Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Современные концепции пищеварения и транспорта пищевых веществ в кишечнике рыб 8
1.1.1. Полостное (внеклеточное или дистантное) пищеварение... 9
1.1.2. Внутриклеточное пищеварение 12
1.1.3. Мембранное пищеварение 13
1.1.4. Краткая характеристика процессов всасывания в кишечнике рыб 14
1.2. Влияние модификаторов на процесс пищеварения рыб 17
1.2.1. Взаимодействие пищевых веществ в условиях in vitro 18
1.2.2. Взаимодействие пищевых веществ в условиях in vivo 26
1.3. Действие металлов на биологические системы рыб 30
Глава 2. Материал и методы исследования 36
2.1. Характеристика исследуемых рыб 36
2.2. Техника приготовления ферментативно активных препаратов и условия проведения экспериментов 41
2.3. Определение уровня активности ферментов 43
2.3.1. Определение уровня активности суммарной протеиназы ... 43
2.3.2. Определение уровня активности мальтазы 45
2.3.3. Определение уровня активности щелочной фосфатазы 46
2.4. Статистическая обработка данных 48
Глава 3. Влияние ионов металлов на уровень активности пищеварительных гидролаз 49
3.1. Влияние ионов металлов на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб 49
3.2. Влияние ионов металлов на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника рыб 55
3.3. Влияние ионов металлов на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб 59
Глава 4. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности пищеварительных ферментов рыб 67
4.1. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб 67
4.2. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника рыб 80
4.3. Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб 94
Глава 5. Взаимодействие пищевых веществ в процессе пищеварения в слизистой оболочки кишечника рыб 107
5.1. Влияние мальтозы и казеина на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб 108
5.2. Влияние n-нитрофенилфосфат Na и казеина на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника рыб 110
5.3. Влияние n-нитрофенилфосфат Na и мальтозы на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб 112
Глава 6. Обсуждение результатов 115
Выводы 131
Список литературы 133
- Краткая характеристика процессов всасывания в кишечнике рыб
- Определение уровня активности суммарной протеиназы
- Влияние ионов металлов на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб
- Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб
Введение к работе
Актуальность проблемы. Адаптация пищеварительной системы занимает среди других адаптации особое место в связи с тем, что между уровнем субстратной нагрузки и функционированием желудочно-кишечного тракта, в том числе и уровнем активности пищеварительных ферментов существует тесная связь (Уголев, 1985; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 2003). В связи с этим механизм перестройки структуры и функции в ответ на изменение нагрузки имеет важное значение для функционирования пищеварительной сис-«
| темы и организма рыб в целом (обзоры: Хочачка, Сомеро, 198; Уголев, Кузь-
»
.' мина, 1993; Неваленный и др., 2003 и мн.др.). Наиболее доступной моделью
для решения фундаментальных проблем адаптации является пищеварительная система, это связано с тем, что «кишечник является центральным органом, который реализует не только основные процессы переваривания и всасывания пищи, но и регулирование, связывающее собственно желудочно-кишечный тракт с метаболизмом организма благодаря мощной кишечной гормональной (энтериновой) системе» (цит. по: Адаптационно-компенсаторные процессы..., 1991).
І В течении последних лет для рыб описаны все известные типы пищева-
* рения, изучены процессы транспорта нутриентов в кишечнике, индуцирован-
ного аутолиза (обзор: Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, 1996; Pavios et al., 2000; Spanggaard et al., 2000; Кузьмина, Скворцова, 2003; Кузьмина и др., 2003; Извекова, Лаптева, 2004). В результате чего пищеварение у рыб в настоящее время описывается как шестизвенный процесс. Тем не менее, механизмы взаимодействия пищевых веществ (модификационные эффекты) в процессе пищеварения в кишечнике рыб остаются до конца не выясненными (Кузьмина, Голованова, 1998; Туктаров, 2002; Неваленный и др., 2001 в, 2003). В то время
как результаты, полученные при разработке данных вопросов, необходимы для
)
\
решения ряда теоретических и прикладных проблем питания и пищеварения у рыб.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение in vitro влияния модификаторов различной природы на уровень активности некоторых гидролитических ферментов пищеварительной системы белуги, русского осетра, севрюги, щуки, белого амура, леща, сазана, карася белого толстолобика, окуня ерша и берша.
В связи с этим в процессе работы предстояло решить следующие задачи:
Исследовать влияние ионов шести металлов четвертого периода периодической системы химических элементов Д. И. Менделеева (Mn, Fe (II), Со, Ni, Си и Zn) в концентрации 10 мг/л на уровень активности суммарной протеиназы, мальтазы и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб различных экологических и систематических групп.
Изучить влияние углеводов (глюкозы, фруктозы) и аминокислот (глицина, L-глутамина, L-лейцина и DL-p-фенила-ос-аланина) на уровень активности мальтазы, щелочной фосфатазы и суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника рыб.
Сопоставить интенсивность гидролиза гомогенатами слизистой оболочки кишечника 12 видов рыб, относящихся к различным экологическим и систематическим группам, 2% раствора мальтозы, 1% раствора казеина, 0,6 шМ раствора n-нитрофенилфосфата Na по отдельности и в присутствии одного или двух веществ, являющихся субстратами при определении активности мальтазы, суммарной протеиназы и щелочной фосфатазы соответственно.
Выявить видовые различия характера ответной реакции гидролитических систем кишечника рыб на действие исследованных модификаторов. Научная новизна работы. Впервые получены данные по исследованию
влияния модификаторов различной природы на уровень активности комплекса
пищеварительных ферментов (суммарной протеиназы, мальтазы и щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника) и охарактеризованы процессы полисубстратного пищеварения в кишечнике 12 видов рыб относящихся к различным экологическим и систематическим группам. Произведено сопоставление влияния модификаторов различной природы на уровень активности ферментов в кишечнике осетровых, карповых и окуневых рыб.
Установлено существование регуляторной функции микроэлементов, углеводов, аминокислот, казеина и эфира фосфорной кислоты на уровень активности ферментов в слизистой оболочке кишечника исследованной группы рыб. Продемонстрированы видовые отличия в уровне ответной реакции гидролитических систем, осуществляющих расщепление пищи в кишечнике представителей разных видов, связанные, вероятно, с особенностями систематического положения, биологии и экологии этих рыб.
Установлено, что у рыб, как и у высших позвоночных животных, ферменты, обеспечивающие процессы хМембранного пищеварения являются регулируемыми и способны изменять активность под действием различных компонентов пищевой смеси.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты дополняют представления о характере перестроек гидролитических систем при наличии модификаторов различной природы, что свидетельствует о достаточно тонкой адаптации гидролитических систем к составу пищи.
Полученные в работе результаты позволяют сделать вывод о существовании значительного влияния, оказываемого модификаторами органической и неорганической природы, на процесс усвоения пищи, что необходимо использовать при разработке рецептур кормосмесей для объектов аквакультуры.
Материалы диссертационной работы включены в лекционные курсы по энзимологии в Астраханском государственном техническом университете.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на III Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2000), Международной научно-практической конференции посвященной 70-летию КГТУ (Калининград, 2000), Международной конференции «Aquacul-ture Europe» (Тронхейм, Норвегия, 2001), Международной конференции «Aquaculture Europe» (Триест, Италия, 2002), V Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2002), XI Международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2003), VI Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2003), VII Всероссийской научной конференции "Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия" (Астрахань, 2004) и научно-методических конференциях профессорско-преподавательского состава АГТУ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.
Объем и структура работы. Диссертация представлена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 рисунками и 3 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3х глав с изложением собственных результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, указателя цитируемой литературы. Список литературы включает 226 источника, в том числе 135 работ отечественных и 91 работ иностранных авторов.
Я сердечно благодарю своего учителя доктора биологических наук, профессора Неваленного Александра Николаевича, а также кандидата биологиче-ских наук Туктарова Андрея Валерьевича и Левченко Ольгу Евгеньевну за постоянное внимание и помощь во время выполнения работы.
Краткая характеристика процессов всасывания в кишечнике рыб
Первые исследования, которые были посвященны изучению транспортных процессов в кишечнике рыб относятся к началу прошлого века (van Slyke, White, 1911, Green, 1913, цит. no: Barrington, 1957), однако только в последние десятилетия появился ряд работ, позволяющих приблизиться к пониманию механизмов всасывания.
Так было показано, что у рыб транспортные процессы протекают медленнее, чем у высших позвоночных животных (Barrington, 1957; Karasov, Diamond, 1981 и др.). По предположению Феррариса и Ахеарна (Ferraris, Ahearn, 1984) более высокая скорость транспортных процессов у высших позвоночных животных по сравнению с рыбами может быть связана с потреблением и усвоением большего количества пищи гомойотермными организмами для поддержания высокого уровня метаболизма.
По данным ряда работ, у рыб, как и у других позвоночных животных, процессы всасывания осуществляются на мембране щеточной каймы энтеро-цитов посредством механизмов активного транспорта, что доказано, во-первых, при измерении чистого потока мономеров против концентрационного градиента (Голованова, 1991; Голованова, Кузьмина, 1998 и др.), во-вторых, экспериментами, проведенными с ингибиторами активного транспорта (Ingham, Arme, 1977; Голованова, 1991; Голованова, Кузьмина, 1998; Туктаров, 2002; Неваленный и др., 2003 и др.). При исследовании влияний различных концентраций ионов натрия на интенсивность транспортных процессов также подтверждено существование активного транспорта мономеров в кишечнике рыб (Boge et al., 1982). В то же время ряд авторов для некоторых видов рыб отмечали отсутствие активного транспорта углеводов (Неваленный, 987; Неваленный, Туктаров, 20006; Туктаров, 2002; Неваленный и др., 2002; Неваленный и др., 2003).
Некоторые исследователи считают, что в кишечнике рыб транспорт углеводов и аминокислот осуществляется разными системами (Maffie et al., 1996 и др.). При этом для аминокислот предполагается существование как минимум двух транспортных систем (Ingham, Arme, 1977).
В большинстве работ не отмечена зависимость механизмов транспорта от таксономических и экологических особенностей исследуемых видов. В частности, наличие активного транспорта углеводов и аминокислот продемонстрировано у ряда пресноводных и морских видов рыб (Boge et al., 1982; Голованова, 1991 и др.). В тоже время имеется ряд данных, свидетельствующих о существовании закономерности наличия процесса переноса мономеров во внутреннюю среду организма против градиента концентрации в кишечнике преимущественно морских видов рыб (Ingham, Arme, 1977; Ferraris, 1982; Ferraris, Ahearn, 1984; Lionetto et al., 1996). Лионетто с соавторами (Lionetto et al., 1996) была продемонстрирована онтогенетическая перестройка органов пищеварительной системы и, в частности, систем-транспортеров. Авторами установлено, что в кишечнике морского серебристого европейского угря доля активного транспорта нутриентов значительно выше, чем в кишечнике пресноводного желтого угря.
Некоторые ученые отмечали отсутствие активного транспорта углеводов в кишечнике у рыб (Неваленный, 1987; Туктаров, 2002; Неваленный, Тукта-ров, 20006; Неваленный и др., 2002; Неваленный и др., 2003).
Вместе с тем, Г.М. Рощина (1981), исследуя всасывание глюкозы в кишечнике 8 видов пресноводных костистых рыб не обнаружила явлений проти-воградиентной аккумуляции. Однако, поскольку флоридзин - ингибитор активного транспорта углеводов вызывал существенное торможение процесса всасывания, автором сделано предположение о том, что в кишечнике рыб транспорт глюкозы осуществляется путем облегченной диффузии. Аналогичные данные, касающиеся отсутствия противоградиентной аккумуляции глюкозы, получены при исследовании всасывания глюкозы и продуктов гидролиза, сахарозы и мальтозы в кишечнике леща, белуги и русского осетра (Неваленный, 1987; Niewolonnyj, 1990; Туктаров, 2002). В то же время, снижение аккумуляции углеводов в присутствии строфантина К свидетельствует о наличии как активного, так и пассивного компонента транспорта углеводов в кишечнике леща. В отличие от высших позвоночных животных у рыб значительна доля пассивного компонента транспорта. И.Л. Голованова (1991) показала, что аккумуляция глюкозы и галактозы у леща и карпа происходит против градиента концентрации при низкой (2.5 тМ) концентрации субстрата и, как правило, отсутствует при более высокой (10 тМ) концентрации, что позволило ей выдвинуть гипотезу о существовании у рыб лишь одной системы активного транспорта моносахаридов, эффективно функционирующей при низких концентрациях этих веществ.
Ранее Феррарис (Ferraris, 1982), исследуя транспорт D-глюкозы в кишечнике морских видов, показал, что транспорт может осуществляться двумя независимыми механизмами: с помощью переносчиков и с помощью пассивной диффузии. При относительно низкой люминальной концентрации растворенных веществ, большинство углеводов активно транспортируется через апикальную клеточную мембрану. А при высоких концентрациях углеводы транспортируются с помощью пассивного хмеханизма (Ferraris, Ahearn, 1983). По мнению Феррариса и Ахеарна (Ferraris, Ahearn, 1984) передача растворенного органического вещества путем комбинации, по крайней мере, двух механизмов - активного и пассивного является скорее закономерностью, чем исключением у низших позвоночных животных. При этом величина диффузного потока у пресноводных рыб меньше, чем у морских видов (Ingham, Arme, 1977; Ferraris, 1982; Ferraris, Ahearn, 1984). В то же время у ряда пресноводных видов рыб не наблюдалось превышения гидролиз-зависимого транспорта олиго-меров над мономерным транспортом, что по всей вероятности, может быть следствием более слабого развития пищеварительно-транспортных комплексов у рыб по сравнению с высшими позвоночными животными (Неваленный, 1987; Уголев и др., 1985, 1989, 1990; Голованова, 1991; Туктаров, 2002).
Определение уровня активности суммарной протеиназы
Многие ферменты, особенно пептидазы, проявляют полную активность только в комплексе с ионами определенных металлов. Такие комплексы не слишком прочны, так как диализом можно отделить металл от фермента. Если снова ввести в раствор фермента ионы металла, комплекс образуется опять. Процесс полностью обратим, даже когда образование комплекса металлического иона с ферментом очень медленное и требует нескольких часов. Предполагается, что ион металла, осуществляющий связь между частью молекулы субстрата и фермента, оказывает решающее влияние на активацию, но не на связывание субстрата (Каллоус, Павличек, 1985).
Известно, что марганец является составной частью ферментативных систем с неспецифическими обменивающимися металлокомпонентами. В частности, к этой группе ферментов относятся дипептидазы, фосфатазы, а так же ряд оксидаз.
Установлено, что «фосфатазы, в особенности щелочные, активируются марганцем. Однако значение марганца для этих ферментов не вполне выяснено; в состав фосфатаз различных органов марганец не входит. При этом ион марганца способен заменять магний, являющийся, по-видимому, специфическим компонентом ряда фосфатаз (щелочной фосфатазы кишечника и почек, щелочной пирофосфатазы дрожжей); в то же время марганец активирует реакцию трансфосфорилирования между дифосфоглицериновой кислотой и адено-зиндифосфорной кислотой» (Войнар, 1960).
Войнаром А.В. (1960) было отмечено, что кобальт активирует костную и кишечную фосфатазы. Степень активации фосфатаз кобальтом зависит от конконцентрации аминокислот и магния в инкубационном растворе. Щелочные фосфатазы принадлежат к группе диссоциирующих энзимов с обменивающимся металлокомпонентом и активируются магнием. Специфического ме-талла в своем составе они не содержат. Аминокислоты, реагируя с металлокомпонентом фосфатаз, могут каким-то еще не вполне определенным образом понижать способность ионов двухвалентных металлов активировать данные энзимы (Войнар, 1960; Калоус, Павличек, 1985).
В связи с этим, одной из задач, которую предстояло решить в результате выполнения наших исследований, было изучение влияния ионов марганца, железа (II), кобальта, никеля, меди и цинка в концентрации 10 мг/л на уровень активности щелочной фосфататазы карпа, карася, белого амура, белого толстолобика и севрюги.
Результаты исследования воздействия ионов металлов в концентрации 10 мг/л на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника карпа и карася представлены на рисунке 1. Установлено, что исследованные нами ионы металлов в большинстве случаев вызывают статистически достоверные изменения в уровне активности щелочной фосфатазы. Так .у карпа (рис. 1А) при действии ионов марганца, железа (II), кобальта, никеля, меди и цинка уровень активности щелочной фосфатазы составил 0,59+0,02, 0,49+0,01, 0,40+0,01, 0,40±0,01, 0,15±0,01 и 0,25±0,01 мкмоль/(гхмин) соответственно, против 0,28±0,01 мкмоль/(гхмин) в контроле.
У карася (рис. 1Б) при действии ионов марганца уровень активности щелочной фосфатазы составил 1,29±0,07 мкмоль/(гхмин), против 0,71+0,03 мкмоль/(гхмин) в контроле, при действии ионов железа (II) - 0,98±0,06 мкмоль/(гхмин), ионов кобальта - 0,83±0,02 мкмоль/(гхмин), ионов никеля -0,75+0,03 мкмоль/(гхмин), ионов меди - 0,57±0,02 мкмоль/(гхмин) и ионов цинка 0,60±0,03 мкмоль/(гхмин).
На рисунке 2 представлены данные по исследованию влияния ионов металлов в концентрации 10 мг/л на уровень активности щелочной фосфатаазы слизистой оболочки кишечника белого амура и белого толстолобика. Как видно из рисунка, присутствие ионов металлов в концентрации 10 мг/л во всех случаях вызывает статистически достоверное (р 0,05) изменений в уровне активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника исследованных видов рыб.
Так уровень активности данного фермента в контроле составил 0,18±0,01 мкмоль/(гхмин) у белого амура и 0,27+0,01 мкмоль/(гхмин) у белого толстолобика. При действии, ионов марганца уровень активности щелочной фосфатазы составил 0,39±0,02 и 0,48±0,02 мкмоль/(гхмин) у белого амура и белого толстолобика соответственно. Ионы железа (II) увеличили уровень активности данного фермента у белого амура до 0,33±0,02 мкмоль/(гхмин), а у белого толстолобика до 0,44±0,02. В присутствии ионов кобальта уровень активности щелочной фосфатазы у белого амура и белого толстолобика составил 0,23±0,01 и 0,36±0,02 мкмоль/(гхмин) соответственно. При наличии ионов никеля уровень активности исследуемого фермента у белого амура составил 0,23+0,01 мкмоль/(гхмин), а у белого толстолобика 0,30+0,01 мкмоль/(гхмин). Ионы меди в значительной степени ингибировали уровень активности щелочной фосфатазы и он составил 0,10±0,01 мкмоль/(гхмин) у белого амура и белого толстолобика. При действии ионов цинка уровень активности щелочной фосфатазы составил 0,12±0,01 мкмоль/(гхмин) у белого амура и 0,19+0,01 мкмоль/(гхмин) у белого толстолобика.
Влияние ионов металлов на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб
Таким образом из представленных данных видно, что модификаторы углеводной природы не вызывают статистически достоверных изменений в уровне активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника белуги, русского осетра, севрюги, белого амура и карася. В то время как у леща, окуня и берша данные модификаторы приводят к достоверному ингибирова-нию уровня активности исследованного фермента. Присутствие аминокислот в инкубационной среде вызвало разнонаправленную ответную реакцию в уровне активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника, разных видов рыб. Так, например глицин не привел к достоверным изменениям в уровне активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника белуги, русского осетра, севрюги белого амура и карася, у окуня и берша вызвал статистически достоверное ингибирование уровня активности фермента, а у леща к активации. L-лейцин и ОЬ-$-фенил-а-аланин вызвали увеличение уровня активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника белуги, русского осетра и севрюги, у окуня напротив к ингибированию данного фермента, а у берша в присутствии данных модификаторов не произошло достоверных изменений в уровне активности данного фермента.
В настоящее время имеется ряд данных, свидетельствующих о влиянии различных модификаторов на переваривание углеводов (Кушак, 1983; Угол ев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 2003). Так в частности в опытах на крысах установлено, что гидролиз мальтозы в присутствии трибутирина усиливается на 10-12%. Переваривание сахарозы не нарушается в присутствии глицил-L-лейцина и Р-глицерофосфата Na (Тимофеева и др., 1983).
Показано также, что действие частично очищенной лактазы слизистой . оболочки тонкой кишки человека тормозится глюкозой, галактозой и фруктозой. В свою очередь, активность сахаразы ингибируется глюкозой и фруктозой, а активность мальтазы - глюкозой (Кушак, 1983). При перфузии тонкой кишки крыс установленно, что глюкоза и фруктоза вызывает значительное торможение гидролиза лактозы. Аналогичным эффектом обладают и дисаха-риды (сахароза и мальтоза) в концентрации, в 10 раз меньшей, чем концентрация моносахаридов (Кушак, 1983).
При исследовании влияния различных модификаторов на общую амило-литическую активность, активность сахаразы и а-амилазы рыб установлен разнонаправленный характер влияния модификаторов у разных видов рыб (Кузьмина, 1987; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 2003).
На рисунке 18 представлены данные по влиянию моносахаров на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника белуги и русского осетра. Из рисунка видно, что 10 тМ раствор глюкозы вызывает, статистически достоверно (р 0,05) ингибирование (в среднем 60%) уровня активности исследуемого фермента. Так у белуги этот показатель составил 2,57+0,08 мкмоль/(гхмин) против 5,67±0,29 мкмоль/(гхмин) в контроле, у русского осетра 2,03±0,11 мкмоль/(гхмин) в эксперименте и 5,36±0,17 мкмоль/(гхмин) в контроле. Эквимолярная смесь глюкозы и фруктозы также привела к достоверному (р 0,05) ингибированию (в среднем на 40%) уровня активности фермента, он составил 3,73+0,24 и 3,24±0,14 мкмоль/(гхмин) у белуги и русского осетра соответственно. НаличиеЮ тМ раствора фруктозы в инкубационной среде не привело к достоверному изменению скорости гидролиза мальтозы, при этом уровень активности мальтазы у белуги составил 5,64+0,14 мкмоль/(гхмин) и у русского осетра 5,40±0,19 мкмоль/(гхмин).
При исследовании влияния 10 тМ раствором аминокислот на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника белуги и русского осетра (рис. 19) установлено, что глицин не вызывает достоверных изменений этого показателя. Уровень активности фермента в данном случае у белуги составляет 5,82±0,33 мкмоль/(гхмин), у русского осетра 5,59±0,11 мкмоль/(гхмин). L-глутамин достоверно активирует уровень активности данного фермента у белуги до 6,29±0,34 мкмоль/(гхмин), и не вызывает достоверных изменений у русского осетра. L-лейцин и DL-P-фенил-а-аланин приводят к достоверному (р 0,05) увеличению уровня активности данного фермента у обоих видов. Так при действии L-лейцина уровень активности фермента составляет 7,77±0,26 и 5,97±0,13 мкмоль/(гхмин) у белуги и русского осетра соответственно. DL-P-фенил-ос-аланин присутствуя в инкубационной среде увеличивает скорость гидролиза мальтозы у белуги до 6,60+0,33 мкмоль/(гхмин), у русского осетра до 6,23±0,27 мкмоль/(гхмин).
Данные представленные на рисунке 20 демонстрируют влияние модификаторов углеводной природы на уровень активности мальтазы слизистой оболочки кишечника севрюги и белого амура. Как видно из рисунка уровень активности данного фермента в присутствии в инкубационной среде 10 тМ раствора глюкозы и эквимолярного раствора глюкозы и фруктозы приводит к достоверному (р 0,05) замедлению скорости гидролиза мальтозы.
Влияние углеводов и аминокислот на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника рыб
К наиболее эффективным ингибиторам пептидного пищеварения относят вещества липидной природы. В присутствии лецитина торможение гидролиза дипептидов в тонкой кишке крыс составляет 30-80% в зависимости от концентрации субстрата и ингибитора. (Уголев и др., 1975).
Мальтоза и сахароза, а также эквимолярные растворы соответствующих моносахаридов оказывают активирующее действие на гидролиз глицил-DL-лейцина в тонкой кишке цыплят. Было также показано, что глюкоза обладает незначительным тормозящим действием на гидролиз пептидов, в то время как смесь глюкозы и фруктозы не оказывает ни какого эффекта (Кушак, 1983).
Сейчас достоверно известно, что L-метионин существенно тормозит гидролиз пептидов гомогенатами тонкой кишки крыс (Cheesman, Smyth, 1975). Гидролиз глицил-Ь-лейцина интактными препаратами тонкой кишки цыплят в присутствии DL-метионина не меняется. В то же время эта аминокислота оказывает выраженное влияние на гидролиз дипептида солюбилизированными ферментами и, особенно, гомогенатами кишечника (Кушак, 1983). На основании этого можно предположить, что метионин, является регулятором пепти-дазной активности энтнроцитов. Действие остальных аминокислот на гидролиз пептидов в должной степени не исследовано.
На рисунке 26 представлены данные по влиянию моносахаров на уровень активности суммарной протеиназны слизистой оболочки кишечника белуги и русского осетра. Как видно из рисунка ни у белуги ни у русского осетра данные модификаторы не вызвали достоверных изменений в скорости гидролиза казеина. Так уровень активности данного фермента в контроле у белуги составил 2,81±0,13 мкмоль/(гхмин), а при действии 10 тМ растворов глюкозы и фруктозы, а также эквимолярного раствора этих моносахаров 2,72±0,23, 2,75±0,14 и 2,79±0,11 мкмоль/(гхмин) соответственно. У русского осетра уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника в контроле составил 2,44±0,11 мкмоль/(гхмин), при действии 10 тМ раствора глюкозы 2,43+0,12 мкмоль/(гхмин), 10 тМ раствора фруктозы 2,38±0,09 мкмоль/(гхмин) и при действии эквимолярного раствора глюкозы и фруктозы 2,37±0,10 мкмоль/(гхмин).
Присутствие аминокислот в инкубационной среде не привело к статистически значимым изменениям в уровне активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника белуги и русского осетра (рис. 27). Так при действии глицина уровень активности фермента составил 2,73±0,07 и 2,48±0,11 мкмоль/(гхмин) у белуги и русского осетра соответственно. Уровень активности суммарной протеиназы в присутствии L-глутамина, L-лейцина и DL-p-фенил-а-аланина составил соответственно 2,85±0,13, 2,71±0,10 и 2,77±0,12 мкмоль/(гхмин) у белуги и 2,41±0,10 2,51±0,16 и 2,43±0,10 мкмоль/(гхмин) у русского осетра соответственно.
Данные представленные на рисунке 28 демонстрируют влияние модификаторов углеводной природы на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника севрюги и белого амура. 10 тМ раствор глюкозы также как и у белуги и русского осетра не вызвал достоверных изменений в уровне активности фермента. Так контрольное значение уровня активности суммарной протеиназы составило 1,43±0,13 и 0,62±0,07 мкмоль/(гхмин) у севрюги и белого амура. В эксперименте этот показатель у севрюги составил 1,42±0,23 мкмоль/(гхмин), у белого амура 0,61 ±0,07 мкмоль/(гхмин). Наличие 10 тМ раствора фруктозы и эквимолярного раствра глюкозы и фруктоза в инкубационной среде не привело к значимым изменениям в скорости гидролиза казеина у севрюги - уровень активности фермента составил 1,29+0,15 и 1,35±0,10 мкмоль/(гхмин) соответственно. У белого амура эти модификаторы вызвали статистически достоверное (р 0,05) ингибирование уровня активности суммарной протеиназы, до 0,51±0,08 мкмоль/(гхмин) в присутствии глюкозы и до 0,52±0,09 мкмоль/(гхмин) в присутствии глюкозы и фруктозы. Обозначения: по вертикали - скорость реакции в мкмоль/(гхмин). Обозначения: по вертикали - скорость реакции в мкмоль/(гхмин). При исследовании влияния аминокислот в концентрации 10 тМ на уровень активности суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника севрюги и белого амура (рис. 29) установлено, что у севрюги все исследованные нами аминокислоты также как и у других осетровых не вызывают достоверных изменений в уровне активности фермента, и он составляет 1,52±0,12, 1,54±0,07, 1,48±0,09 и 1,55±0,07 мкмоль/(гхмин) в присутствии глицина, L-глутамина, L-лейцина и DL-p-фенил-ос-аланина соответственно. Присутствие глицина в инкубационной среде приводит к увеличению скорости гидролиза казеина в слизистой оболочке кишечника белого амура и уровень активности в этом случае составляет 0,75±0,09 мкмоль/(гхмин). L-глутамин напротив инги-бирует уровень активности данного фермента до 0,52±0,02 мкмоль/(гхмин). L-лейцин и DL-P-фенил-а-аланин не вызывают статистически значимых изменении в скорости гидролиза казеина и уровень активности фермента составляет 0,58+0,03 и 0,63±0,03 мкмоль/(гхмин) соответственно. На рисунке 30 представлены результаты по влиянию моносахаридов на уровень активности сухммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника леща и карася. Как видно из графика данные модификаторы у обоих видов приводят к достоверному (р 0,05) уменьшению скорости гидролиза казеина. Так уровень активности данного фермента при действии 10 тМ раствора глюкозы, фруктозы и эквимолярного раствора этих моносахаров у леща составил 0,84±0,06, 0,78±0,06 и 0,75±0,02 мкмоль/(гхмин) соответственно против 1,08±0,09 мкмоль/(гхмин) в контроле. У карася контрольное значение данного показателя составило 1,16±0,06 мкмоль/(гхмин). Присутствие глюкозы в инкубационной среде привело к уменьшению скорости гидролиза казеина до 0,98±0,05 мкмоль/(гхмин), фруктозы до 0,83+0,03 мкмоль/(гхмин), эквимолярного раствора глюкозы и фруктозы до 0,90±0,02 мкмоль/(гхмин).
