Введение к работе
Актуальность проблемы. Начиная с исследований, проведенных в 1980-е года, было показано, что оксид азота II (N0) является важным регулятором в широкой области физиологических ответов [Furchgott et al, 1980]. NO образуется в результате окисления аминокислоты L-аргинина с одновременным образованием цитруллина при действии фермента NO-синтазы. Скелетная мышца постоянно экспрессирует нейрональную NO-синтазу (nNOS) и производит NO [Nakane et al, 1993; Kobzik et al, 1994]. Известно, что при уменьшении двигательной активности, а также при эксцентрической нагрузке (растяжение мышцы на фоне её сокращения) цитоскелетные и сократительные белки скелетных мышц подвергаются деструкции [Lieber et al, 1994; Komulainen et al, 1999]. Клеточные факторы и механизмы действия, приводящие к разрушению белков, остаются неизвестными. Кроме того, роль N0 в регуляции белкового метаболизма скелетных мышц остаётся неизученной. Ранее было показано, что при вывешивании крыс в m. soleus наряду с атрофией и разрушением цитоскелетных и сократительных белков происходит увеличение концентрации кальция [Ingalls et al, 1999; Mukhina et al, 2006] и соответственно активация ц-кальпаинов [Garcia et al, 2006]. Анализ путей, приводящих к разрушению белков в мышце, показал, что активация кальпаинов приводит к активации убиквитин-протеасомного протеолиза, ингибирование которого в свою очередь сводит к минимуму результат действия кальпаинов [Kramerova et al, 2005; Smith et al., 2007]. Было показано, что в скелетных мышцах при функциональной разгрузке особенно активно участвуют в процессах протеасомной деградации и отмечен существенный рост таких ЕЗ-лигаз, как атрогин-1/MAFbx и MuRF-1 [Jackman et al, 2004; Dupont-Versteegden et al, 2006]. Известно, что первые нарушения, происходящие в скелетных мышцах при функциональной разгрузке, связаны со снижением синтеза миофибриллярных и цитоскелетных белков, в котором задействован хорошо известный путь регуляции синтеза на уровне активации р7086-киназ, т.е. инициации трансляции [Bodine et al, 2001]. Кроме того, за снижением синтеза следует ускорение протеолиза [Jackman et al., 2004]. Имеются сообщения и о том, что при длительном уменьшении двигательной активности происходит также снижение продукции NO и nNOS [Tidball et al, 1999; Salanova et al, 2008]. При этом было показано, что NO способен активировать синтез цитоскелетных белков, а также ингибировать активность д-кальпаинов мышц, что может предотвращать их атрофию [Tidball et al, 1999; Koh et al, 2000]. Все эти данные говорят о том, что в скелетной мышце существует связь между продукцией NO, активностью nNOS и синтезом цитоскелетных и сократительных белков. Было предположено, что введение L-аргинина (предшественника NO) при функциональной разгрузке увеличивает активность nNOS и соответственно продукцию NO, что может привести к блокированию работы упомянутых протеолитических ферментов (кальпаинов и ЕЗ-лигаз), и тем самым предотвратить разрушение белков и атрофию мышечных волокон (схема 1а). Взаимодействие nNOS с рядом белков играет важную роль в регуляции продукции NO [Копе et al, 2000; Gratton et al, 2000]. Среди них особенную значимость как для работы nNOS, так и для её стабильности имеет и HSP90 [Bender et al, 1999; Piech et al, 2003]. Его экспрессия была также исследована в данном эксперименте (схема 1а).
При растяжении мышц на фоне функциональной разгрузки происходит предотвращение атрофии мышечных волокон [Goldspink et al, 1977; Jaspers et al, 1988]. Также было показано, что при сокращении единичного волокна, статическом растяжении скелетно-мышечных клеток увеличивается количество NO и активность nNOS [Pye et al, 2007; Tidball et al, 2000; Zhang et al, 2004], а также синтез цитоскелетных белков [Barton et al, 2005]. Эти эффекты усиливаются при введении предшественника NO L-аргинина или ингибировании кальпаина и блокируются введением ингибитора NO-синтазы L-NAME [Voisin et al, 2005]. Проведенные ранее исследования были выполнены с использованием культур ткани, однако их результаты позволяют провести аналогию с эффектами, которые
наблюдаются в мышце in vivo при её растяжении. Было выдвинуто предположение о том, что nNOS участвует в предотвращении атрофии разгруженной мышцы при её растяжении методом блокирования работы nNOS L-NAME. Если гипотеза верна, то будет обнаружена атрофия в растянутой m. soleus при блокировании активности nNOS (схема 16).
Схема 1. Методы проверки гипотез об участии nNOS в белковом метаболизме скелетной мышцы при а) функциональной разгрузке, б) растяжении на фоне разгрузки, в) эксцентрической нагрузке.
Было обнаружено, что эксцентрическая нагрузка (сокращение на фоне растяжения) вызывает ухудшение работоспособности мышцы уже через 24 часа [Hesselink et al, 1996] и появлению у человека отставленной мышечной боли [Allen et al, 2001]. В частности, эксцентрическое сокращение повреждает в значительной степени цитоскелетные белки мышечного волокна, такие как десмин, дистрофии, спектрин, актинин [Friden et al, 2001]. Michetti et al. в 1995 году также опубликовали сообщение об ингибировании протеолитической активности ц-кальпаина из скелетной мышцы NO in vitro. Была выдвинута гипотеза о том, что активность кальпаинов при эксцентрической нагрузке можно блокировать введением предшественника NO L-аргинина и тем самым предотвратить протеолиз белков (схема 1в). Более того, была поставлена задача выявить путь поступления кальция в клетку при той же нагрузке, его роль в механизмах деструктивных изменений цитоскелетных белков. Для этого животным был введен блокатор кальциевых каналов L-типа нифедипин.
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования являлся анализ фундаментальной проблемы клеточной физиологии, связанной с исследованием механизмов защитного и сигнального действия NO на скелетно-мышечные волокна при функциональной разгрузке, их растяжении на фоне разгрузки, а также при эксцентрическом сокращении.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить влияние введения предшественника NO L-аргинина на степень атрофии m. soleus, содержание цитоскелетного белка десмина во время вывешивания крыс; выявить действие NO на сигнальный путь убиквитин-протеасомной деградации, ЕЗ-лигазы, и синтеза белка, р7086-киназы, при функциональной разгрузке мышц.
Охарактеризовать вклад нейрональной NO-синтазы в предотвращение атрофии, разрушения цитоскелетного белка десмина и миофибриллярного а-актина, проанализировать работу сигнальных путей, участвующих в белковом обмене (Akt-mTOR-p70S6k, ЕЗ-лигазы) в m. soleus, во время растяжения m. soleus на фоне ее функциональной разгрузки.
3. Исследовать эффект введения предшественника NO L-аргинина на трансформацию
тяжёлых цепей миозина (ТЦМ) I типа в сторону ТЦМ II типа при снижении функциональной
активности m. soleus и оценить влияние нейрональной NO-синтазы на экспрессию ТЦМ I типа при растяжении m. soleus на фоне разгрузки.
4. Оценить защитную функцию L-аргинина и N0 на содержание цитоскелетных белков
m. soleus при однократной эксцентрической нагрузке, а также исследовать влияние
применения L-аргинина на работоспособность крыс, подвергшихся однократной
эксцентрической нагрузке.
5. Изучить роль кальциевых каналов L-типа в протеолизе цитоскелетных белков m. soleus, а
также в изменении работоспособности крыс после однократной эксцентрической нагрузки.
Научная новизна работы:
Впервые показано, что введение L-аргинина при функциональной разгрузке и перед однократной эксцентрической нагрузкой приводит к увеличению в m. soleus концентрации N0. Более того, обнаружено защитное действие L-аргинина на белковый метаболизм скелетных мышц при функциональной разгрузке, а также однократной эксцентрической нагрузке. Введение L-аргинина при функциональной разгрузке поддерживает экспрессию мРНК MAFbx, MuRF-1 и содержание р7086-киназ на контрольном уровне.
Впервые оценен вклад NO-зависимой сигнальной системы в поддержание белкового метаболизма скелетных мышц in vivo при их растяжении на фоне функциональной разгрузки. Обнаружено, что блокирование нейрональной NO-синтазы (nNOS) при растяжении m. soleus на фоне разгрузки не приводит к развитию атрофии и увеличению экспрессии мРНК MAFbx и MuRF-1.
Впервые обнаружено, что nNOS принимает участие в регуляции тяжелых цепей миозина (ТЦМ) I типа. Введение предшественника N0 L-аргинина при функциональной разгрузке m. soleus поддерживает содержание мРНК ТЦМ I типа на контрольном уровне, а блокирование nNOS при растяжении m. soleus на фоне разгрузки приводит к снижению содержания мРНК ТЦМ I типа.
Впервые показано, что одним из путей поступления кальция в мышечное волокно при однократной эксцентрической нагрузке являются кальциевые каналы L-типа, их блокирование существенно снижает степень разрушения цитоскелетных белков в скелетной мышце при однократной эксцентрической нагрузке и увеличивает работоспособность после неё.
Научно-практическая значимость
Значение работы состоит в получении новых фундаментальных знаний о физиологических и клеточных механизмах, запускающих процесс адаптации скелетных мышц к разным режимам сократительной активности. Идентификация N0 как сигнального фактора, участвующего в регуляции белкового синтеза, является фундаментальным направлением, которое может найти приложение в нейрологии, экстремальной и реабилитационной медицине, в разработке новых программ тренировки спортсменов и геронтологии. Предшественник N0 L-аргинин может быть применен в качестве средства профилактики разрушения цитоскелетных белков скелетных мышц при эксцентрической нагрузке, а также при атрофии мышц, вызванной гипокинезией и/или гравитационной разгрузкой, с целью устранения их негативных последствий. Более того, введение L-аргинина может препятствовать возникновению отставленной мышечной боли, вызванной протеолизом, у спортсменов после интенсивных эксцентрических нагрузок, тем самым, повышая их работоспособность. Увеличение концентрации N0 может быть использовано для снижения экспрессии ЕЗ-убиквитин-лигаз, участвующих в протеасомной деградации белков и для предотвращения снижения экспрессии тяжелых цепей миозина I типа. Результаты работы позволяют сделать вывод о том, что NO-зависимая система способна обеспечить высокую степень профилактики, а применение L-аргинина практически исключает негативные побочные эффекты.
Положения, выносимые на защиту:
Введение предшественника N0 L-аргинина позволяет предупредить разрушение цитоскелетных белков в скелетной мышце, как при интенсивной эксцентрической нагрузке, так и функциональной разгрузке; увеличивает работоспособность после однократной эксцентрической нагрузки. Более того, нейноральная NO-синтаза участвует в регуляции экспрессии мРНК тяжёлых цепей миозина (ТЦМ) I типа.
Растяжение скелетной мышцы приводит к предотвращению атрофии во время функциональной разгрузки, но роль нейрональной NO-снитазы в поддержании массы мышцы незначительна.
3. Предотвращение поступления кальция через кальциевые каналы L-типа в мышечное
волокно препятствует повреждению цитоскелетных белков при однократной
эксцентрической нагрузке и снижению работоспособности после неё.
Апробация работы
Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на: Российско-британской конференции молодых ученых (Екатеринбург, Россия, 2007); 59-й научно-технической конференции студентов МИТХТ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2007), 36-й, 37-й, 38-й, 39-й европейских мышечных конференциях (Стокгольм, Швеция, 2007; Оксфорд, Великобритания, 2008; Лилль, Франция, 2009; Падуя, Италия, 2010); 7-й, 8-й, 9-й конференциях молодых учёных, специалистов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2008, 2009, 2010); 7-м и 8-м международных симпозиумах "Биологическая подвижность: достижения и перспективы" (Пущино, Россия, 2008, 2010); конференции «Ломоносов-2009» (Москва, 2009); 14-й международной конференции по биохимии упражнений (Онтарио, Канада, 2009); 17-м международном симпозиуме «Человек в космосе» (Москва, 2009); 30-м и 31-м симпозиумах по гравитационной физиологии (Сиань, Китай, 2009; Триест, Италия, 2010); 29-м съезде физиологического общества имени И.П.Павлова. (Калуга, 2010); 6-й всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности «Системные и клеточные механизмы в физиологии двигательной системы и мышечной деятельности» (Москва, 2011).
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ-ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол № 7 от 12 декабря 2011 г.).
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 08-04-01599-а.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 3 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК, 2 патента, 20 тезисов докладов конференций, в том числе международных.
Структура и объем диссертации
