Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Физиологическое значение ряда показателей крови 9
1.2. Состояние вопроса определения ошибки метода 16
1.3. Особенности представления в литературе цифрового и графического материала 23
1.4. Методы статистической обработки, применяемые в ветеринарии 25
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 32
2.1. Методы и методики лабораторного анализа крови 32
2.2. Примененные методики статистической обработки данных 36
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 38
3.1. Сравнительное изучение ошибок методов, допускаемых при определении показателей крови 38
3.1.1. Ошибка метода, допускаемая при определении количества эритроцитов 39
3.1.2. Ошибка метода, допускаемая при определении количества лейкоцитов 42
3.1.3. Ошибка метода, допускаемая при определении концентрации ге-мо-глобина 47
3.1.4. Ошибка метода, допускаемая при определении количества общего белка 49
3.1.5. Ошибка метода, допускаемая при определении скорости оседания эритроцитов 51
3.2. Разработка методики приведения ошибок опыта и метода к унифицированному объему выборки 52
3.3. Определение погрешности, допускаемой при приведении ошибки метода к большей кратности анализа пробы крови 54
3.4. Усовершенствование методики определения ошибки метода применительно к однократному анализу проб крови в выборке 56
3.5. Определение зависимости ошибки метода от кратности анализа каждой пробы и объема выборки 59
3.6. Разработка методики определения ошибки репрезентативности при исследовании ряда показателей крови 62
3.7. Ускоренный способ подсчета лейкоцитов в камере Горяева 65
3.8. Разработка простого способа экспресс контроля уровня достоверности результатов исследований 73
3.9. Оценка уровня достоверности, обеспечиваемого в литературе при определении гематологических и биохимических показателей крови 80
3.10. Рекомендации к представлению статистических показателей и анализу экспериментальных данных 86
3.11. Совершенствование системы представления статистических данных на графиках 97
3.11.1. Алгоритм оптимального представления показателей статобработки на графиках 97
3.11.2. Техника отображения результатов статистической обработки на графиках с помощью приложения Microsoft Excel 100
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 103
5. ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ П2
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
7. ПРИЛОЖЕНИЯ Ш
7.1. Методика контроля ошибки анализа проб крови. Методические указания
7.2. Методика компьютерного вычисления ошибки метода и ошибки репрезентативности в структуре ошибки опыта на базе проиложения Mi-139
- Физиологическое значение ряда показателей крови
- Методы и методики лабораторного анализа крови
- Сравнительное изучение ошибок методов, допускаемых при определении показателей крови
- ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
- ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Введение к работе
Актуальность темы. В процессе проведения физиологических исследований применяется целый ряд методов для определения показателей крови. Анализ приводимых в литературе данных показывает, что некоторым автора не удается статистически подтвердить достоверность полученных результатов по причине наличия сравнительно большой величины ошибки опыта (порядка 10% и более). Имеются немало случаев, когда в опытах не удается выявить даже физиологически значимые изменения показателей крови (на уровне 15-20 %), что соответственно снижает эффективность проводимых исследований.
Отмеченное положение обусловлено недостаточным уровнем разработки методических основ контроля уровня ошибки метода, структуры ошибки опыта и способов их снижения. Для успешного планирования, прогнозирования и проведения эксперимента необходимо знать не только величину ошибки опыта, но и соотношение между ошибкой метода и ошибкой репрезентативности и в соответствии с ним - применять оптимальный способ снижения ошибки опыта.
В известных в справочниках и учебных пособиях в достаточном объеме описываются методы определения многих показателей крови (Кудрявцев А.А., Кудрявцева Л.А., 1974; Бочарников Н.Р., 1976; Смирнов A.M., Коно-пелько П.Я. и соавт., 1981; Рихтер В., Вернер Э., Бэр X., 1982; Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. и соавт., 1985; Камышников B.C., Воло-товская О.А., Ходюкова Л.Б. и соавт., 2003; и др.). Вместе с тем, только в единичных пособиях и публикациях (Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. и соавт., 1985) приводятся "паспортные" значения, к тому же лишь одной составляющей ошибки регистрируемой в опытах и без возможности приведения их к используемым объемам выборок.
Следует также иметь ввиду, что точность используемых методов, обеспечиваемая рядом исследователей, оказывается заметно ниже "паспортных" значений и недостаточной внекоторых случаях для подтверждения в опыте существенных изменений показателей крови. Это требует применения контроля собственной погрешности анализов, приведения ее значений к конкретной величине объема выборки и соответственно обуславливает необходимость поиска относительно простых приемов снижения ошибок методов.
Важной задачей является также повышение уровня статистического анализа результатов как собственных исследований, так и других авторов с целью получения дополнительной информации на основе дообработки материалов их публикаций. Решению этой задачи может способствовать разработка простых экспресс-приемов статистической обработки, которые позволяли бы исследователям быстро, без применения вычислительной техники, но с достаточным приближением, оценивать уровень достоверности приводимых в публикациях результатов.
Следует отметить, что известные методы статистической обработки данных, обстоятельно описанные в учебных пособиях Н.А.Плохинского (1970), Г.Ф.Лакина (1990) и др., построены на теоретическом допущении, что ошибка метода настолько мала, что ею можно пренебречь. Однако это условие нередко не выполняется в биомедицине, что требует разработки новых подходов.
В определенной степени ускоренное получение информации достигается при представлении экспериментальных данных в виде графиков. Между тем, они в большинстве случаев приводятся без доверительных данных и уровня достоверности, то есть без указания основных показателей статистической обработки, что существенно сказывается на представляемых материалов.
Для ускорения внедрения в практику разрабатываемых новых методик контроля структуры ошибки опыта и оперативного выбора схемы проведения опытов необходимо определенное компьютерное их обеспечение на базе соответствующих алгоритмов.
Все вышеизложенное свидетельствует о том, что проблема выяснения структуры ошибки опыта и снижения ее составляющих, повышения уровня статистической обработки данных и их анализа, а соответственно и совершенствования техники планирования исследования является достаточно актуальной.
Цель и задачи исследований. Целью данного исследования является создание базы для повышения достоверности результатов исследований и усовершенствования приемов анализа экспериментальных данных. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:
1. Разработать методики определения составляющих ошибки опыта и снижения ошибок метода с последующей компьютерной реализацией на базе приложения Microsoft Excel.
Изыскать возможность повышения точности и скорости анализа содержания лейкоцитов в крови.
Разработать простой способ анализа результатов исследования крови по данным литературы без применения вычислительной техники.
Выработать рекомендации по устранению типовых ошибок представления экспериментальных данных в табличном и графическом виде.
Усовершенствовать способ отображения статистических данных на графиках и таблицах и осуществить его реализацию с помощью приложения Microsoft Excel.
Научная новизна. Впервые разработаны и предложены методики определения структуры ошибки опыта - ошибки метода и показателя разнообразия признака (ошибки репрезентативности) в выборке. Установлены нормативные значения ошибки метода в структуре ошибки опыта при определении количества эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева, содержания гемоглобина гемиглобинцианидным методом, общего белка по биуретовой реакции, а также СОЭ в аппарате Панченкова с учетом используемого объема выборки.
Предложены аналитические выражения для определения ошибки опыта при К-кратном анализе проб крови и приведения ее значений к унифицированному объему выборки, равном 5.
Разработан алгоритм представления статистических показателей на графиках и осуществлена типизация ошибок, допускаемых при представлении цифрового и графического материалов.
Предложенные методики и аналитические выражения открывают возможность изучения динамики фоновых показателей крови, имеющее большое значение в планировании и проведении многих физиологических исследований и получении достоверных результатов.
Практическая ценность. Результаты исследований представляют практическую ценность для ветеринарии, биологии м медицины. Они могут быть применены для оценки структуры ошибки опыта и снижения ее уровня при использовании разных физиологических методов анализа.
Разработанные методики контроля ошибок метода и репрезентативности и ее компьютерная реализация на базе приложения Microsoft Excel создают основу для повышения качества планирования и проведения исследований, а также прогнозирования результатов.
Предложенный простой способ оценки уровня достоверности позволяет ускоренно осуществлять приближенный анализ публикаций без применения вычислительной техники при непосредственном ознакомлении с ними Даны рекомендации по устранению типовых ошибок представления результатов статистической обработки.
По результатам исследований предложено 2 методических указания, которые рассмотрены и одобрены Методическим советом КГАВМ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Оперативный контроль составляющих ошибки опыта (ошибки средней) вначале и в ходе проведения экспериментов позволяет существенно повысить качество и эффективность физиологических исследований.
2. Применение ряда достаточно простых приемов позволяет существенно повысить достоверность анализа экспериментальных данных и уровень их представления в излагаемых материалах.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на: Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным вопросам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2001); Всероссийской конференции токсикологов (Санкт-Петербург); Научно-практической конференции по актуальным вопросам информатики и вычислительной техники (Казань, 2001); Научной конференции молодых ученых и студентов (Казань, 2002); Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным вопросам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2003); расширенном заседании кафедры физиологии и этологии животных (2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Она содержит 33 таблицы и 8 рисунков. Список работ включает 167 источников, в том числе 32 иностранных.
Физиологическое значение ряда показателей крови
Основное назначение эритроцитов заключается в переносе кислорода из легких в капилляры тканей, а углекислого газа, наоборот, из капилляров тканей в легкие. Данную задачу в эритроцитах выполняет непосредственно гемоглобин (Морозова В.Т., 1993; Казакова Н.У., Голиков А.Н., Кожебеков З.К. и соавт., 1991; Ослопов В.Н., Смирнов Ю.В., Садыков А.Р., 1993; и др.).
Эритроциты также участвуют в поддержании концентрации водородных ионов в крови. Оболочка эритроцитов проницаема для анионов и непроницаема для катионов, а также гемоглобина, при повышении давления углекислого газа в тканях, анионы хлористого натра, в том числе О переходят из плазмы в эритроциты. При этом высвобождающиеся части катионов, соединяясь с углекислым газом, образуют соли. В легких происходит обратный процесс, и углекислый газ высвобождается в легких и удаляется из легких при выдохе (Гальперин СИ., 1977; Базанова Н.У., Голиков А.Н., Кожебеков З.К. и соавт., 1991; Гиль-мутдинов Р,Я. и соавт., 1999; и др.).
Эритроциты способствуют поддержанию ионного состава крови и участвуют в водно-солевом обмене. Через мембрану эритроцитов легко проникает вода, ионы водорода, хлора, углекислоты. За сутки через оболочку эритроцитов систематически проходит от сотен до нескольких тысяч литров воды. Они способны адсорбировать токсины, гормоны, продукты расщепления белков, жиров, углеводов. Количество эритроцитов в зависимости от вида животного колеблется в широких пределах от 4,5-7,5 млн/мкл (Кудрявцев А.А., Кудрявцева Л.А., 1974; Бочарников Н.Р., 1976; Рихтер В., Вернер Э., 1982; Кондрахин И.П., Ку-рилов Н.В., Малахов А.Г. и соавт., 1985). Между количеством эритроцитов и их размерами существует обратная зависимость экспоненциального характера.
По уменьшению количества эритроцитов судят о наличии анемии. При острой кровопотере, гемолитической анемии концентрация эритроцитов может снижаться до 1-2 млн/мкг. Данный гематологический показатель широко используется при проведении разных физиологических, токсикологических и микробиологических исследований с использованием простых и автоматических средств (Тремасов Н.Я., Халикова К.Ф., Сметов П.К., Гарипов Т.В., 1983; Ремез В.И., Золотухина Л.З. и соавт., 1989; Атавина О.В., Степанова И.П., Бакаев В.Т., 1998; Бойко Т.В., 1998; Гильмутдинов Р.Я. и соавт., 1999; Иноземцев В.П., Балковой И.И., Нежданова А.Г., 2000; Kung-Ming J.C., 1973; Moeley D.L., Bull B.S., 1982; Brosman E.A., Eales M.M., 1990; Hawkins D., Lambort Т., 1994; Awotwi E.K., Aboagye G.S., 1995; Chatterjee A., 1995; Jachova A., Korenchova В., 1998; и др.).
Физиологическое значение лейкоцитов. Лейкоциты, белые кровяные клетки созревают и гибнут в организме в большом количестве. Продолжительность их жизни составляет порядка 2-4 суток. Наиболее долгоживущими являются Т-клетки. Они могут существовать несколько месяцев, в то время как гранулоциты 8-13 дней, а отдельные из них всего несколько часов. Количество лейкоцитов в крови крупного рогатого скота, овец, свиней и кроликов находится в пределах 4,5-12 тыс/мкл. Наибольшее количество лейкоцитов наблюдается в крови овец и коз. Различают физиологический лейкоцитоз, медикаментозный и патологический. Увеличение количества лейкоцитов в крови отмечается после приема пищи, выполнения тяжелой физической нагрузки, попадания в организм пестицидов и других токсикантов, обильных кровопотерях, вирусных заболеваниях (Кудрявцев А.А., Кудрявцева Л.А., 1974; Смирнов A.M., Конопелько П.Я., Уразаев Н.А. и соавт., 1988; Базанова Н.У., Голиков А.Н., Кожебеков З.К. и соавт., 1991; Федяева Ю.Я., 1998; Гильмутдинов Р.Я. и соавт., 1999; Шахов В.П., Гумилевский Б.Ю. и соавт., 1999; Gross R.L., Newberne R.M., 1980; и др.).
Методы и методики лабораторного анализа крови
Сравнительное изучение ошибок методов, допускаемых при определении показателей крови
Работу выполняли в период с 1999 по 2003 годы на кафедре физиологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины в соответствии с государственным заданием на НИР (№ гос. регистрации 01960003759).
Разработку методических вопросов осуществляли с использованием проб крови клинически здоровых животных - крупного рогатого скота (КРС) черно-пестрой породы, свиней крупной белой породы, кроликов породы шиншилла и беспородных собак. В опытах использованы 93 пробы крови от 42 КРС, 12 свиней, 29 кроликов, 10 собак. Возраст КРС составлял от 3 до 6 лет, свиней и кроликов -1-1,5 года, собак -1-3 года.
В одних опытах осуществляли 3-кратный анализ проб крови, во вторых -5-кратный, а в третьих - при определении СОЭ крови свиней - 10-кратный. В итоге в работе выполнено свыше 557 анализов проб крови. Поскольку работа методического характера, то она могла быть выполнена на основе анализа многих проб крови одного вида животного. Вместе с тем, исследования проведены на тех видах животных, которые были в распоряжении на том или ином этапе исследований. Взятие крови осуществляли у КРС из яремной вены или аорты при забое их, у кроликов из краевой ушной вены, у свиней - хвостовой вены, а у собак -вены предплечья.
Ошибку метода определения количества эритроцитов, лейкоцитов, содержания гемоглобина и общего белка вычисляли при 2-х, 3-х, 4-х и 5-ти кратном анализе проб крови. Ошибку метода определения количества общего белка вычисляли также при многократном анализе проб крови кроликов.
Определение показателей крови осуществляли типовыми методами. Для определения ошибки анализа СОЭ по Панченкову использовали кровь свиней по той причине, что у них данный показатель поддается реальной оценке.
Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов осуществляли в камере Го-ряева по общепринятым методам (Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. 32 и соавт., 1985). Содержание гемоглобина в крови находили гемиглобинцианид-ным методом, общего белка - по биуретовой реакции, СОЭ -в вертикальных пипетках с помощью аппарата Панченкова.
Обсуждение результатов
В процессе физиологических исследований, применяются различные методы анализа проб крови, биологических жидкостей и биотканей, погрешность которых в немалой степени препятствует получению достоверных результатов. Последнее особенно начинает проявляться в тех случаях, когда ошибка опыта становится порядка ±8-10 и более процентов, то есть соизмеримой с физиологическими изменениями в организме.
Величина погрешности методов приводиться лишь в единичной справочной литературе из известных (Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г., Архипов А.В. и соавт., 1985) и лишь для отдельных гематологических показателей. Что касается рекомендаций в них по проверке собственной ошибки анализа, то они носят качественный характер и не учитывают реальный объем выборки, используемый в том или ином опыте.
Для повышения эффективности проводимых исследований и прогнозирования результатов прежде всего необходимо осуществлять контроль за значением ошибки опыта и ее составляющими - ошибкой метода и ошибкой репрезентативности. От уровня ошибки опыта и степени преобладания одной из составляющих во многом зависит схема постановки опыта и обеспечение качества результатов.
Имеется большая необходимость в изыскании простых способов повышения точности анализа и их практической реализации на базе компьютерной техники. Кроме того, при ознакомлении с публикациями в периодической печати, в том числе для подготовки научных обзоров, нужен простой способ, позволяющий осуществлять экспресс-оценку достоверности результатов без применения вычислительной техники.
Эффективность исследований в немалой степени определяется также уровнем статистической обработки и уровнем представления результатов на завершающем этапе исследований. Что касается графического материала, то на них по аналогии с таблицами должны быть представлены не только средние значения, но и статистические показатели, а именно доверительные интервалы.
Анализ графиков дополнительно может быть ускорен, если на опытных кривых также указывать уровни достоверности наиболее характерных отклонений.
Все вышеизложенное указывает на наличие целого ряда задач совершенствования методов анализа, способов обработки и представления данных, требующих комплексного их решения.
Целью данных исследований является создание методической базы для повышения точности анализа и соответсвенно достоверности результатов исследований, а также совершенствования приемов представления результатов статистической обработки.
Экспериментальная разработка поставленных задач осуществлена на базе 4-х широко применяемых методов анализа крови. В опытах использовано 93 пробы крови 4-х видов животных: крупный рогатый скот, кролики, свиньи и собаки. Анализ каждой пробы, в зависимости от выполняемой серии опытов, осуществляли 3 или 5 раз с последующим вычислением значений ошибки метода применительно к 2-х, 3-х, 4-х и 5-ти кратному их анализу.
Определение количества эритроцитов, лейкоцитов, содержания гемоглобина и общего белка в крови осуществляли по общепринятым методам. Всего проведено 557 анализов крови.
В первых сериях опытов (р.3.1-3.4) изучали зависимость ошибки метода от кратности анализа при определении 4-х показателей крови вышеотмеченными методами.
Выводы и практические предложения
1. Предварительный контроль составляющих структуры ошибки опыта ошибки метода и ошибки репрезентативности при анализе многих физиологических показателей позволяет существенно повысить качество планирования и эффективность проведения эксперимента.
При превышении ошибки метода над ошибкой репрезентативности следует изыскать оптимальные способы ее снижения, а при обратном их соотношении - обеспечить более однородные сравниваемые выборки по изучаемому признаку.
2. По мере увеличения кратности анализа с 2 до 5 ошибка определения количества эритроцитов и лейкоцитов крови в камере Горяева уменьшается в структуре ошибки опыта приблизительно в 2 раза и принимает значения соответственно 3,3 и 2,4%, а ошибка определения гемоглобина и общего белка -1,2 и 0,9%. Эти значения могут быть приведены к используемым объемам выборки (п) и служить основой для планирования эксперимента.
3. Увеличение объема выборки с 3 до 5 и кратности анализа всех проб до 2-5 способствует уменьшению ошибки метода в структуре ошибки опыта в 2 - 3,5 раза. Ограничившись только 2-кратным анализом проб, можно в ряде случаев ранее недостоверные результаты измерения (р 0,05) подтвердить с уровнем достоверности р 0,05 -0,01.
4. Ошибка определения количества лейкоцитов в последних 50 больших квадратах камеры Горяева в среднем в 1,8 раза больше, чем в первых 50 и в 4 раза больше, чем в первых 75, что свидетельствует о нарастании утомляемости зрения оператора в процессе счета. Переход к подсчету лейкоцитов в 75 больших квадратах вместо 100 ведет к уменьшению ошибки метода (в 1,6 раза), времени анализа, утомляемости оператора и существенному повышению уровня достоверности результатов исследования.
5. Разработанная простая методика позволяет с удовлетворительной точностью без применения вычислительной техники ускоренно проводить оценку достоверности результатов в публикациях. Она также применима в некоторых случаях и при отсутствии в материалах сведений об объемах выборок и значениях ошибок средних. Недостоверность результатов в некоторых публикациях в основном обусловлена повышенным значением ошибки опыта (10-30%). Это указывает на целесообразность предварительного контроля структуры ошибки опыта и уменьшения соответствующей ее составляющей в ходе постановки опытов.
Выделены и систематизированы типовые ошибки представления результатов статистической обработки, допускаемых в литературе, и даны рекомендации по их устранению, выполнение которых позволяет повысить достоверность приводимых данных и объективность их анализа.
6. Применение на графиках оптимального числа доверительных интервалов (в пределах 5-7) и специальных маркеров, соответствующих разным уровням достоверности (р 0,05; 0,01; 0,001), позволяет повысить качество, информативность и скорость анализа графического материала. В тексте и таблицах публикаций к приводимым статистическим показателям следует дополнительно приводить значения ошибок опыта в относительных величинах в виде m/Cm.
7. Предложенные методики контроля базовых составляющих структуры ошибки опыта и приведения их к унифицированному объему выборки (n=5), а также соответствующие аналитические выражения могут быть использованы при определении разных физиологических показателей.
