Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Современные представления о структурно-функциональной организации дыхательного центра 12
1.1.1. Нейронная организация дыхательного центра 12
1.1.2. Функциональные отделы дыхательного центра 16
1.1.3. Современные представления о респираторном ритмогенезе 22
1.2. ГАМКергическая система и ее физиологическая роль 27
1.2.1. Общая характеристика ГАМКергической системы 27
1.2.2. ГАМК-рецепторы и их физиологические свойства 30
1.3. Участие ГАМКергических механизмов в регуляции дыхания 39
2. Методика исследований 48
2.1. Экспериментальные животные 48
2.2. Наркоз и операционная подготовка 48
2.3. Методика регистрации внешнего дыхания у крыс 49
2.4. Методика регистрации биоэлектрической активности дыхательных мышц у крыс 50
2.5. Методика микроинъекций физиологически активных веществ в комплекс Бетцингера и комплекс пре-Бетцингера у крыс 50
2.6. Методика гистологического контроля 51
2.7. Анализ и статистическая обработка экспериментальных данных 53
3. Респираторные реакции на микроинъекции раствора гамк в комплекс бетцингера и комплекс пребетцингера54
3.1. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях ГАМК в комплекс Бетцингера... 54
3.2. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях ГАМК в комплекс пре-Бетцингера 59
4. Респираторные реакции при стимуляции и блокаде амкв-рецепторов комплекса бетцингера и комплекса пре-бетцингера 65
4.1. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях баклофена в комплекс Бетцингера 65
4.2. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях баклофена в комплекс пре-Бетцингера 70
4.3. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях 2-гидроксисаклофена в комплекс Бетцингера 75
4.4. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях 2-гидроксисаклофена в комплекс пре-Бетцингера 80
5. Респираторные реакции при стимуляции и блокаде гамка-рецепторов комплекса бетцингера и комплекса пребетцингера 87
5.1. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях мусцимола в комплекс Бетцингера 87
5.2. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях мусцимола в комплекс пре-Бетцингера 93
5.3. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях бикукуллина в комплекс Бетцингера 100
5.4. Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях бикукуллина в комплекс пре-Бетцингера 105
6. Обсуждение результатов 113
Выводы 129
Список использованной литературы
- Функциональные отделы дыхательного центра
- Методика регистрации биоэлектрической активности дыхательных мышц у крыс
- Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях ГАМК в комплекс пре-Бетцингера
- Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях 2-гидроксисаклофена в комплекс Бетцингера
Функциональные отделы дыхательного центра
Дыхание, как жизненно важная функция, имеет сложный регулятор-ный механизм, в котором главным звеном является бульбарный дыхательный центр (ДЦ) (Сергиевский М.В., 1950; Сафонов В.А. и др., 1980; Feldman J.L. et al., 1984; Bianchi A.L. et al., 1995; Ramires J.M., 2002; Onimaru H. et al., 2006). Основная функция ДЦ заключается в генерации респираторного ритма (Feldman J.L. et al., 1990; Smith J.C. et al., 1991, 1993; Schwarzacher S.W. et al., 1991; Bou-Flores C., Berger A.J., 2001; Инюшкин А.Н., Глазкова Е.Н., 2007; Сафонов В.А., 2009) и формировании паттерна дыхания (Feldman J.L. et al., 1990; Меркулова Н.А. и др., 2004; Ведясова О.А. и др., 2005; Алиев А.А. и др., 2012; Александрова Н.П. и др., 2013). Первая, базовая, функция ДЦ обеспечивается наличием в нем разных классов ритмически разряжающихся дыхательных нейронов, а вторая обусловлена интегративными процессами на уровне нейросетей ДЦ и их взаимодействиями с супрабульбар-ными структурами (Меркулова Н.А. и др., 2007, 2009; Ведясова О.А. и др., 2009; Михайлова Н.Л. и др., 2012). Определенные нейроны ДЦ, благодаря ассоциативным связям с центрами других функций, осуществляют интеграцию импульсов, приходящих в него по афферентным волокнам от рецепторов дыхательного аппарата и других функциональных систем, обеспечивая паттерн дыхания, соответствующий гомеостатическим запросам организма в каждый момент его деятельности (Бреслав И.С., 1984; Сергиевский М.В. и др., 1993; Сафонов В.А., Тарасова Н.А., 2006; Попов Ю.М., 2008).
Результаты экспериментов с регистрацией активности нервных клеток в ДЦ позволили выделить два основных типа дыхательных нейронов. К одному из них принадлежат нейроны, возбуждающиеся в фазе вдоха (инспира-торные), к другому – нейроны, разряжающиеся в фазе выдоха, т.е. экспираторные
Каждый из этих классов дыхательных нейронов, в свою очередь, включает несколько разновидностей клеток, активность которых приурочена к определенному периоду на протяжении той или иной фазы дыхательного цикла. В связи с этим необходимо указать, что в последние годы исследователи для описания фазовой структуры цикла дыхания используют два подхода – традиционный, признающий 2 фазы (инспираторную и экспираторную) и более новый, выделяющий три фазы – инспираторную, постин-спираторную (фаза Е 1) и экспираторную (фаза Е 2) (Richter D.W. et al., 1992).
Нейроны ДЦ классифицируются также по особенностям проекции аксона, при этом выделяют 3 группы респираторных клеток: бульбоспиналь-ные, или премоторные, которые посылают аксоны в спинной мозг к мотонейронам дыхательных мышц (Сергиевский М.В. и др., 1993; Duffin J., Al-phen J., 1995; Якунин В.Е., Якунина С.В., 1998; Ezure K. et al., 2003); мотонейроны гортани и глотки, управляющие мышцами верхних дыхательных путей (Nunez-Abades P.A. et al., 1992); проприобульбарные нейроны, аксоны которых распределяются в стволе мозга и связаны с другими нейронами ДЦ (Merrill E.G., 1970, 1981; Сергиевский М.В. и др., 1993; Пятин В., Никитин О., 1998; Duffin J. et al., 2000).
В зависимости от частоты колебаний мембранного потенциала и соотношения этих колебаний с фазами цикла дыхания дыхательные нейроны подразделяются на 6 групп: ранние инспираторные нейроны, инспираторные нейроны с нарастающей активностью, поздние инспираторные нейроны, по-стинспираторные нейроны, экспираторные нейроны с нарастающей активностью, преинспираторные нейроны (Bianchi A.L. et al., 1995).
Ранние инспираторные нейроны (декрементные) характеризуются убывающим паттерном активности, они быстро разряжаются в начале вдоха, а концу фазы частота импульсов в залпе снижается. Тела их имеют небольшие размеры и в значительном количестве обнаруживаются в ретрофациальном ядре (Bianchi A.L. et al., 1988). Многие декрементные нейроны являются про-приобульбарными, т.е. интернейронами. Аксоны ранних инспираторных интернейронов ветвятся в пределах ретроамбигуального ядра и параамбигуаль-ной области. Ранние инспираторные нейроны участвуют в формировании ин-спираторного драйва, а ослабление их возбуждения может вызывать прогрессирующее по ходу вдоха растормаживание других инспираторных нейронов (Ballantyne D., Richter D.W., 1984). Следует также отметить, что декремент-ный паттерн инспираторной активности присущ мотонейронам мышц гортани, глотки. Разрядами именно таких нейронов обусловлено сокращение мышц гортани во время вдоха, вызывающее расширение голосовой щели, снижение сопротивления потоку воздуха (Richter D.W., Spyer K.M., 2001).
Инспираторные нейроны с нарастающей активностью (аугментные) относятся к бульбоспинальным (премоторным) и, как считают исследователи, не входят в состав центрального генератора ритма дыхания (Feldman J.L. et al., 1990). Такие нейроны составляют большинство инспираторных нейронов вентральной и дорсальной респираторных областей дыхательного центра. При этом установлено, что у кошек данный тип нейронов регулирует мотонейроны гладких мышц верхних дыхательных путей, диафрагмальные и межреберные моторные нейроны (Feldman J.L. et al., 1984).
Поздние инспираторные нейроны в количественном отношении составляют небольшую порцию инспираторной популяции, а в функциональном плане отличаются преимущественно нарастающим паттерном активности с локализацией максимума частоты в самом конце фазы вдоха. Эти нейроны расположены в ВРГ, ДРГ, а также в КБ и, вероятно, участвуют в регуляции фазовой структуры дыхательного цикла (Del Negro C.A. et al., 2002). Во время первой фазы экспирации поздние инспираторные нейроны не активны по причине «запирания» возбуждающего входа. Разряд формируется во время второй фазы экспирации, но в это время к ним поступают импульсы, вызывающие тормозные постсинаптические потенциалы, в результате чего в нача ле следующего вдоха развивается сильная гиперполяризации их мембран (Richter D.W. et al., 1992). Многие из поздних инспираторных нейронов являются бульбоспинальными, активируются при раздражениях спинного мозга. Некоторая часть таких нейронов активируется входами от легочных рецепторов растяжения, генерируя непродолжительный разряд в конце инспирации, что позволяет рассматривать их как элемент механизма выключения вдоха (Сohen M.I. et al., 1993; Bianchi A.L. et al., 1995).
Постинспираторные нейроны проявляют резкую активацию в начале выдоха, после чего частота генерации импульсов убывает и прекращается в поздней части фазы выдоха. Эти нейроны иначе называют декрементными экспираторными E1 нейронами (Richter D.W. et al., 2000). Изучение электрофизиологических свойств нейронов в области локализации ДЦ показало, что постинспираторный паттерн залповой активности присущ также бульбарным мотонейронам мышц-констрикторов гортани (Sun Q.-J. et al., 2008).
Методика регистрации биоэлектрической активности дыхательных мышц у крыс
Анализ свойств ГАМКА-рецепторов показал, что они активируются самой ГАМК и некоторыми ее агонистами (например, мусцимолом) и блокируются специфическим антагонистом ГАМК бикукуллином. Причем эффективность многих блокаторов зависит от состояния ионного канала, в котором находится ГАМКА-рецептор (Thomas P. et al., 2005). Ионотропные рецепторы составляют единый комплекс с ионофором, поэтому вызываемое лигандом изменение конформации рецептора ведет к открыванию ионных каналов и быстрым сдвигам проводимости постсинаптической мембраны. Активация этих рецепторов приводит к гиперполяризации клеточной мембраны благодаря входу в нейрон ионов Сl– (Сергеев П.В. и др., 1999; Belan P.V., Kostyuk P.G., 2002). В синаптическом ответе ГАМКА-рецепторы определяют быстрый компонент тока, причем канал ГАМКА-рецептора проницаем не только для ионов Сl–, но и для бикарбонат-ионов. В связи с этим эффект активации данных рецепторов зависит от электрохимического градиента вышеуказанных ионов на постсинаптической мембране (Loo D.D. et al., 2000).
В ГАМКА-рецепторе существует целый ряд модуляторных сайтов, отличных от сайта связывания агониста. Вещества, воздействующие на данные сайты, повышают или, наоборот, снижают эффективность активации ГАМКА-рецепторов агонистом. Одним из таких сайтов аллостерических модуляторов является бензодиазепиновый сайт, служащий мишенью для ряда препаратов, используемых в клинической практике: антиконвульсантов, седативных и гипнотических средств. Активация бензодиазепинового сайта ведет к увеличению сродства определенной группы ГАМКА-рецепторов к агонисту. Другим сайтом ГАМКА-рецепторов является сайт барбитуратов. ГАМКА-рецепторы, чувствительные к барбитуратам, более широко распространены в мозге, чем чувствительные к бензодиазепинам (Калуев А.В., 2006-б). На нейронах гиппо-кампа крыс установлено, что барбитураты, в отличие от бензодиазепинов, увеличивают время открытого состояния и проводимость ионных каналов рецептора, что повышает его аффинность к лиганду (Eghbali M. et al., 2000).
Лиганды ГАМКА-рецепторов широко используются в лечении шизофрении (Wassef A. et al., 2003), острых ишемических инсультов (Green A.R. et al., 2000), эпилепсии (Калуев А.В., Натт Д. Дж., 2005), для восстановления когнитивных функций (Maubach K., 2003). В качестве антиэпилептических и седативных веществ применяются и барбитураты, и бензодиазепины. Специфичным действием на ГАМКА-рецепторы обладают также нейростероиды и цинк (Mehta A.K., Ticku M.K., 1999).
Согласно данным Раевского К.С. и Георгиева В.П. (1986), постсинапти-ческий ГАМКцептивный рецептор класса А представляет собой олигомерный комплекс, состоящий из трех взаимодействующих между собой компонентов, в том числе участка распознавания (собственно рецептора ГАМК), участка связывания бензодиазепина и участка связывания -дигидроксипикротоксина. Активация постсинаптических ГАМКА-рецепторов приводит к гиперполяризации клеточных мембран и подавлению нервного импульса.
В аспекте темы нашего исследования также важно, что ГАМКА ионо-тропные рецепторы являются мембранными мишенями действия многих наркотических веществ, вызывающих угнетение дыхания. Комплексное влияние анестетиков общего действия на параметры дыхательной функции, вероятно, обусловлено способностью наркотических веществ модулировать как высвобождение ГАМК из пресинатических терминалей, так и её взаимодействие с мембранными рецепторами нейронов в ДЦ. В связи с этим очевидно, что ГАМКА-рецепторы существенно значимы для деятельности респираторной нейронной сети (Teppema L.J., Baby S., 2011).
Вторая большая группа ГАМК-рецепторов в ЦНС представлена метабо-тропными ГАМКВ-рецепторами, имеющими гетеродимерное строение и состоящими из двух субъединиц — ГАМКВ1 и ГАМКВ2, которые активируются более низкими концентрациями ГАМК, чем рецепторы класса А (Jones K.A. et al., 1998; Mohler H., Fritschy J.M., 1999). Данные субъединицы несколько похожи, но сайт связывания агониста ГАМКB1-рецептора находится в пределах его внеклеточного слоя. За счет этого все агонисты и конкурентные антагонисты ГАМКВ-рецепторов в экстрацеллюлярной зоне связываются с ГАМКВ1-сайтами, а не с ГАМКВ2 (Pfaff T. et al., 1999; Ong J., Kerr D.I., 2005). Однако обе субъединицы, вероятно, функционально неотделимы, поскольку в отсутствии ГАМКB1 субъединиц ГАМКB-рецептор не отвечает на действие агонистов (Schuler V. et al., 2001; Calver A.R. et al., 2001). Внеклеточный ГАМКВ1 домен необходим для связывания лиганда, а трансмембранный ГАМКВ2 домен отвечает за связывание и активацию G белка. Исследователи отмечают, что ГАМКB-рецепторы, локализованные на постсинаптической мембране, участвуют в активировании связанных с G-белком К+-каналов, вызывая гиперполяризацию мембраны нейронов в виде медленного тормозного постсинаптического тока (Мisgeld U. et al., 1995; Margeta-Mitrovic M. et al., 2001; Pin J.-Ph., Prezeau L., 2007).
Следует указать, что субъединица В1 существует в двух вариантах — ГАМКB1a и ГАМКB1b, которые локализованы в отдельных синаптических сайтах, что определяется их различной функцией. Многочисленные исследования показали, что ГАМКB1a и ГАМКB1b демонстрируют различную роль в регуляции функционального состояния нейронов мозга (Poorkhalkali N. еt al., 2000; Princivalle A. et al., 2000). Так, в синапсах гиппокампа активация рецепторов ГАМКB1a-типа подавляет выброс глутамата, уменьшая проводимость ионов Ca++ на уровне пресинаптических терминалей, в отличие от этого ГАМКB1b-рецепторы преимущественно являются посредниками постсинапти-ческого торможения (Vigot R. et al., 2006; Guetg N. et al., 2009). Кроме того, выделены и другие субединицы ГАМКB1-рецепторов: это изоформы ГАМКB1с и ГАМКB1d, которые были определены в ДНК у крысы (Pfaff T. et al., 1999); изоформа ГАМКB1е, обнаруженная у крысы и человека (Schwarz D.A. et al., 2000); изоформа ГАМКB1f, идентифицированная у крысы (Wei K. et al., 2000).
Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях ГАМК в комплекс пре-Бетцингера
При микроинъекциях в КПБ ГАМКВ-блокатора 2-гидроксисаклофена изменения почти всех параметров паттерна внешнего дыхания и ЭМГ инспи-раторных мышц принципиально отличались от эффектов баклофена. Одним из таких отличий явилось уменьшение длительности обеих фаз дыхательного цикла.
Из рис. 4.4.1 видно, что после микроинъекции 2-гидроксисалофена длительность инспирации уменьшалась, причем начиная с 10-й минуты, и стабильно сохранялась на этом уровне в течение всего последующего времени наблюдений. Уменьшение составляло в среднем 21,9% относительно исходной величины (p 0,05; парный test). В целом, вдох укорачивался с 269,42±21,48 мс в исходном состоянии до 210,18±29,16 мс на 40-й минуте после микроинъекции.
Длительность экспирации после введения 2-гидроксисаклофена в КПБ также уменьшалась, причём более выражено, чем фаза вдоха. Как видно из графика (рис. 4.4.1), латентный период развития статистически значимого увеличения экспирации был таким же, как в случае инспирации, т.е. составлял 10 минут. Если до инъекции антагониста длительность выдоха равнялась 709,27±59,69 мс, то на 10-й минуте она составила 554,16±67,87 мс (уменьшение на 21,9%; p 0,05; парный test), на 25-й минуте – 520,82±70,01 мс (уменьшение на 26,5%; p 0,05; test ANOVA), а на 60-й минуте вдох укорачивался до 506,24±67,12 мс, что соответствовало 28,6% (p 0,01; Dunnett sest) от исходного уровня. Следствием наблюдаемых преобразований фазовой структуры дыхательного цикла явилось увеличение ЧД, что особенно заметно проявилось, начиная с 10-й минуты после инъекции блокатора в КПБ.
Рис. 4.4.1. Изменение длительности вдоха (серые столбики) и выдоха (белые столбики) после микроинъекции 10-6 М раствора 2-гидроксисаклофена в КПБ. Обозначения: – p 0,05; – p 0,01 (достоверность отклонений от исходного уровня)
На рис. 4.4.2 (А и Б), видно, что ЧД на 10-й минуте воздействия антагониста увеличивалась от исходного значения 64,95±3,28 мин-1 до 79,11±5,10 мин-1 (на 21,8%; p 0,05; парный test). Максимальная реакция отмечалась на 60-й минуте, в это время ЧД увеличивалась до 83,83±4,95 мин-1, т.е. на 29,1% (p 0,01; test ANOVA) (рис. 4.4.2, А). Рис. 4.4.2. Изменение частоты дыхания (в % от исходного уровня) после микроинъекции 10-6 М раствора 2-гидроксисаклофена в КПБ (А) и оригинальные спирограммы (Б), зарегистрированные у крысы в разные сроки после микроинъекции. Обозначения: – p 0,05; – p 0,01 (достоверность отклонений от исходного уровня)
Оценивая изменения объёмных параметров паттерна внешнего дыхания, необходимо указать, что на фоне блокады ГАМКВ-рецепторов КПБ доминировали стимулирующие влияния на глубину дыхания и лёгочную вентиляцию в целом. Так, в изменениях ДО (рис. 4.4.3, А) прослеживалась выраженная тенденция к увеличению в пределах 26,0% (p 0,05; парный test). Эффект нарастал от 0,73±0,09 мл в начале наблюдений до 0,92±0,11 мл на 35-й минуте, после чего ослабевал.
Сопоставляя реакции дыхания на введение 2-гидроксисаклофена и бак-лофена в КПБ, следует отметить, что рост частоты и глубины дыхания, вызываемый блокадой ГАМКВ-рецепторов, был заметно более ощутим (больше на 10%), чем уменьшение этих параметров на фоне активации ГАМКВ-рецепторов. Такая выраженная смена тормозного эффекта на стимулирующий со всей очевидностью указывает на роль ГАМКВ-рецепторов области КПБ в регуляции амплитудных параметров паттерна внешнего дыхания и может быть связана с усилением суммарной активности инспираторных нейронов КПБ. Этому заключению хорошо соответствует картина изменений МОД.
В изменениях МОД после микроинъекции в КПБ 2-гидроксисаклофена реакция усиления развивалась с ещё более выраженной закономерностью (рис. 4.4.3, Б). МОД под влиянием ГАМКВ-антагониста увеличивался, достигая наибольших отклонений ближе к концу экспозиции в интервале с 40-й по 60-ю минуты. Прирост составлял 49,5% (p 0,001; парный test), что соответствовало увеличению абсолютных значений МОД в интервале от 47,21±12,75 мл/мин (исходный уровень) до 70,58±14,89 мл/мин (60-я минута экспозиции). То есть, за период наблюдений легочная вентиляция увеличивалась на 23,37 мл/мин, что обеспечивалось приростом как ЧД, так и ДО.
Рис. 4.4.3. Динамика абсолютных значений дыхательного объёма (А) и изменения (в %) минутного объёма дыхания (Б) после микроинъекции 10-6 М раствора 2-гидроксисаклофена в КПБ. Обозначения: - p 0,05; - p 0,01; - p 0,001 (достоверные отличия от исходной величины)
Представленный далее рис. 4.4.4 демонстрирует направленность отклонений амплитуды залповой активности инспираторных мышц, которые в целом были подобны изменениям ДО. Следует отметить, что амплитуда ЭМГ диафрагмы начинала значительно нарастать только после 45-й минуты. При этом амплитуда залпов диафрагмы максимально увеличивалась на 17,6% (p 0,05; парный test) по сравнению с исходным уровнем. Увеличение происходило в диапазоне от 1,42±0,05 отн. ед. в исходном состоянии до 1,67±0,09 отн. ед. на 60-й минуте после инъекции антагониста в КПБ (рис. 4.4.4, А).
Амплитуда залпов активности НММ при действии 2-гидроксисаклофена на КПБ характеризовалась более закономерной тенденцией увеличения, которая приобретала статистически значимый характер в течение последних 30 минут экспозиции (рис 4.4.4, Б). Максимальная реакция была зарегистрирована на 50-60-й минутах после введения вещества, при этом диапазон изменений составлял от 1,22±0,05 отн. ед. (исходный уровень) до 1,48±0,07 отн. ед. (конец экспозиции), что соответствовало 21,3% (p 0,05; test ANOVA).
Рис. 4.4.4. Изменение (в % от исходного уровня) амплитуды осцилля-ций биоэлектрической активности диафрагмы (А) и наружных межреберных мышц (Б) после микроинъекции 10-6 М раствора 2-гидроксисаклофена в КПБ. - p 0,05
Анализ экспериментальных данных показал, что при инъекциях ГАМКВ-блокатора в КПБ происходило уменьшение как ДЗ, так и МЗИ на ЭМГ обеих инспираторных мышц, что полностью соответствовало снижению продолжительности инспираторной и экспираторной фаз на спирограммах.
Следует отметить, что отклонения ДЗ на ЭМГ диафрагмы (рис. 4.4.5) достигали границ статистической значимости в интервале с 15-й по 60-ю минуты, при этом наибольшее уменьшение приходилось на 20-ю, 45-ю и 50-ю минуты после микроинъекции (30,6%; p 0,01; Tukey Test; 45-я минута). Длительность МЗИ на ЭМГ диафрагмы статистически значимо снижалась в период с 10-й по 50-ю минуты воздействия ГАМКВ-блокатора на КПБ с максимальным отклонением на 33,9% (p 0,001; Dunnett sest) на 15-20-й минутах. Иллюстрацией данного эффекта служат суммарные и интегрированные ЭМГ на рис. 4.4.5.
Изменения временных параметров биоэлектрической активности НММ в условиях блокады ГАМКB-рецепторов КПБ 2-гидроксисаклофеном представлены на рис. 4.4.6. Видно, что изменения ДЗ на ЭМГ НММ развивались в более узких временных границах, статистически значимо проявляясь только с 40-й минуты экспозиции. Наблюдаемое уменьшение ДЗ составляло в среднем 15,0% от исходного уровня (p 0,05; Dunnett sest).
Рис. 4.4.5. Изменение длительности залпов (серые столбики) и межзалповых интервалов (белые столбики) ЭМГ диафрагмы после микроинъекции 10-6 М раствора 2-гидроксисаклофена в КПБ. Справа - суммарные (1) и интегрированные (2) ЭМГ до (исх) и в разные сроки после микроинъекции. Обозначения: - p 0,05; - p 0,01; - p 0,001
Примерно в эти же сроки на ЭМГ НММ формировались сдвиги МЗИ, которые, как и залпы, укорачивались по мере действия фармакологического агента. Наглядным примером этих изменений служат нативные ЭМГ, приведенные на рис. 4.4.6. Кроме того, из гистограмм, представленных на данном рисунке, видно, что максимальная реакция НММ была смещена к концу экспозиции. Так, в исходном состоянии интервалы между залпами на ЭМГ НММ составляли 365,93±55,44 мс, а на 55-й минуте наблюдений — 252,50±79,76 мс, что соответствовало уменьшению на 30,9% (p 0,05; парный test).
Изменения внешнего дыхания и биоэлектрической активности дыхательных мышц при микроинъекциях 2-гидроксисаклофена в комплекс Бетцингера
Проведенный в ходе исследования анализ изменений паттерна внешнего дыхания и залповой активности инспираторных мышц при микроинъекциях ГАМК, баклофена, 2-гидроксисаклофена, мусцимола и бикукуллина в КБ и КПБ крыс со всей очевидностью свидетельствуют об участии ГАМКергиче-ских механизмов, в том числе ГАМКА- и ГАМКВ-рецепторов, в деятельности ДЦ у взрослых млекопитающих животных. Следует отметить, что участие ГАМК как тормозного медиатора в центральных механизмах регуляции дыхания у половозрелых животных обсуждалось в ряде экспериментальных работ, авторы которых наблюдали достаточно разнообразные и неоднозначные респираторные реакции как при непосредтсвенном воздействии данной ней-роактивной аминокислоты на структуры ДЦ (Bongianni F. et al., 2010; Ковалёв A.M. и др., 2011; Janczewski W.A. еt al., 2013), так и при её введении в мозговые желудочки (Александрова Н.П. и др., 2008).
В наших опытах показано, что характер реакций внешнего дыхания и инспираторных мышц у наркотизированных крыс в значительной мере определяется локализацией места и временем воздействия ГАМК на ДЦ. В частности, установлено, что наиболее выраженное тормозное влияние лиганда на дыхание формировалось при микроинъекциях в КПБ, тогда как в случае воздействия ГАМК на КБ доля тормозных реакций со стороны отдельных параметров паттерна дыхания и активности инспираторных мышц была меньше.
Важным является то, что при введении ГАМК в оба отдела ДЦ отмечалось угнетение ритмики дыхания, показателем чего служит уменьшение частоты дыхательных движений и частоты следования залповых инспираторных разрядов на ЭМГ диафрагмы и НММ. Обращает внимание, что наблюдаемое снижение ЧД обеспечивается за счет пролонгирования, хотя и в различной степени, обеих фаз дыхательного цикла, что вероятно связано с наличием ГАМК-рецепторов на экспираторных и инспираторных нейронах КБ и КПБ, где, согласно литературным данным, присутствуют два класса рецепторов – ГАМКА и ГАМКВ (Pierrefiche O. et al., 1998; Zhang W. et al., 2002). Однако следует подчеркнуть, что на фоне активации ГАМК-рецепторов КБ изменение фаз внешнего дыхания сочеталось с увеличеним как ДЗ, так и МЗИ электроактивности дыхательных мышц, тогда как в случае КПБ ДЗ удлинялись, а МЗИ укорачивались. На наш взгляд, такое различие реакций может быть связано с воздействием инъецируемой ГАМК на различно локализованные мишени на мембранах бульбоспинальных дыхательных нейронов, наличие которых в КБ и КПБ показано в работах Bianchi A.L. et al. (1995), Tian G.-F. et al. (1999).
Так, например, в отношении эндогенной ГАМК известно, что её влияние не ограничивается локальным постсинаптическим участком, поскольку за счет работы транспортеров, глиального экзоцитоза и спиловера ГАМК может высвобождаться во внесинаптическое пространство. Так как рецепторы ГАМК расположены на различных участках нейронов, то в зависимости от их локализации, субъединичной композиции и метаботропной (ГАМКВ) и ионо-тропной (ГАМКА) функции эффект внеклеточной ГАМК будет различным (Margeta-Mitrovic M. et al., 2001; Семьянов А.В., 2004; Vigot R. et al., 2006; Guetg N. et al., 2009).
Особо следует обратить внимание на то, что латентные периоды наблюдаемого в наших опытах угнетения ритмики дыхания и замедления активности инспираторных мышц в случае микроинъекций ГАМК в КПБ были короче, чем в случае КБ. Это может указывать на то, что представительство ионотропных ГАМКА-рецепторов, опосредующих быстрое торможение (Ess-rich C. еt al., 1998; Thomas P. et al., 2005; Калуев А.В., 2006-б; Janczewski W.A. еt al., 2013) и медленно действующих метаботропных ГАМКВ-рецепторов (Bormann J., 2000. Pin J.-Ph., Prezeau L., 2007; Wang Y. et al., 2010) в изучаемых областях ДЦ различается.
Оценивая изменения частоты дыхания при микроинъекциях ГАМК в КБ и КПБ, следует отметить, что каких-либо нарушений ритмики дыхания или его остановки у животных в наших экспериментах не наблюдалось. Однако в работах других авторов при введении ГАМК в некоторые отделы ДЦ, например в ядро одиночного пути, у наркотизированных крыс происходило не просто уменьшение частоты дыхания, но и появлялись признаки апнейзиса, т.е. задержки на вдохе (Тихомирова Л.Н., 2000; Тараканов И.А. и др., 2005), что, на наш взгляд, отчасти может быть связано с большими дозами вводимого в мозг лиганда.
Предположение о различной роли ГАМКергических механизмов КБ и КПБ нашло свое подтверждение в характере измений объёмных параметров внешнего дыхания и амплитуды залповых разрядов инспираторных мышц. Одной из особенностей действия экзогенной ГАМК на КБ в наших опытах оказалось увеличение дыхательного объёма в сочетании с ростом амплитуды электроактивности диафрагмы и НММ. Такой, на первый взгляд, необычный для тормозного медиатора эффект можно объяснить с позиций межмедиатор-ных взаимодействий, которые могут влиять на характер эффектов ГАМК в разных структурах ЦНС (Todd A.J. et al., 1996; Kullman D.M., 2000; Koizumi H. et al., 2013). Например, основываясь на литературных данных (Zhang W. et al., 2002), допустимо считать, что ГАМК, активируя оба класса рецепторов, блокирует тормозные глицинергические синапсы, локализованные на премо-торных нейронах КБ. Это приводит к облегчению передачи возбуждения из ДЦ к спинальным мотонейронам инспираторных мышц с последующим увеличением силы их сокращений и, таким образом, глубины дыхания.
При введении экзогенного медиатора в КБ снижение частоты дыхательных движений сочеталось с ростом амплитудных показателей спиро-грамм и ЭМГ диафрагмы и НММ. Указанный эффект можно связать с тем, что под влиянием ГАМК в области КБ угнетается активность экспираторных аугментных нейронов, направляющих обширные тормозные проекции к ин-спираторным и экспираторным бульбоспинальным нейронам продолговатого мозга (Ezure K. et al., 2003). В отличие от этого, введение ГАМК в КПБ способствовало не только угнетению ритмики дыхания, но и снижению его глубины и легочной вентиляции в целом.
