Содержание к диссертации
Введение
1. Оглавление 2
2. Список сокращений 4
3. Введение 6
3.1. Актуальность исследования 6
3.2. Цель и задачи настоящего исследования 12
3.3. Научная новизна 12
3.4. Теоретическая и практическая значимость работы 14
4. Обзор литературы 15
4.1. Оксид азота 15
4.2. Основные этапы изучения оксида азота 15
4.3. Физико-химические характеристики оксида азота 17
4.4. Синтез NO 17
4.4.1 NO - синтазный путь 17
4.4.2. Несинтазный путь синтеза N0 19
4.5. Активные метаболиты N0 в крови 21
4.5.1. Нитрозотиолы 23
4.5.2. Нитрозильные комплексы железа 26
4.5.3. NO и гемоглобин 27
4.5.4. Пероксинитрит 29
4.5.5. NO модифицированные белки 31
4.6. Окисление N0 внутри гидрофобной фазы 33
4.7. Изменения метаболизма N0 в условиях 3ишемии/реперфузии
4.7.1. Ишемия/реперфузия 35
4.7.2. Продукция N0 во время ишемии/реперфузии 39
4.7.3. Значение активных форм кислорода и пероксинитрита в ишемии/реперфузии миокарда
4.7.4. Современные терапевтические подходы 43
4.8. Заключение 48
Материалы и методы исследования 50
5.1. Определение коэффициента распределения NO (QNO) 50
5.2. Определение тиолов и нитрозотиолов 53
5.3. Определение нитротирозина в клетках миокарда методом Вестерн-блот анализа
5.5. Хирургическая подготовка животных 54
5.5.1. Моделирование регионарной ишемии/реперфузии миокарда
5.6. Оценка размеров зоны некроза 56
5.7. Экспериментальный протокол 57
5.7.1. Изучение влияния альбумина и нитрозотиолов на гемодинамические параметры
5.7.2. Изучение влияния «Перфторана» на синтез нитрозотиолов и гемодинамические параметры
5.7.3. Изучение влияния «Перфторана» на размер зоны некроза и уровня нитротирозина в зоне ишемии при ишемии/реперфузии миокарда
5.8. Статистическая обработка результатов 61
6. Результаты 62
6.1. Ускорение реакции окисления оксида азота альбумином плазмы
6.2. Катализ образования низкомолекулярных нитрозотиолов (LMW RSNO) под действием альбумина 64
6.3. Механизм катализа образования LMW RSNO под действием альбумина 66
6.4. Альбумин как депо NO in vivo 69
6.5. Мицеллярный катализ образования LMW RS-NO in N vitro и регуляция артериального давления 72
6.6. Ускорение окисления N0 внутри мицелл перфторуглеводородов 74
6.7. Катализ образования LMW RS-NO под действием 76 PFC in vitro
6.8. PFC как способ изоляции плазменного NO in vivo 77
6.9. Катализ образования LMW RS-NO под действием PFC in vivo и регуляция уровня артериального давления 79
6.10. Роль NO в развитии повреждений миокарда при ишемии/реперфузии 84
7. Обсуждение результатов 89
7.1. Гидрофобная фаза альбумина и «Перфторана» как способ влияния на уровень NO и нитрозопроизводных плазмы 89
7.2. Гидрофобная фаза «Перфторана» как способ снижения повреждения клеток миокарда во время ишемии/реперфузии 95
6. Выводы 98
7. Список литературы 100
- Научная новизна
- Современные терапевтические подходы
- Механизм катализа образования LMW RSNO под действием альбумина
- Гидрофобная фаза альбумина и «Перфторана» как способ влияния на уровень NO и нитрозопроизводных плазмы
Введение к работе
Оксид азота (N0), синтезируемый клетками эндотелия, играет важнейшую роль в гомеостазе сердечно-сосудистой системы. Он регулирует тонус сосудов и проницаемость сосудистой стенки, угнетает адгезию лейкоцитов к поверхности эндотелия, тормозит пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток, обладает антиатеросклеротическим действием.
На многочисленных животных моделях было подтверждено, что угнетение синтеза N0 за счет использования ингибиторов эндотелиальной N0 синтазы (eNOS) или животных с генетической делецией eNOS, приводит к гипертензии, множественным тромбозам, активации взаимодействия лейкоцитов с эндотелиальными клетками, нарушению нормального процесса васкуляризации, ускоряет атерогенез. У людей все основные факторы, повышающие риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, включая гиперхолестеринемию, гипертензию, сахарный диабет и курение, были ассоциированы с дисфункцией эндотелия, характеризующейся нарушением синтеза N0. Эти данные свидетельствуют о том, что пониженное образование N0 является важным фактором в патогенезе многих сердечно-сосудистых заболеваний.
Поэтому, восстановление биологической активности N0 позволит как снизить риск возникновения сердечно-сосудистых патологий, так и улучшить прогноз при их лечении. В последнее время данный подход становится частью общей терапевтической стратегии лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Однако, различные доноры N0, использующиеся с этой целью, обладают рядом побочных действий в первую очередь за счет повышения образования пероксинитрита в тканях. Пероксинитрит (ONOO") образуется при реакции N0 с оксид анионом, уровень которого при ряде заболеваний (например, атеросклерозе) также повышен. За счет высокой нитрозилирующей активности 0N00 , повышение его концентрации в клетке может стать причиной нитрозилирования и нитрования многих клеточных белков. Это, в свою очередь, приводит к потере функции белка, его деградации и может стать причиной повреждения и гибели клетки.
Поэтому возможность, не вводя каких-либо дополнительных количеств экзогенного N0, повышать биологическую активность эндогенно синтезированного оксида азота, открывает большие перспективы. Недавно в литературе появились предположения о том, что благодаря своим гидрофобным свойствам, N0 должен накапливается внутри гидрофобных участков клетки, таких как билипидные слои мембран и глобулярные белки. Мы предположили, что N0, накопившийся внутри гидрофобной фазы не будет потерянным для организма, а будет обладать способностью повышать уровень активных метаболитов N0 - нитрозотиолов в окружающей среде. Это, в свою очередь, позволит обладающим биологической активностью N0 нитрозотиолам восстанавливать недостаток N0 в организме. Для поддерживания постоянного синтеза нитрозотиолов на необходимом уровне достаточно простого введения дополнительных количеств стабильных и нетоксичных тиолов, являющихся естественными компонентами плазмы крови и внутриклеточной среды. Таким образом, серьезная проблема компенсации недостаточной активности N0 при ряде сердечно-сосудистых заболеваний может быть решена за счет собственных резервных количеств N0, превращенных в активные N0 метаболиты.
Существует большой объем экспериментальных данных, подтверждающий, что не только недостаток N0, но и его избыточный синтез N0 лежит в основе многих патологических процессов. Так, например, показано, что, уровень образующегося N0 резко повышается во время гипоксии. При этом степень повышения образования N0 зависит от степени самой гипоксии, ее длительности и уровня рН в гипоксических клетках. В этих условиях N0 образуется не за счет работы eNOS, как это происходит в нормальных условиях, а из нитрита напрямую, за счет реакции диспропорционирования, или под действием ряда редуктаз. При этом концентрация NO в тканях может увеличиваться более чем в 100 раз. При воспалении бесконтрольное увеличение уровня N0 происходит за счет активации экспрессии индуцибельной NO-синтазы под действием бактериальных липополисахаридов, цитотоксинов и других медиаторов воспаления. Поскольку активность iNOS не зависит от концентрации Са2+ в клетке, продукция N0 может стать чрезмерной. Восстановление адекватного снабжения кислородом при гипоксии или активация макрофагов во время воспаления сопровождается резким всплеском в образовании кислородных радикалов и, следовательно, ONOO , обладающего выраженным цитотоксическим действием.
Современные способы коррекции данных состояний основаны на использовании ингибиторов NOS. Однако, синтезируемый в очаге воспаления N0 необходим для борьбы с патогенами и блокада его синтеза нарушает естественный ход событий, снижает эффективность защитных реакций организма. В условиях ишемии, когда высокий уровень образования N0 не связан с активностью NO-синтаз, блокада NOS вообще не может оказать выраженного положительного действия.
Мы предположили, что данная проблема может быть решена за счет использования препаратов на основе биологически инертных высокогидрофобных соединений - перфторуглеводородов. Введение гидрофобных соединений в кровоток позволит удалить избыток N0 в тканях путем его изоляции внутри гидрофобных мицелл. При этом, в отличие от уменьшения уровня N0 путем ингибирования NOS, процесс изоляции N0 внутри мицелл не жесткий, а равновесный. Уменьшение содержания N0 в окружающей мицеллы среде будет приводить к выходу N0 назад в водную фазу. Это позволяет предположить, что использование гидрофобных мицелл не будет нарушать цитостатического и цитотоксического действия N0 на патогены в условиях воспаления.
Несмотря на активное изучение проблемы N0, на сегодняшний день остается открытым большое количество вопросов, касающихся детального понимания механизма участия N0 и его метаболитов в различных физиологических процессах. В частности, это относится к проблеме образования нитрозотиолов (RSNO). С одной стороны, биологическая активность нитрозотиолов находит все большее и большее подтверждение. В настоящее время их принято рассматривать как основной интермедиат, передающий N0 сигнал на мишени. Однако, механизм их синтеза in vivo продолжает оставаться неясным, поскольку прямая реакция между N0 и тиолами не приводит к образованию RSNO, а основной нитрозилирующий агент - N2O3 образуется слишком медленно, чтобы сформировался наблюдаемый в крови пул нитрозотиолов.
Сравнительно недавно было предположено, что благодаря гидрофобным свойствам оксида азота и кислорода, их растворимость в гидрофобной фазе должна быть выше, чем в водной. В этих условиях скорость медленной тримолекулярной реакции внутри гидрофобной фазы должна существенно возрасти. Эти данные дают основание предполагать, что накопление N2O3 внутри гидрофобных участков вызовет увеличение уровня нитрозотиолов в окружающей среде. Однако, прямых доказательств способности гидрофобной фазы принимать участие в синтезе низкомолекулярных нитрозотиолов к моменту начала данной работы не было.
Существует также противоречие в понимании физиологической роли плазматического N0. Поскольку эндотелий находится в непосредственном соприкосновении с кровотоком, часть синтезированного в эндотелиальных клетках N0 попадает в кровяное русло. Раньше считалось, что N0, попадающий в кровоток является «потерянным» для организма. Предполагалось, что, взаимодействуя с оксигемоглобином крови, N0 окисляется до стабильный производных, таких как нитрит и нитрат и выводится из организма. Однако, известны эксперименты, в которых вдыхаемый N0 вызывал расслабление периферических сосудов в условиях ингибирования эндотелиальной NO-синтазы или оказывал продолжительные
гемодинамические эффекты, которые были бы невозможны, если бы NO быстро уничтожался оксигемоглобином крови. Использование эмульсий перфторуглеводородов представляется весьма перспективным средством доказательства физиологической активности N0, растворенного в плазме крови. Высокая гидрофобность данных эмульсий позволяет эффективно изолировать N0 внутри мицелл. Таким образом, удаление N0 из кровотока позволит оценить его физиологическую роль в формировании сосудистого тонуса.
В настоящее время существует большое количество экспериментальных данных, посвященных роли N0 в развитии повреждения клеток миокарда при ишемии/реперфузии (И/Р). Однако, если одни исследовательские группы наблюдают положительные эффекты от использования NOS ингибиторов и отрицательные - в случае применения доноров N0, то другие - наоборот - отмечают положительный эффект от введения N0 доноров и отрицательный - от употребления ингибиторов. Среди причин подобного разброса экспериментальных данных авторы обзора называют в первую очередь отсутствие какой-либо системы стандартизации постановки экспериментов. Считается, что разбросу получаемых результатов способствует большой арсенал доноров и ингибиторов N0, применяющихся в настоящее время, использование совершенно различных концентраций этих препаратов, отсутствие единых правил, касающихся момента и длительности введения препаратов. К тому же, в экспериментах используются различные животные модели, различные виды ишемии (глобальная или местная), и совершенно различная длительность периодов ишемии и реперфузии.
Однако, остается непонятным, почему различия в дизайне экспериментов являются причиной полностью противоположных, взаимоисключающих друг друга результатов. На сегодня хорошо известно, что различные концентрации N0 способны оказывать противоположные эффекты. Во многих случаях низкие, близкие к физиологическим концентрациям, количества N0 обладают стимулирующим действием, в то время как более высокие его концентрации действуют угнетающе. Тем не менее участие N0 в процессе развития клеточной гибели во время И/Р на данный момент остается неизученным. В тоже время, очевидно, что понимание данного процесса очень важно не только в научном, но и прикладном значении, оно откроет совершенно новые возможности в лечении постишемических повреждений, а использование препаратов, регулирующих уровень N0 в тканях приобретет вместо хаотического вполне ясный и обоснованных характер.
После опубликования ряда работ, показавших, что во время ишемии миокарда, уровень N0 в ишемизированной ткани резко возрастает за счет его образования несинтазным путем из нитрита, стало понятно, что чрезмерное накопление N0 в участках ишемии может быть причиной повреждения клеток в начальный момент реперфузии. Показано, что локальное увеличение концентрации N0 и активных кислородных радикалов приводит к резкому всплеску в образовании пероксинитрита в постишемической ткани. Этот факт позволил нам предположить, что использование гидрофобной фазы в начальный момент реперфузии позволит снизить уровень N0 в ишемических клетках, что, возможно, позволит уменьшить размер постишемических повреждений.
Таким образом, актуальность и перспективность исследования отдельных этапов метаболизма N0, его распределения в организме, участия в развитии повреждения клеток при ишемии/реперфузии, а также возможности коррекции избыточного или недостаточного содержания N0 в тканях за счет использования свойств эндогенных и синтетических гидрофобных соединений, не вызывает сомнений и представляет интерес как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины.
Научная новизна
Полученные в работе результаты впервые экспериментально доказывают высокую физиологическую активность гидрофобных областей, входящих в состав эндогенных белков и их участие в регуляции уровня оксида азота и его активных метаболитов в крови. Представленные в работе данные демонстрируют также возможность регуляции уровня N0 и низкомолекулярных тиолов путем введения строго определенных количеств синтетических гидрофобных соединений и их комбинаций с эндогенными тиолами. Согласно полученным в работе результатам, препараты на основе перфторуглеводородов могут быть предложены для дальнейшего изучения в качестве терапевтических средств для коррекции состояний, связанных как с избыточной продукцией оксида азота (воспаление, ишемия различных органов), так и для состояний, характеризующихся пониженной биологической активностью N0 (гипертензия, атеросклероз, старение и др.)
Результаты наших исследований позволяют также предложить дальнейшее изучение возможности использования эндогенных тиолов (цистеина и глутатиона) самостоятельно и в комбинации с гидрофобными веществами в качестве терапевтических агентов, позволяющих вызывать тонко регулируемую пролонгированную гипотензию.
Наши результаты расширяют теоретические представления о роли оксида азота в формировании клеточного повреждения при ишемии/реперфузии. Показано, что повышение концентрации N0 в зоне ишемии приводит к достоверному возрастанию степени повреждения миокарда. В тоже время снижение его уровня ниже определенных значений приводит к потере антиоксидантной защитной функции N0. Результаты применения «Перфторана» для снижения области некроза миокарда после ишемии/реперфузии позволяют предложить клинические испытания этого препарата для лечения реперфузионных повреждений миокарда.
В настоящее время проблема оксида азота и нитросоединений привлекает самое широкое внимание специалистов, занимающихся изучением биомедицинских аспектов. Лавинообразный рост публикаций по биологии N0, начавшийся с конца 80-х годов, позволил редакции журнала "Science" в 1992 году провозгласить N0 молекулой года (Ванин, 1998). Причина такого повышенного интереса заключается в огромном многообразии функций этой небольшой молекулы. Регуляторное действие оксида азота во всех системах организма позволяет назвать это соединение новым физиологическим мессенджером.
Активное изучение медицинского аспекта проблемы N0 привело к созданию ряда новых направлений в медицинской науке. На сегодняшний день N0 широко изучают кардиологи и невропатологи, иммунологи и онкологи, гематологи и токсикологи. Вместе с тем остается еще очень много вопросов, связанных с причинами и механизмами столь универсального характера действия N0. До конца не изучена и отмечаемая многими исследователями двойственность действия NO во многих биологических системах.
В 1955 году Роберт Фёрчготт, проводя физиологические эксперименты с кровеносными сосудами, обнаружил расслабляющее действие света на аорту кролика. Это загадочное поведение аорты в ответ на действие света стало в дальнейшем для него и других исследователей объектом пристального внимания. В середине 70-х Ферид Мюрад показал, что гуанилатциклаза активируется при действии нитро- и нитрозосоединений.
Мюрад высказывает идею, что действующим активным началом этих соединений являются не они сами, а окись азота. В 1980 году Фёрчготт сообщает об открытии неизвестного физиологически активного вещества -эндотелиального релаксирующего фактора (ЭДРФ). В 1987 году, Луис Игнарро опубликовал в журнале PNAS статью, с изложением выдвинутой независимо им и Фёрчготтом гипотезы об идентичности оксида азота и ЭДРФ. Параллельно с ними такие же данные получил Сальвадор Монкада. Значимость этих исследований подтверждена присуждением группе американских ученых R. Furchgott, F. Murad, L, Ignarro Нобелевской премии за 1998 год за серию исследований «Монооксид азота как сигнальная молекула в сердечно-сосудистой системе».
В нашей стране исследованиям в этой области положил начало проф. А. Ф. Ванин. В 1965 году журнал "Биофизика" опубликовал его статью, в которой говорилось, что в биологических объектах обнаружены радикалы неизвестной природы. Затем Ванин изучал биологическое действие динитрозильных комплексов железа и показал, что они обладают мощным гипотензивным действием. Ванин также предложил метод обнаружения окиси азота в органах и тканях, получивший широкое распространение. В 1985 году он первым пришел к убеждению, что ЭДРФ имеет прямое отношение к окиси азота.
За годы, прошедшие после этих открытий выяснилось, что оксид азота является универсальным биологическим регулятором и содержится практически во всех тканях человеческого организма. Открылись возможности новых подходов в лечении огромного числа заболеваний человека. Помимо регуляции оксидом азота тонуса сосудистой стенки, доказано его влияние на тонус полых органов брюшной полости, состояние бронхов и альвеол легких, реологические свойства крови, иммунные процессы, нервно-мышечную передачу.
Современные терапевтические подходы
Исследования при помощи ЭПР метода показывают значительный всплеск в образовании кислородных радикалов в начальный период реперфузии (Wang et al., 1996). Пик образования радикалов приходится на первую минуту, реперфузии, а уже к 5 минутам с момента восстановления кровотока их уровень снижается до исходных, предишемических значений. Приблизительно в тот же временной диапазон происходит и возрастание уровня пероксинитрита. Максимальные значения, достигающие 10 кратного увеличения уровня ONOO по сравнению с исходным, наблюдается к 40 секундам после начала реперфузии, возвращаясь к нормальным значениям в течение следующих 15 минут.
На сегодня хорошо известно, что пероксинитрит оказывает выраженное токсическое действие на кардиомиоциты и вызывает нарушение их сократительной способности (Ishida et al., 1996). Токсическое действие связано в первую очередь с его проапоптотическим действием. Так, например, было показано, что обработка клеток пероксинитритом приводит к активации каспазы-3, запускающей в свою очередь каскад реакций с участием каспаз, приводящий к апопототической гибели клетки (Virag et al., 1998; Arstall et al., 1999). Имуногистохимически было выявлено совпадение областей, имеющих позитивную реакцию к антителам на нитротирозин -маркер пероксинитрита и к каспазе-3 (Dohi et al., 2003). Кардиомиоциты являются очень чувствительными к действию пероксинитрита клетками. Выраженный апоптоз наступает при концентрации пероксинитрита 10 цМ/л, а при более высоких концентрациях клетка погибает по пути некроза.
Нарушение сократительной функции кардиомиоцитов, наблюдаемое под действием пероксинитрита связывают с его способностью нарушать работу Na/Ca обменников (Ishida et al., 1999). Показано, что именно действием пероксинитрита опосредованы эффекты доноров N0, а также предшественника N0 - L-аргинина, заключающиеся в нарушении сократительной функции и приводящие к развитию «станинг» синдрома (Morietal., 1998).
Современные терапевтические подходы На настоящий момент существует два совершенно противоположных подхода к терапии постишемических повреждений миокарда за счет коррекции уровня N0 и его производных. Одна из принятых тактик заключается во введении в организм экзогенных источников N0 в виде NO доноров и NO предшественника - L-аргинина. Другая - наоборот, в подавлении эндогенного синтеза N0 путем применения NOS ингибиторов. Удивительно, что в обоих случаях удается достигнуть более или менее выраженных положительных результатов (табл. 1, 2). Причина столь парадоксального явления, очевидно, заключается в различных механизмах действия экзо- и эндогенного N0. Так, положительный эффект, наблюдаемый при использовании экзогенных источников N0, связан в первую очередь с торможением активации нейтрофилов и их адгезии к сосудистой стенке под действием оксида азота (Kubes et al., 1991). Это позволяет значительно понижать выраженность постишемических повреждений эндотелия и предотвращать нарушения эндотелиальной функции (Weyrich et al., 1992), в первую очередь, синтеза NO, наблюдающихся на стадии поздней реперфузии и лежащих в основе патологических процессов, усугубляющих повреждения ткани, вызванные гипоксией. NO также предотвращает агрегацию и адгезию тромбоцитов, образование микротромбов и нарушение микроциркуляции, т.е. возникновение синдрома «no-reflow» в постреперфузионном периоде (Lincoff et al., 1993). Помимо этого NO обладает способностью терминировать вызванные пероксинитритом реакции окисления липидов (Rubbo et al., 1994) и понижать внутриклеточный уровень Са (Nakashima et al., 1986), увеличение которого может приводить к повреждению клетки и возникновению «станинг» синдрома. Однако использование дополнительных источников N0 имеет свои ограничения. Во-первых, часто применяющийся в исследованиях на животных L-аргинин, не всегда оказывает выраженное положительное действие (Sato et al., 1995), поскольку повреждение эндотелия во время ишемии может значительно понизить его способность к синтезу N0. Окисленный нитрит натрия, применяемый в качестве N0 донора (Johnson et al., 1990), может обладать токсическим эффектом, схожим по механизму с действием пероксинитрита, т.к. испускаемая им частица N0+ может приводить к нитрозилированию и нитрованию белков. К тому же на примере нитроглицерина хорошо известно, что доноры N0 способны вызывать так называемый «синдром обкрадывания», при котором наблюдается выраженное расширение сосудов здоровых областей. В результате объем циркулирующей крови перераспределяется в сторону здоровых тканей, вызывая дополнительный дефицит кровоснабжения «проблемной» зоны.
Механизм катализа образования LMW RSNO под действием альбумина
Высокое значение коэффициента распределения (Q) в среде гидрофобная фаза/вода для N0, а также полученные нами in vitro и in vivo результаты позволяют предположить, что в обычных условиях, вследствие процесса сорбции NO гидрофобными участками, белки плазмы должны накапливать N0. А поскольку концентрация свободного кислорода, растворенного в крови высокая, мицеллярный катализ окисления N0 должен приводить к тому, что значительная часть альбумина, циркулирующего в кровотоке, будет насыщена N2O3. Мы предполагаем, что такой насыщенный в естественных условиях альбумин будет работать как катализатор образования низкомолекулярных нитрозотиолов. Чтобы напрямую убедиться в этом, мы изучали способность плазмы крови вызывать образование GS-NO. Для этого был поставлен эксперимент, идентичный тому, что представлен на рис. 8 В, с той разницей, что вместо насыщенного BSA использовали свежеприготовленную плазму крыс (рис. 14 А). Несмотря на то, что к плазме не было добавлено никакого дополнительного N0, добавление к ней глутатиона вызывало образование значительного количества нитрозоглутатиона. Количество вновь образованного GS-NO превышало уровень уже существовавших в плазме нитрозотиолов более, чем в 2 раза. Это говорит о том, что значительная часть вновь образованных нитрозотиолов не может быть объяснена процессом транснитрозилирования. Более того, если плазму преинкубировать в течение 60 минут прежде чем добавлять глутатион, количество GS-NO, которое будет образовываться в этом случае уменьшится в 2 раза (рис. 14 А). Аналогичная зависимость способности синтезировать нитрозотиолы от времени наблюдалась in vitro в экспериментах с BSAN203 (рис. 10 В). Данные результаты действительно подтверждают гипотезу насыщенности плазменных белков NO/N2O3 и их способность выступать в роле катализатора образования LMW RS-NO in vivo.
Для подтверждения этого заключения, мы изучили эффект GSH на образование LMW RS-NO и уровень артериального давления у крыс. In vitro образование низкомолекулярных нитрозотиолов в присутствии насыщенного альбумина или плазмы зависит от исходной концентрации тиолов (рис. 8 В). Для изучения того, существует ли подобная зависимость и in vivo, мы измеряли уровень циркулирующих в плазме крови LMW RS-NO и САД в ответ на введение крысам различных доз глутатиона. Как видно из рис. 14 С, введение 0.4 г/кг GSH приводило к более, чем 4-кратному повышению уровня LMW RS-NO в плазме. Этот эффект совпадал с одновременным снижением артериального давления, которое затем оставалось на новом, пониженном уровне приблизительно в течение часа.
В данном эксперименте мы использовали относительно высокие дозы глутатиона, поскольку известно, что клетки ряда тканей и органов обладают способностью активно захватывать глутатион из крови (Garcia-Ruiz et al., 1992; Lash et al., 1984). Поэтому, концентрации, использованные в данном эксперименте (5, 12 и 20 тМ) являются лишь начальными концентрациями глутатиона в крови. Как показано на вкладыше к рис. 14 С, вследствие захвата глутатиона тканями. Его концентрация в крови снижается по экспоненте. Таким образом, на момент,.когда производился замер данных ( через 10 мин. после введения GSH) уровень детектируемого глутатиона, хотя и превышал исходные значения, все же уже находился в микромолярном диапазоне. Эффект глутатиона на уровень давления и нитрозотиолов зависел от дозы и хорошо коррелировал с дозозависимой кривой образования GS-NO in vitro (рис 8 В). Данные результаты предполагают, что механизм мицеллярного катализа образования S-нитрозотиолов действительно существует и играет важную роль в регуляции сосудистого тонуса в организме млекопитающих.
Для того, чтобы убедиться, что наблюдаемые нами эффекты есть результат работы именно мицеллярного катализа окисления NO, а не обусловлены уникальным действием альбумина, а также для того, что более детально изучить данный эффект и его физиологическую роль, мы попробовали использовать в качестве гидрофобной фазы мицеллы биологически инертных высокогидрофобных веществ перфторуглеводородов (PFC), применяемых в качестве современных плазмозаменителей.
Благодаря высокой гидрофобности PFC, растворимость кислорода внутри их мицелл приблизительно в 12 раз больше, чем в плазме (Gervits, 1994). Именно это позволило использовать препараты, изготовленные на их основе в качестве плазмозаменителей с уникальными газотранспортными свойствами. Российский препарат на основе PFC - «Перфторан» содержит 13% перфтордекалина и 6.5 % перфторметилциклогексилпиперидина, которые формируют мицеллы размером — 7 микрон, стабилизированные проксанолом (табл. 1; рис 6 А).
Поскольку N0 является гидрофобной молекулой, мы предположили, что он, также как и кислород, будет накапливаться внутри мицелл «Перфторана», что, в свою очередь, должно привести к ускорению реакции окисления N0. Для того, чтобы определить максимальное ускорение данной реакции (Н), мы измерили коэффициент распределения (Q) для системы PFC/вода (рис.6 С). "Согласно полученным нами данным, Q в этих условиях равен 200. Поскольку Q для кислорода 12, для тримолекулярной реакции образования N203: Н = 2QNO xQ02 = 2 200x12 = 5x105. Данный расчет предполагает, что если в крови будут циркулировать даже небольшие количества PFC, они смогут изолировать из кровотока значительное количество NO. В то же время накопление NO и кислорода в малом объеме мицеллы приведет к увеличению скорости образования N2O3 в сотни тысяч раз, что в свою очередь сможет вызвать быстрое нитрозилирование низкомолекулярных тиолов плазмы (рис 6 В).
Гидрофобная фаза альбумина и «Перфторана» как способ влияния на уровень NO и нитрозопроизводных плазмы
Представленное в настоящей работе исследование демонстрирует роль гидрофобной фазы, в виде которой могут выступать как белки плазмы, так и синтетические гидрофобные вещества, в метаболизме N0. Молекулы белков, имеющих глобулярную структуру и, следовательно, гидрофобную область внутри глобулы, можно рассматривать как мицеллу, способную концентрировать N0 плазмы крови. Согласно нашим данным, концентрация N0 внутри молекулы альбумина должна быть в 120 выше, чем в окружающей водной среде (QNO 120). Это означает, что даже если Q02 для альбумина равно всего лишь 1, скорость окисления внутри молекулы альбумина должна увеличиваться в несколько тысяч раз. Мы также показали, что высокореактивный продукт данной реакции, N2O3, стабилизируется внутри протеина. Таким образом, за счет мицеллярного катализа образования N2O3 с одной стороны и стабилизации этого коротко живущего нитрозилирующего агента с другой, альбумин можно рассматривать как потенциальный катализатор нитрозилирования как своих собственных аминокислотных остатков, в первую очередь цистеина и триптофана, так и внешних тиолов.
Механизм мицеллярного катализа окисления N0 под действием альбумина может объяснить существующий парадокс между относительно высокими концентрациями нитрозотиолов, измеряемыми in vivo (Jia et al., 1996; Keaney et al., 1993; Scharfstein et al., 1994; Gaston et al., 1998; Wink et al., 1999) и низкой концентрацией циркулирующего в плазме N2O3. Реакция между N0 и 02 - третьего порядка (к 4хЮ6 M sec"1) (Wink et al., 1994; Lewis et al., 1994), поэтому в нормальных условиях, в отсутствие воспаления, образование нитрозилирующих веществ, таких как N2O3, будет происходить слишком медленно для того, чтобы смогло образоваться такое количество нитрозотиолов, которое может быть обнаружено современными методами (Hogg, 2002). Однако, согласно нашим результатам, базальный уровень RS-N0 в плазме колеблется с 50 пМ до 1 иМ, что хорошо согласуется с опубликованными данными (Jia et al., 1996; Keaney et al., 1993; Scharfstein et al., 1994; Gaston et al., 1998; Wink et al., 1999). Реальное количество циркулирующих в плазме RS-NO, возможно, даже выше, поскольку некоторые LMW RS-NO, например, Б-нитрозо-СуБ или S-нитрозо-а-липоевая кислота, очень нестабильны и могут частично разлагаться в процессе приготовления образца.
Наши in vitro и in vivo результаты хорошо коррелируют друг с другом и подтверждают модель, согласно которой белки плазмы, в первую очередь альбумин, в обычных условиях насыщенны N2O3 и способны передавать частицу NO+ на LMW RSH. Мы показали, что уровень циркулирующих в плазме RS-NO можно увеличить в несколько раз, если ввести в кровь дополнительные количества GSH (рис. 14). Очевидным объяснением данного результата является перенос NO+ на GSH с образованием GS-NO. При чем это происходит не только за счет реакции транснитрозилирования, когда N0 переносится с нитрозилированных альбуминных остатков цистеина и триптофана, но и напрямую за счет проникновения гидрофобного «хвоста» тиола в гидрофобное нутро белка (рис. 12). Данные выводы находят дополнительное подтверждение в экспериментах со свежей плазмой, проявляющей способность вызывать нитрозилирование добавленного к ней глутатиона (рис 14 А). Поскольку свежеприготовленная плазма оказалась способной продуцировать GS-NO до уровня, значительно более высокого, чем уровень исходно существовавших в плазме нитрозотиолов, можно говорить о наличии in vivo значительного источника NO+, не относящегося к RS-NO. Нитрозилирующая способность свежей плазмы продолжается приблизительно то же время, что и аналогичная активность BSAN203 (рис. 9 В) и хорошо коррелирует с измеренным нами временем полужизни N2O3 внутри альбумина (рис. 7 В). К тому же QN0 для плазмы и чистого альбумина тоже практически совпадает (рис. 5 В). Взятые вместе, все эти данные доказывают, что значительная часть NO+, циркулирующего в кровотоке происходит из N2O3, накопленного внутри гидрофобной части альбумина.
Другим важным источником NO+ в крови является S-нитрозо-гемоглобин (SNO-Hb) (Jia et al., 1996). Как и альбумин, Hb является глобулярным белком, что предполагает наличие гидрофобного ядра, которое, в свою очередь, может быть местом образования N2O3 за счет мицеллярного катализа окисления NO. Однако, в отличие, от альбумина, который переносит NO+ на тиолы быстро и напрямую, SNO-Hb работает как относительно медленная система, поскольку зависит от мембранного белка 1, являющегося анионным обменником и «закачивающего» NO+ из эритроцитов (Pawloski et al., 2001). К тому же способность НЬ переносить NO+ очень чувствительна к рОг (Lipton et al., 2001). Таким образом, Hb и альбумин могут представлять собой два основных производителя и переносчика NO+, имеющих разных цели. Если НЬ реализует таким образом вазоактивное действие, обеспечивающее насыщение гипоксичных тканей кислородом, то аналогичная активность альбумина, возможно, более универсальна и обеспечивает непрерывную регуляцию уровня NO и нитрозопроизводных в крови, а, следовательно, позволяет поддерживать артериальное давления на постоянной уровне.
К гидрофобным веществам искусственного происхождения, обладающим потенциальной возможностью накапливать N0, следует в первую очередь отнести эмульсии перфторуглеводородов, использующиеся в качестве плазмозаменителей и обладающие способностью накапливать кислород и разносить его по органам и тканям. Исследования показали высокую эффективность использования PFC при острой кровопотере в результате травмы или во время операционного вмешательства (Голубев et al., 1983; Иваницкий et al., 1996; Мороз et al., 1995; Клигупенко et al., 1997; Ханевич et al., 1997).
