са+. Каждый тропониновый комплекс связывает четыре иона кальция. Тропониновые комплексы расположены вдоль актинового филамеита через каждые 40 нм, прикрепляясь одновременно к актиновому филаменту и молекуле тропомиозина. В состоянии покоя полол :ение тропомиозина конформационно препятствует соединению головок миозина с актиновым филаментом. Связывая Са+, тропонин претерпевает конформационные изменения, в результате чего молекула тропомиозина смещается и освобождает дорогу миозиновым поперечным мостикам для прикрепления к актиновым центрам. Следовательно, присоединение Са2+ к тропонину устраняет постоянно существующее препятствие для взаимодействия поперечных мостиков с актином. Из результатов экспериментов, сделан вывод, что ингибирование присоединения мостиков снимается при концентрации свободного Са2+ свыше 10"7 М.
Быстрое увеличение в цитоплазме концентрации ионов кальция в результате открывания каналов СР приводит к связыванию Са2+ с С-субъединицей тропонина. Последняя по свойствам близка кальмодулину. Связывание ионов Са+ вызывает конформационную перестройку в тропонине, тропонинтропомиозиновый комплекс разрушается и освобождает на молекуле актина участок связывания с миозином. Это инициирует цикл мышечного сокращения (Рис. 1). В отсутствие последующего стимулирования АТФ-зависимые кальциевые насосы мембраны СР (SERCA) быстро снижают концентрацию ионов Са2+ до исходного уровня. Как следствие, комплекс Са2+ с тропонином С диссоциирует, тропонин восстанавливает исходную конформацию, место связывания миозина на актине блокируется и мышца расслабляется. Таким образом, при сокращении мышечного волокна скелетных мышц млекопитающих происходит следующая последовательность событий. При поступлении сигнала от двигательного нейрона мембрана мышечной клетки деполяризуется, сигнал передается на Са-каналы СР. Са2+ 0-1 каналы открываются, внутриклеточный уровень ионов Са возрастает. Ионы Са2+ связывается с тропонином С, вызывая конформационную перестройку в тропонине, что влечет за собой разрушение комплекса тропонин-тропомиозин и дает возможность головкам миозина связываться с актином. Происходит инициация актин-миозинового цикла. По завершении сокращения уровень ионов Са + снижается за счет активного обратного транспорта Са2+ в СР, тропонин С отдает Са +, комплекс тропонин-тропомиозин занимает исходное положение на молекуле актина, блокируя актин-миозиновый цикл. Результатом является расслабление мышцы.
Все животные являются уникальными по паттерну распределения мышечных волокон и композиции мышц. С увеличением размера и веса животного увеличивается пропорция мышечных волокон быстрого типа. Необходимо также учитывать, что у одного биологического вида одна и та же мышца может состоять из медленно сокращающихся волокон, тогда как у другого эта же мышца может содержать значительное количество быстрых волокон. Это может быть связано с поведением животного, под которым мы понимаем всю совокупность проявлений внешней, преимущественно двигательной активности животного, направленной на установление жизненно необходимых связей организма со средой [9,10]. Однако на сегодняшний день практически нет сравнительных данных сократительных свойств одиночных волокон скелетных мышц млекопитающих. Такой анализ важен в связи с расширением числа видов млекопитающих, используемых в полетных экспериментах с тем, чтобы изучить действие экстремальных факторов космического полета, в первую очередь микрогравитации, на организм животных, отличающихся по характеру обмена и реактивности.
Сократительные свойства мышц в значительной мере зависят от соотношения быстрых и медленных мышечных волокон.
Сократительные характеристики отличаются у быстрых и медленных волокон. Например, у быстрых волокон больше максимальная сила сокращения одиночных волокон. Медленные волокна развивают силу меньшую, чем быстрые [11].
Уменьшение мышечной массы и размеров мышечных волокон
Одним из наиболее известных и заметных следствий пребывания в невесомости является уменьшение мышечной массы (атрофия). Потери мышечной массы были обнаружены у человека, обезьяны, крысы после пребывания, как в реальной, так и моделированной невесомости [27-32]. При исследовании биоптатов т. vastus lateralis астронавтов, совершавших кратковременные (5-11 дней) полеты на кораблях СПЕЙС ШАТТЛ существенную атрофию мышечных волокон выявили как после 11-дневного, так и после 5-дневного полета. В среднем площадь поперечного сечения волокон медленного типа (I типа) снизилась на 15%, а II быстрого типа - на 22% [33]. Сходный уровень атрофии волокон быстрого и медленного типов может свидетельствовать о снижении сократительной активности в волокнах обоих типов.
К сожалению, остается неясным вопрос о том, что лежит в основе уменьшения размеров мышц в условиях невесомости - потеря белка или жидкости. Значительная дегидратация организма космонавтов в космическом полете была неоднократно показана ранее. В настоящее время нет данных, позволяющих с большей или меньшей степенью вероятности определить долю потерь внутри и внеклеточной жидкости в скелетных мышцах и сопоставить эти данные с потерями мышечного белка.
При вывешивании и после космического полета у крыс наибольшие изменения претерпевает масса камбаловидной мышцы т. soleus, которая является активной антигравитационной мышцей, медленной по сократительным свойствам и устойчивой к утомлению [21,22,31]. Атрофия при гравитационной разгрузке наиболее характерна для медленных мышц, особенно выполняющих познотоническую функцию, в отличие от преимущественно локомоторных мышц с преобладанием волокон медленного типа. Атрофия т. soleus при вывешивании задних конечностей у крыс происходит за счет уменьшения размеров мышечных волокон, а не их количества [31]. Если через 7 дней вывешивания атрофия волокон I типа в этой мышце не более выражена, чем атрофия волокон II типа и составляет примерно 35-45%, то в дальнейшем она оказывается более выраженной в быстрых волокнах и достигает там 60- 70% к 30-35 суткам, и остается примерно на прежнем уровне в медленных [33]. В дальнейшем атрофия быстрого типа волокон в т. soleus также прекращается [32]. Развитие атрофии мышечных волокон обнаружено также после пребывания крыс в космическом полете [19]. 5-7 суточный полет крыс на борту биоспутника или корабля серии СПЕЙС ШАТТЛ приводит к атрофии как быстрого, так и медленного типа волокон в т. soleus [35].
Неодинаковая степень атрофии разных мышц и волокон разных типов может быть обусловлена неодинаковым снижением уровня их сократительной активности в условиях гравитационной разгрузки. Об этом косвенно свидетельствуют результаты эксперимента канадских авторов, которые с помощью хронической обработки моторного нерва тетродотоксином полностью блокировали передачу потенциала действия к мышце вывешенной ноги у крысы [36]. При этом в сравнении с животными, вывешенными без блокады моторной импульсации существенно увеличенной была степень атрофии только быстрых волокон. Авторы цитируемой работы считают, что при вывешивании активность быстрых волокон (в отличие от медленных) не прекращается полностью, что и приводит к неполной атрофии волокон этого типа.
Атрофия мышечных волокон у млекопитающих сопровождается деструктивными изменениями миофибриллярного аппарата. Множественные повреждения миофибрилл зарегистрированы после вывешивания задних конечностей у кролика [37], после космического полета у крыс и обезьян [38,39,40] Криппендорф и Райли [41,42] наблюдали нарушения ультраструктуры миофибрилл у животных, реадаптирующихся после вывешивания в течение 2-6 часов, в то время как у животных, умерщвленных непосредственно после вывешивания ультраструктура волокон оставалась в пределах нормы.
В исследованиях на биоспутниках (после 18-суточного полета) впервые было показано изменение соотношения быстрых и медленных изоформ миозина (легких цепей) в мышцах грызунов [29,30]. Увеличение доли быстрых изоформ легких цепей миозина в т. soleus и некоторых других мышцах наблюдали уже после 7-суточного полета [40]. Столь же выраженные изменения в составе как легких, так и тяжелых цепей миозина были выявлены в совместных исследованиях российских и американских авторов после 13-14 суточных полетов [41]. Изменение миозинового фенотипа в этих экспериментах проявлялись и на морфологическом уровне: после полета в т. soleus и в некоторых других мышцах наблюдалось уменьшение доли волокон медленного типа и увеличение доли быстрых волокон у крыс [42].
В исследованиях с макаками резус, экспонированными в невесомости в течение 12-14 суток, также было обнаружено значительное снижение процента волокон медленного типа в т. soleus и т. vastus lateralis [40]. Этот феномен был подтверлодеи на том же материале в работе американских коллег с использованием иммуногистохимического окрашивания на антитела против различных изоформ тяжелых цепей миозина [44].
Факторы гравитационной разгрузки, влияющие на снижение сократительных свойств
Пребывание в условиях реальной или моделируемой микрогравитации приводит к значительным изменениям структуры и функции скелетных мышц млекопитающих, среди которых наиболее значимыми является снижение их силовых возможностей [54]. И.Б. Козловской в течение многих лет развиваются представления о том, что устранение опоры в условиях микрогравитации приводит к последовательной цепи функциональных изменений системы управления движениями и периферического мышечного аппарата, которые в конечном итоге и обусловливают снижение сократительных возможностей постуральиых мышц [14]. Основные положения этой гипотезы были подтверждены в сравнительных исследованиях эффектов антиортостатической гипокинезии (АНОГ) и сухой иммерсии. Б различных наземных моделях гравитационной разгрузки выраженность опорного стимула оказывается неодинаковой. Так, при экспозиции в условиях «сухой иммерсии» [55] практически отсутствует градиент опорного механического раздражения («безопорная среда»). В модели гипокинезии (АНОГ) при прочих равных условиях удельная сила реакции опоры, будучи перераспределена со стоп на поверхность тела и соответственно уменьшена, в отличие от условий «сухой иммерсии» все-таки присутствует. Показано, что скорость изменения силы, поперечной жесткости и характера рекрутирования двигательных единиц в произвольном движении, оказывается значительно, большей в условиях иммерсии по сравнению с условиями АНОГ [14,15,56].
Однако ведущая роль опорного стимула в развитии изменений двигательной системы человека может быть корректно показана только в прямых исследованиях с искусственной имитацией механической опоры. Оказалось, что при действии искусственного опорного стимулятора на фоне иммерсии и космического полета жесткость и электромиографические показатели активности мышц не претерпевали значительных изменений [57,58].
Хорошо известно, что в невесомости, как у человека, так и у животных, наблюдается снижение максимальных сократительных возможностей одиночных скинированных мышечных волокон [2,4]. Однако до недавнего времени прямых исследований влияния устранения опоры на сократительные характеристики волокон постуральных мышц и клеточных факторов, их определяющих, не проводилось. Редукция размеров мышечных волокон человека в условиях 3- и 7- суточной сухой иммерсии была обнаружена нами при исследовании биоптатов т. vastus lateralis [59]. Выраженность этой редукции была сопоставима со степенью атрофии волокон этой мышцы после 60 суток АНОГ [60]. Этот факт позволил предположить, что устранение опорной афферентации может быть пусковым механизмом развития атрофических процессов в скелетной мышце человека. В пользу этой гипотезы свидетельствовало и то, что в экспериментах с вывешиванием крыс искусственная опорная стимуляция способствовала уменьшению степени гипогравитационной атрофии или полному предотвращению редукции размеров мышечных волокон медленного типа и трансформации медленных волокон в волокна быстрого типа [61,62]. Однако прямых данных о влиянии опорного стимула на структурно-функциональные характеристики мышечных волокон человека и их белковый состав в литературе до сих пор не представлено. Мало того, до сих пор остается неясным вопрос о природе редукции размеров мышечных волокон в условиях гравитационной разгрузки, особенно при коротких сроках экспозиции. Уменьшение объема мышцы, как при вывешивании, так и в космическом полете может происходить не только за счет уменьшения концентрации белковых (главным образом, сократительных) структур, но и за счет дегидратации [63]. При использовании кратковременной сухой иммерсии в качестве экспериментальной модели безопорной среды, вопрос о вкладе дегидратации в редукцию размеров мышечных волокон, несомненно, требует своего разрешения.
Данные, полученные в экспериментах на лабораторных грызунах, указывают на то, что пребывание в условиях микрогравитации также приводит к изменению миозинового фенотипа в сторону увеличения доли волокон, содержащих быстрые изоформы тяжелых цепей миозина (ТЦМ) [28,64,65]. До сих пор не удалось получить убедительных свидетельств о трансформации миозинового фенотипа мышечных волокон при гравитационной разгрузке у человека [35,66].
В экспериментах с АНОГ и в кратковременных космических полетах обнаружено достоверное снижение чувствительности миофибрилл к Са2+ [2,4,25]. Это снижение может указывать на значимые изменения способности сократительного аппарата к поддержанию субмаксимальных напряжений [67,68]. Уменьшение жесткости изолированных мышечных волокон было обнаружено как при антиортостатическом вывешивании крыс [69], но и в исследованиях с участием добровольцев в условиях АНОГ и после космического полета [4,25]. В работе Т. Toursel с коллегами [69] было обнаружено, что снижение жесткости изолированных волокон т. soleus крысы при гравитационной разгрузке (вывешивании задних конечностей) сопровождается уменьшением относительного содержания титина, эластического белка саркомерного цитоскелета. В нашем недавнем исследовании этот феномен был подтвержден, было также показано значительное снижение относительного содержание небулина -цитоскелетного белка тонких филаментов - при вывешивании крыс [69,70].
На сегодняшний день, имеется достаточно данных, свидетельствующих об увеличении базальной (т.е. в расслабленном состоянии волокна) концентрации ионов кальция в миоплазме в условиях гравитационной разгрузки [24,26,71,72]. Есть основания полагать, что избыток кальция может играть триггерную роль в развитии функциональных нарушений в мышечных волокнах в условиях микрогравитации. Известно, что усиление протеолиза в мышечных волокнах, регистрируемое при гравитационной разгрузке, обусловлено активностью Са-зависимых протеаз миоплазмы [73]. Также показана повышенная чувствительность к деструктивному действию кальция цитоскелетного белка титина, во многом обусловливающего жесткостные свойства волокна [74]. В то же время, недавно обнаружено, что гравитационная разгрузка сопровождается избирательным распадом титина [70]. Роль избыточного внутриклеточного кальция в механизмах развития гипогравитационной атрофии ранее была проанализирована нами в экспериментах с Са-связывающим агентом ЭДТА [75]. Таким образом, некоторые из выше упомянутых факторов, влияющих на сократительные свойства мышечных волокон в при гравитационной разгрузке, вполне могут быть подвержены деструктивному действию ионов кальция, накапливающихся в волокне в этих условиях. Если эта гипотеза верна, то уменьшение концентрации ионов кальция в волокне позволит уменьшить степень снижения сократительных свойств индивидуальных волокон.
Вместе с тем, не исключено, что увеличение базальной концентрации кальция в волокне может привести к снижению кальциевой чувствительности миофибрилл так, чтобы минимальное увеличение концентрации, необходимое для порогового сокращения миофибрилл, оставалось постоянной величиной. Поэтому, искусственное связывание избытка ионов кальция позволило бы уменьшить или предотвратить снижение кальциевой чувствительности миофибриллярного аппарата.
Видовая специфичность сократительных характеристик одиночных волокон млекопитающих
Целью этой части работы был анализ сократительных свойств одиночных волокон скелетных мышц (т. soleus) как традиционных объектов космической биологии и медицины, так и новых биологических объектов.
В качестве традиционных объектов были выбраны: человек, обезьяна и крыса. В качестве нового - песчанка. Основной биологической особенностью песчанки является ее высокая адаптированность к недостатку питьевой воды и, соответственно, к высокому уровню обезвоживания тканей.
Незначительные отличия по данному показателю были обнаружены между обезьяной и крысой. Самое большое значение Р0 одиночных волокон найдено у человека. Что касается удельного напряжения РУд, то здесь наблюдалась иная картина. У песчанок оказался самый высокий показатель удельного напряжения, который значительно выше, чем у крыс и чуть выше значений, полученных для человека и обезьяны.
Анализ кривых зависимости относительного напряжения от концентрации ионов кальция (Рис. 4.1) показывает, что если значения кальциевой чувствительности миофибрилл волокон т. soleus у человека и у крысы не отличаются друг от друга, то волокна обезьяны и песчанки демонстрируют достоверно меньшие пороговые значения рСа (отрицательный логарифм концентрации ионов Са2+). Если сравнить значения pCctso (величина pCa, при которой достигается 50% от максимальной силы мышечных волокон), то можно заметить, что у человека и обезьяны нет достоверных отличий по данному параметру. Чуть ниже этот показатель у крыс, и еще ниже - у песчанок. Также видно, что кривая зависимости относительного напряжения от концентрации иоиов кальция у песчанок сильно сдвинута вправо по сравнению с крысой, обезьяной и человеком. Это указывает на менее выраженную кальциевую чувствительность волокон т. soleus у этого грызуна по сравнению с другими исследованными биологическими объектами.
Зависимости напряжения от концентрации кальция скинированных единичных волокон т. soleus человека, обезьяны, крысы и песчанки. Кривые получены аппроксимацией данных уравнением Хилла (см. раздел «Методы обработки и анализа материала»). Показаны средние значения Р/Р(фт. Зеленая кривая - усредненный график для волокон обезьяны, красная кривая - усредненный график для волокон человека, серая кривая -усредненный график для волоки крысы, голубая кривая - усредненный график для волокон песчанки. 4.2. Эффекты гравитационной разгрузки
Исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц космонавтов до и после длительного космического полета
Прямые данные, касающиеся эффектов микрогравитации можно получить при исследовании мышц космонавтов- до и после длительного космического полета. Исследование мышечной ткани проводили у 3-х членов экипажей МКС (А, Б, С) в длительных космический полетах (МКС- 6, 7 и 8) в рамках бортового эксперимента «МИОН». Космонавты А, Б и С провели на станции 6 месяцев. Пробы мышечной ткани забирали из т. soleus методом игольчатой биопсии по Бергстрему дважды: в предполетном периоде и к концу 0-х суток после посадки. Космонавты в ходе полета выполняли профилактические физические тренировки по бортовой программе. В основу тренировок было положено выполнение беговых (на бегущей дорожке) и велоэргометрических нагрузок в повторном режиме. Дважды в течение полета была проведена запись объема и интенсивности выполняемых нагрузок в течение стандартного микроцикла. Полученные значения объема и интенсивности нагрузок сопоставляли с теми значениями, которые были предварительно рекомендованы космонавтам. Все космонавты дали добровольное согласие на участие в исследовании в соответствии с нормами Хельсинкской Декларации. Процедура была одобрена Комиссией ГНЦ РФ ИМБП по биомедицинской этике. Анализ сократительных свойств одиночных волокон т. soleus двух космонавтов (А и С)
После длительного космического полета у космонавтов А и С наблюдалось снижение максимальных сократительных возможностей одиночных.волокон т. soleus. Диаметр изолированных мышечных волокон уменьшился на 47% у обоих космонавтов по сравнению с контрольными значениями (Табл. 4.2). Также воздействие гравитационной разгрузки привело к достоверному снижению максимальной изометрической силы в среднем на 35-40%. Снижение удельной максимальной силы мышечных волокон т. soleus показали как А, так и С (в среднем на 25%). Из рисунка 4.2 видно, что кривые зависимости напряжения от концентрации кальция скинированных единичных волокон т. soleus космонавтов, после пребывания в условиях гравитационной разгрузки сдвинулись вправо у обоих космонавтов. При этом сдвиг кривой вправо свидетельствует о снижении чувствительности миофибрилл к ионам кальция.
Зависимости напряжения от концентрации кальция скинированных единичных волокон т. salens космонавтов А и С. Кривые получены аппроксимацией данных уравнением Хилла (см. раздел «Методы обработки и анализа материала»). Показаны средние значения Р/Р„±т. Синяя кривая -до полета, красная кривая - после полета. Илшуногистохішический анализ Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA) у двух космонавтов Ви С
После космического полета у обоих космонавтов процент волокон, содержащих SERCA 1 быструю изоформу Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, был значительно выше, по сравнению с исходными данными: у В - 45±2,3%, против 21±1,2%; у С - 57±3,2%, против 24±1,4% (Рис. 4.3). Что же касается изоформы медленной SERCA II типа, то после воздействия гравитационной разгрузки процент содержания ее в волокнах т. soleus был достоверно снижен по сравнению с данными, которые получили до полета космонавтов. Процент снижения у В составил 22%, у С -30%.
