Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
1.1. Основные источники внесения микрофлоры в сперму жеребцов 8
1.2. Влияние условно патогенной микрофлоры на сперму 10
1.3. Пути снижения бактериальной загрязнённости спермы 14
1.4. Характеристика микрофлоры, выделяемой из спермы производителей 17
1.5. Чувствительность и устойчивость микроорганизмов к антибиотикам 21
1.6. Влияние условно патогенной микрофлоры на половую систему самок 24
1.7. Воздействие условно патогенной микрофлоры на половую систему производителей 31
1.8. Санация спермы 34
Глава II Материал и методика исследований 50
2.1. Методика получения, оценки, разбавления и подготовки спермы к замораживанию 51
2.2. Определение видового и количественного состава микроорганизмов, выделенных из спермы 53
2.3. Определение патогенности выделенных микроорганизмов...55
2.4. Изучение влияния антибиотиков на выживаемость сперматозоидов и общую микробную загрязнённость 57
2.5. Определение оплодотворяющей способности санированной спермы 56
Глава III. Результаты собственных исследовании...59
3.1. Определение общей микробной загрязнённости спермы жеребцов 59
3.2. Изучение видового состава микроорганизмов спермы жеребцов 60
3.3. Определение влияния различных антимикробных препаратов на качество спермы и микробную загрязнённость в процессе замораживания-оттаивания 71
3.4. Влияние полигена на выживаемость спермиев при различных способах хранения спермы 75
3.5. Влияние санации спермы полигеном на её общую микробную загрязнённость 81
3.6. Введение полигена на различных этапах подготовки спермы к замораживанию 85
3.7. Определение оплодотворяющей способности санированной спермы 90
3.8. Расчёт экономической эффективности применения полигена для санации спермы жеребца 92
Глава IV. Обсуждение результатов исследований...93
Выводы 99
Практические рекомендации 100
Библиографический список 101
Приложения 131
- Основные источники внесения микрофлоры в сперму жеребцов
- Пути снижения бактериальной загрязнённости спермы
- Методика получения, оценки, разбавления и подготовки спермы к замораживанию
- Определение общей микробной загрязнённости спермы жеребцов
Введение к работе
Метод искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, разработанный отечественными учёными, широко применяется в нашей стране во всех отраслях животноводства.
Основоположник искусственного осеменения И.И. Иванов видел в нём основной метод размножения сельскохозяйственных животных, дающий возможность наиболее рационально использовать ценных племенных производителей.
В настоящее время искусственное осеменение применяется как основной метод для получения большого количества приплода от высокоценных племенных производителей. Широкое использование лучших племенных производителей с целью скорейшего совершенствования пород является важной проблемой в зоотехнии.
Метод искусственного осеменения быстро распространился во всех странах мира, благодаря высокой экономической эффективности, которая обусловлена не только количеством доз спермы из одного эякулята, но и возможностью сохранения спермы вне организма при комнатной температуре, температуре О С и в замороженном состоянии.
Искусственное осеменение решает задачи массового улучшения
качеств животных и является ветеринарно-санитарным
мероприятием, которое способствует оздоровлению
животноводческих хозяйств от заразных заболеваний, передающихся при естественном спаривании животных.
Актуальность исследований:
В коневодстве при искусственном осеменении лошадей для санации спермы в течение некоторого периода времени применяли
препарат спермосан-3. В настоящее время этот препарат снят с производства, как не отвечающий современным требованиям по снижению роста и уничтожению микроорганизмов в сперме. Проблема санации спермы при искусственном осеменении лошадей в настоящее время очень актуальна.
Кроме того, известно, что постепенно снижается чувствительность микроорганизмов к антимикробным препаратам. Образуются устойчивые к антибиотикам штаммы микроорганизмов.
Поэтому изыскание более надёжных препаратов, которые не снижали бы выживаемость сперматозоидов и задерживали рост бактериальной микрофлоры, имеет важное практическое значение.
Цель и задачи: повышение эффективности искусственного осеменения кобыл за счёт увеличения оплодотворяем ости при осеменении санированной спермой, с применением препаратов ранее не используемых для санации спермы жеребцов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1 .Установление оптимальных дозировок антимикробных препаратов для санации спермы жеребцов (ампициллина, гентамицина, левомицетина, линкомицина, оксациллина, полигена, цефазолина, цефтриаксона, ципрофлоксацина, эритромицина), не оказывающих тоскического действия на спермин.
2.Определение санирующих свойств антимикробных препаратов в дозировках, не снижающих качественных показателей спермы. 3.Сравнение эффективности испытанных препаратов в оптимальных дозировках.
4.Изучение влияния введения антибактериальных препаратов на
различных технологических этапах подготовки спермы к
замораживанию.
5 .Установление оплодотворяющей способности
криоконсервированной спермы жеребцов, санированной полигеном.
Научная новизна:
Испытаны новые препараты для санации спермы жеребцов. Отработаны оптимальные дозировки введения этих препаратов в сперму жеребцов.
Установлено, что для санации спермы жеребцов достаточно вводить антимикробные препараты в дозировках в 5 раз ниже, чем для спермы других видов животных.
Выявлены различные результаты санации спермы, проведенной на различных технологических этапах подготовки её" к замораживанию. Рекомендован для применения препарат «Полиген» производства ЗАО «Мосагроген».
Теоретическая и практическая ценность работы.
Применение новых антимикробных препаратов, оказывающих бактериостатическое и бактерицидное действие на микроорганизмы, содержащиеся в сперме жеребцов, приводит к повышению эффективности искусственного осеменения за счет повышения выживаемости спермы. Вследствие этого, повышается процент оплодотворяемости при искусственном осеменении.
В результате выполненной работы был изучен видовой и количественный состав микрофлоры спермы жеребцов. Определена
чувствительность выделенных микроорганизмов к антибиотикам. Исследованы различные препараты для санации спермы жеребцов.
Впервые применён для санации спермы жеребцов препарат полиген. При осеменении кобыл спермой, санированной полигеном, существенно повысилась оплодотворяемость кобыл.
Апробация работы.
Материалы диссертации изложены на координационных совещаниях и научных конференциях во ВНИИ коневодства (2004-2005г.г.), научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов С.-Пб. ГАУ (2005 г.). По материалам диссертации опубликовано 9 статей.
Положения, выносимые на защиту:
Видовой состав микроорганизмов спермы жеребцов.
Влияние различных препаратов на микробную загрязнённость и качество спермы при замораживании-оттаивании.
Влияние полигена на выживаемость спермиев при различных способах хранения семени жеребцов.
Экономическая эффективность применения полигена для спермы жеребцов.
Основные источники внесения микрофлоры в сперму жеребцов
Микрофлора может попадать в сперму жеребцов из внешней среды, из различных органов и систем организма при наличии в них воспалительных процессов. При взятии спермы от жеребцов -производителей основными источниками загрязнения являются: воздух случного манежа, волосяной покров жеребца и кобылы, препуциальная полость жеребца и т.д. (34, 71, 87, 169, 170, 246, 260, 270, 278). Контаминация также возможна через лабораторную посуду и инструменты (33, 35, 96, 142, 143, 156, 192, 197, 239), при разбавлении, эквилибрации и фасовке спермы (123, 124, 271).
По данным Битюкова В.А. (1977), основное загрязнение спермы микроорганизмами происходит во время её разбавления.
В то же время, Бугров А.Д. с соавт. (2000) отмечает, что обсеменение спермы микроорганизмами происходит не только при замораживании, но и при её деконсервации на производственных участках осеменения животных, где вероятность контаминации ещё выше.
Значительное загрязнение спермы микроорганизмами наблюдается при замораживании и хранении её в форме гранул. С увеличением срока хранения спермы, замороженной в форме гранул, увеличивается её микробная загрязнённость (241). Наименьшая степень микробного загрязнения спермы наблюдается при замораживании и хранении в облицованных полиэтиленовых ампулах (27, 43).
Ерохиным А.С. (1986) установлено, что бактериальная загрязнённость спермы синегнойной палочкой зависит от очерёдности получения эякулятов. В первых эякулятах загрязнённость до 34%, во вторых - до 16%.
Среду для разбавления спермы жеребцов стерилизации не подвергают, так как при кипячении среды происходит инактивация и осаждение буферных компонентов разбавителя и желтка куриного яйца.
Микроорганизмы могут попадать в сперму при вялотекущих хронических воспалительных процессах мочеполовой системы производителей, не отражающихся явно на здоровье животного и клинически трудно распознаваемых. Обнаружение неспецифической микрофлоры в сперме, полученной с соблюдением санитарных правил, свидетельствует об угнетении механизмов местной защиты (иммунитета) даже при отсутствии воспалительных процессов. Причиной появления высокой концентрации банальной микрофлоры в сперме производителей может быть случка с самками, имеющими воспалительные процессы половой системы с высоким уровнем микробной обсеменённости (вульвовагинит, цервицит) (163). Также возможен занос микрофлоры в мочеполовую систему, а в дальнейшем и в сперму, гематогенным и лимфогенным путём при воспалительных процессах в различных органах и системах организма животного (48, 163, 180).
При определённых условиях возможна длительная персистенция патологической микрофлоры, в частности Pseudomonas aeruginosa на коже рук персонала, техников по искусственному осеменению (20, 125).
Общая микробная загрязнённость спермы зависит от ряда факторов, в основном от соблюдения санитарно-гигиенических условий при взятии и последующей её обработке. Несоблюдение санитарных правил приводит к повышению уровня бактериальной загрязнённости спермы (54, 55,139,169, 244,245).
Данные, приводимые рядом авторов по общей микробной загрязнённости спермы производителей различных видов сельскохозяйственных животных, неодинаковы. Они находятся в широком интервале от нескольких тысяч до 120 млн. микробных тел в 1 мл спермы (29, 32, 38, 87, 130, 132, 148, 171, 189, 191, 196, 200, 214, 250).
По данным Балашова Н.Г. с соавт. (1985), применение рекомендованных приёмов асептического взятия спермы (облучение манежа для взятия спермы бактерицидными лампами, чистка производителей, санация препуциальной полости, стерилизация лабораторной посуды и инструментов и т.д.) не обеспечивает получение свободной от микроорганизмов спермы.
Пути снижения бактериальной загрязнённости спермы
Микробную загрязнённость спермы производителей необходимо снижать на всех этапах: взятия спермы, технологической обработки, фасовки, замораживания. В связи с этим, были предложены некоторые зоогигиенические мероприятия по снижению бактериальной загрязнённости спермы:
1. Осаждение в воздухе манежа частиц пыли и микроорганизмов. Для этого пол и стены увлажняют кипячёной водой из пульверизатора. Облучение манежа перед взятием семени бактерицидными лампами (6, 34, 54).
По данным Варнавского А.Н. (1963), облучение манежа для взятия семени лампой ПРК-7 мощностью 1 кВт, с экспозицией 30 минут снижает микробную загрязнённость воздуха на 72,6% (при отсутствии в манеже производителей). При 45 мин. - на 88,7%, при 60 мин. - на 94,3%. Проветривание манежа, смачивание пола и пульверизация воды снижает микробную загрязнённость воздуха на 50%.
2. Значительно снижает микробную загрязнённость спермы проведение сухой или влажной чистки производителей непосредственно перед взятием спермы (88, 169). Piasecka-Serafin М (1974) рекомендует для снижения микробного загрязнения использовать при получении спермы от баранов-производителей специальные приспособления для защиты препуция.
3. Санация препуциальной полости йодинолом приводит к значительному снижению микробной загрязнённости спермы (1,2).
Рядом авторов была предложена санация препуция производителей 3%-ным раствором перекиси водорода, растворами фурациллина (1:5000), перманганата калия (1:5000), фуразолидона (1:10000) (79, 97, 105, 107, 108, 120, 159, 167, 207), биолюголя, ваготила, тримеразина (240). Предварительная обработка препуциальнои полости производителей перед взятием спермы растворами фурациллина (1:5000) или перманганата калия (1:5000) снижает бактериальную загрязнённость в 60-80 раз, что благоприятно сказывается на дальнейшем хранении спермы (127, 130).
Однако, по данным ряда учёных, обработка препуция нитрофурановыми препаратами не оказывает достаточного влияния на условно патогенные микроорганизмы. После санации препуция продолжали выделять: S. albus, Е. coli, Ps. aeruginosa, P. vulgaris (84, 159).
4. Автоклавирование искусственных вагин в течение 20 минут при 0,3-0,5 атмосфер и стерилизация металлических инструментов сухим жаром при температуре 160-180 С в течение 45 минут (50, 91, 103, 156) приводит к их полному обеззараживанию.
5. Применение одноразовых инструментов для расфасовки спермы предотвращает перенос микроорганизмов и инфекции от одного животного к другому, что, несомненно, снижает микробную контаминацию спермы и повышает оплодотворяемость (43, 247).
6. Разбавление спермы средой от 1:0,6 до 1:4 без добавления санирующих веществ также снижает общее количество микроорганизмов в среднем в два раза (16). Кроме того, микробная загрязнённость семени снижается при его хранении в жидком азоте при температуре -196С.
По данным Поспелова А.И. с соавт. (1973), микробы в сперме, хранимой при низких температурах, остаются жизнеспособными и при благоприятных условиях восстанавливают свои биологические свойства. Замораживание спермы несколько понижает её
микробную загрязнённость, но не является основным методом для снижения бактериальной контаминации. В посевах жидкого азота взятого из ёмкости, где хранится гранулированная сперма, выделили в большом количестве: стафилококки, сарцины, протей, кишечную палочку. Из споровых форм — сенную палочку и антракоид. Вследствие чего жидкий азот может являться дополнительным источником микробного загрязнения спермы.
Быстров А.А. (1968) считает, что глубокое замораживание спермы снижает общую микробную загрязнённость, но микрофлора полностью не погибает при хранении семени при температуре -196С. Микробное число исследуемой спермы от 300 тыс. до Змлн. 800 тыс. микробных тел в 1 мл.
По результатам исследований Куклина А.Д. (1973) охлаждение спермы до температуры жидкого азота недостаточно губительно действует на микрофлору. Так, после 18-месячного хранения спермы в жидком азоте, наблюдали уменьшение числа микробов всего лишь на 28,1%.
7. По результатам исследования ряда авторов, в том числе и зарубежных, эффективным средством для снижения микробной загрязнённости спермы перед осеменением или после него является санация матки самок бактерицидными препаратами. Санация матки повышает оплодотворяемость независимо от способа осеменения (30,31,117,166,173,200,224).
8. По данным Филатова А.В. с соавт. (2004), озонирование ГХЦ среды является эффективным способом санации спермы хряков-производителей и оказывает положительное влияние на воспроизводительные способности свиноматок.
9. Эффективным средством микробной деконтаминации семени является его санация антимикробными препаратами (264, 267).
Методика получения, оценки, разбавления и подготовки спермы к замораживанию
Проводили микробиологическое исследование нативной, свежеполученной разбавленной, замороженно - оттаянной спермы и разбавителя. Определяли общее количество бактерий, коли-титр, видовой состав микроорганизмов, наличие грибов. Пробы, предназначенные для бактериологического исследования, помещали с соблюдением правил асептики в стерильные флаконы и транспортировали в течение двух часов в лабораторию. В лаборатории, для определения общего микробного числа в 1мл спермы, готовили десятикратные разведения из проб. Для разведения применяли стерильный 0,9% физиологический раствор натрия хлорида.
Разбавленную сперму высевали на 2% мясопептонный агар с 1% глюкозы и 5% крови барана в чашках Петри (из расчета не менее трёх чашек на каждое разведение). Чашки с посевами помещали в термостат при температуре 37±0,5 С и инкубировали в течение 48 часов. Подсчет колоний, выросших на поверхности агара, и определение числа микробных тел в I см3 (микробное число) проводили по общепринятой методике. Количество колоний в 1 мл исследуемого материала выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ/мл).
Для определения коли-титра, разбавленную сперму в количестве 1 мл вносили в пробирку со средой Булира; посевы выдерживали в термостате при температуре 44-45 С в течение 24 часов. В результате осмотра пробирок устанавливали бродильный титр.
При наличии положительной реакции на бродильный титр проводили исследование на идентификацию кишечной палочки.
Для исследования на наличие грибов, чашки с высевами спермы на мясопептонном агаре после подсчета количества микробных тел оставляли при комнатной температуре на 8-10 суток в месте, удаленном от прямых солнечных лучей. По истечении этого срока, чашки с посевами проверяли на наличие в них роста грибов. Идентификацию выросших грибов проводили по "Методике микологического исследования и оценки спермы, применяемой при искусственном осеменении с/х животных", утвержденной ГУВ МСХ СССР 2.01.78 г.
Чашки с первичными посевами спермы, после учета числа выросших на них микроорганизмов, использовали для выделения чистых культур (изолятов) с последующей их идентификацией.
Изучали визуально морфологию колоний микроорганизмов, выросших на чашках с питательными средами: размер, форму, поверхность, цвет.
Из колоний, выросших на питательной среде, готовили мазки, окрашивали их по Граму, микроскопировали.
Для изучения ферментативных свойств микроорганизмов (биохимический метод, который является главным в установлении принадлежности культуры к определённому роду), проводили высев культур на специальные дифференциально - диагностические питательные среды.
Антибиотикочувствительность микроорганизмов определяли путём посева выделенной культуры на среду АГВ диско -диффузионным методом, с использованием стандартных наборов дисков с антибиотиками. Чашки с посевами инкубировали в термостате при температуре 37±0,5С в течение 24 часов. Учёт чувствительности культур к антибиотикам проводили по зоне задержки роста микроорганизмов.
Патогенность микроорганизмов определяли по гемолитическим, плазмокоагулирующим свойствам.
Гемолитические свойства - способность микроорганизмов гемолизировать эритроциты крови, определяли на чашках Петри с кровяным агаром. Для этого изолированную культуру микроорганизма высевали на поверхность мясопептонного агара, содержащего 5% крови. Посевы инкубировали при температуре 37±0,5 С в течение 48 часов. При наличии вокруг выросших колоний зон а или Р - гемолиза, реакцию считали положительной.
Плазмокоагуляция - способность патогенных микроорганизмов (преимущественно стафилококков) свертывать нитратную плазму крови кролика. Реакцию плазмокоагуляции проводили с использованием сухой стандартной плазмы кролика, в соответствии с общепринятой методикой исследований.
Определение общей микробной загрязнённости спермы жеребцов
Приступая к изучению вопроса санации спермы жеребцов, мы определили микробную загрязнённость спермы, получаемой с соблюдением санитарных требований. Данные по микробной загрязнённости спермы приведены в таблице 2,
Из таблицы 2 видно, что сперма, взятая согласно существующей инструкции (1969), содержит большое число микроорганизмов. Из 1 мл такой спермы выделено в среднем 30,2 тыс. микроорганизмов (с колебаниями в пределах от 1,2 до 300 тыс.). При коли-титре: от отрицательного (97,3% проб), до 0,1 (2,7% проб). При этом, в 1,8% случаев сперма контаминирована грибами. От общего числа эякулятов только 18, что составляет 16,4%, соответствуют установленным санитарным требованиям. Следовательно, существующий комплекс санитарных мероприятий не обеспечивает получения спермы с минимальной бактериальной загрязнённостью. Поэтому, для получения спермы, свободной от микроорганизмов, требуется введение непосредственно в среду для разбавления спермы новых санирующих веществ, с помощью которых будет возможно получение максимально большего числа эякулятов, соответствующих санитарным требованиям.
Заключение:
Бактериальная загрязнённость спермы большинства исследуемых жеребцов, полученной при соблюдении санитарных требований, выше санитарных норм.
Кроме общей микробной загрязнённости спермы, мы определили видовой состав микроорганизмов - контаминантов, встречающихся в сперме. Данные по видовому составу микроорганизмов, выделяемых из спермы каждого жеребца, представлены в таблице 3.
Из спермы жеребцов (табл. 3) были выделены следующие микроорганизмы: Aerococcus viridans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolitycus, Staphylococcus saprophyticus, Esherishia coli, Proteus vulgaris, Micrococcus sp., Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Burkholderia cepacia, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Enterobacter aerogenes, Citrobacter diversus, грибы рода Candida.
Кроме видового состава микрофлоры, мы определили, представители каких родов и семейств микроорганизмов наиболее часто встречаются в сперме жеребцов. Процентное содержание частоты высева и количественный диапазон встречаемых культур представлены в таблице 4.
Стафилококки обнаружены (табл.4) в сперме у 12 жеребцов (75%). Представители семейства Enterobactenaceae обнаружены в 24% проб, в сперме у 56% исследованных производителей. Стрептококки выделили из эякулятов 50% жеребцов. Псевдомонады выделены в 4% исследуемых проб. Из них один штамм Pseudomonas aeruginosa обладал гемолитическими свойствами. Дрожжеподобные грибы рода Candida выделены из эякулятов у двух жеребцов, в ассоциации с микроорганизмами. Микрококки были выделены в трёх эякулятах. Выделенные из эякулятов микроорганизмы чаще встречаются в ассоциациях (91,3%), чем в монокультурах (8,7%).
