Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Появление и развитие искусственного осеменения лошадей и других с/х животных 9
1.2. Развитие методов введения спермы при искусственном осеменении лошадей и других с/х животных 13
1.3. Влияние дозы вводимой спермы на зажеребляемость кобыл 16
1.4. Факторы, которые влияют на оплодотворяющую способность спермы жеребцов после замораживания - оттаивания 19
1.5. Методы замораживания спермы жеребцов 22
1.5.1. Методы замораживания спермы жеребцов с использованием центрифугирования 30
1.6. Методы замораживания спермы жеребцов в России 35
1.6.1. Технология замораживания спермы в больших объёмах (15-20мл).35
1.6.2. Технология замораживания спермы жеребцов объёмом 5-6мл с применением центрифугирования 36
1.6.3. Технология замораживания спермы жеребцов объёмом 5мл с применением диализа 39
Глава 2. Материал и методика исследований 42
2.1. Методика получения, оценки, разбавления и подготовки спермы к замораживанию 42
2.2. Сравнение разных технологий замораживания спермы 46
2.2.1. 1 этап - разбавление 47
2.2.2. 2 этап - удаление надосадочной жидкости 47
2.2.3. 3 этап-способы фасовки 47
2.3. Изучение морфологии сперматозоидов разных фракций центрифугата 48
технологиям 50
2.5. Испытание новых вариантов и технологических приёмов замораживания спермы в малых объёмах 51
2.6. Сравнение результативности разных объёмов в осеменении кобыл 53
Глава 3. Результаты собственных исследований 55
3.1. Сравнение разных технологий замораживания спермы жеребцов 55
3.1.1. 1 этап - разбавление 55
3.1.2. 2 этап - удаление надосадочной жидкости 59
3.1.3.3 этап - способы фасовки 63
3.2. Изучение морфологии сперматозоидов разных фракций спермы жеребцов после центрифугирования 67
3.3 Сравнение оплодотворяющей способности спермы, криоконсервированной по разным технологиям 74
3.4. Испытание новых вариантов и технологических приёмов замораживания спермы в малых объёмах 76
3.5. Сравнение результативности разных объёмов в осеменении кобыл 83
3.6. Сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов 85
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 89
Выводы 98
Практические рекомендации 100
Библиографический список 101
- Появление и развитие искусственного осеменения лошадей и других с/х животных
- Методика получения, оценки, разбавления и подготовки спермы к замораживанию
- Изучение морфологии сперматозоидов разных фракций спермы жеребцов после центрифугирования
- Сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов
Введение к работе
Замораживание спермы жеребцов-производителей с эффективностью можно использовать в селекционно-племенной работе. Причём этот эффект заключается не только в рациональном использовании генетического потенциала наиболее ценных животных. Большое значение этот метод приобретает в связи с тем, что ряд пород и линий находится под угрозой исчезновения.
В коневодстве метод замораживания позволяет создавать запасы спермы от ценных жеребцов, сохранять её десятки лет, транспортировать на любые расстояния и получать потомство даже после смерти производителей. Кроме того, открываются возможности обмена спермой жеребцов высокого класса с зарубежными странами.
Практическое применение замороженной спермы жеребцов невелико из-за нестабильности результатов, трудоёмкости и дороговизны метода. Кроме того, устойчивость к замораживанию спермы часто зависит от индивидуальных особенностей производителей и варьирует в больших пределах. Сперма отдельных жеребцов совершенно не выдерживает замораживания.
В нашей стране и за рубежом разработано несколько технологий по замораживанию спермы жеребцов.
Российские и зарубежные технологии замораживания спермы жеребцов при многих общих элементах, имеют и значительные различия. Основным таким отличием является объём дозы осеменения. Зарубежные исследователи пошли по пути, аналогичному осеменению крупного рогатого скота. Они рекомендуют проводить осеменение кобыл в миниобъёмах, но при этом уделяют большое внимание количеству подвижных сперматозоидов в дозе.
Российские учёные подходят к решению данного вопроса иначе. Учитывая, что для кобыл физиологичен большой объём спермы, как это происходит при естественной случке. Они рекомендуют проводить
5 осеменение в больших объёмах с меньшим количеством сперматозоидов в дозе.
Актуальность исследований:
В последние годы российские коневладельцы всё чаще стали использовать криоконсервированную сперму жеребцов, ввезённую из западных стран, и покупать дорогое оборудование для замораживания спермы. Это даёт возможность получить потомство от высококлассных жеребцов, находящихся в Европе или Америке, и замораживать сперму российских жеребцов по зарубежной технологии, в т.ч. и по Loomis Р., 1983. Это наиболее типичная технология замораживания спермы жеребцов, которая используется за рубежом. Кроме того, привлекает простота и удобство перевозки спермы в миниобъёмах (0,5 мл). Хранение такой спермы также не требует больших расходов дорогостоящего хладоагента.
В нашей стране, несмотря на разработку способов замораживания спермы в малых объёмах (5 мл), до сих пор широко используется метод криоконсервации в больших объёмах (20 мл). Этот метод хорошо зарекомендовал себя в практике в связи с простотой исполнения, недорогим оборудованием, получением стабильных результатов. Но его недостатком являются большие объёмы спермодоз, неудобные при хранении и перевозках, и затраты на дорогостоящий хладоагент. Актуален вопрос: в чём состоит суть различий в этих технологиях, и какая из них предпочтитетельнее с точки зрения результативности, простоты исполнения и экономии затрат.
Цель исследований:
С целью выявления наиболее эффективной технологии - провести сравнение трёх технологий замораживания спермы жеребцов (одной зарубежной и двух отечественных), а также изыскать возможность унификации технологии замораживания спермы в малых объёмах.
Задачи исследований:
Сравнить факторы и приёмы на этапах (разбавления, удаления надосадочной жидкости, способах фасовки) при использовании разных технологий замораживания спермы, позволяющие получить максимальную активность и выживаемость сперматозоидов после оттаивания.
Изучить морфологию сперматозоидов, находящихся в разных фракциях после центрифугирования спермы.
Сравнить оплодотворяющую способность спермы жеребцов, замороженной по разным технологиям (отечественной технологии Науменкова А.И., Романьковой Н.К., 1971 и зарубежной технологии Loomis Р., 1983).
Испытать новые варианты и технологические приёмы замораживания спермы в малых объёмах.
Выявить возможность уменьшения объёма дозы в отечественной технологии замораживания спермы жеребцов (Науменков А.И., Романькова Н.К., 1971).
Провести сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов.
Научная новизна:
Впервые было проведено сравнение отечественных и зарубежной технологии замораживания спермы по качественным показателям спермиев, по оплодотворяющей способности и экономической эффективности.
Впервые получены данные по морфологии спермиев различных фракций центрифугата.
Впервые выявлена взаимозаменяемость различных приёмов и разбавителей при использовании отечественной и зарубежной технологии.
Впервые проведён опыт осеменения кобыл разными по объёму дозами замороженной спермы 5-10мл и 20мл (по отечественной технологии Науменкова А.И., Романьковой Н.К., 1971).
Теоретическая и практическая ценность работы
При сравнительной оценке отечественных и зарубежной технологий замораживания спермы жеребцов выявлены отрицательные и положительные стороны этих технологий. Изучена морфология сперматозоидов, находящихся в разных фракциях центрифугата.
После сравнительного анализа экономической эффективности выявлены преимущества отечественных технологий замораживания спермы жеребцов.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на научной конференции во ВНИИ коневодства (2005г.), в Костанае (Казахстан, 2006г.), и Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов в РГСХА им. Костычева П.А. (2006г.). По материалам диссертации опубликовано 8 статей.
Положения, выносимые на защиту:
Качественные показатели спермы, оплодотворяющая способность и экономическая эффективность отечественных и зарубежной технологий замораживания спермы жеребцов.
Исследование морфологии сперматозоидов в осадке и надосадке после центрифугирования спермы.
Возможность взаимозамены различных приёмов и разбавителей в отечественной и зарубежной технологиях.
8 4. Объём осеменения разными дозами замороженной спермы в отечественной технологии.
Появление и развитие искусственного осеменения лошадей и других с/х животных
Согласно ранним источникам, лошадей начали искусственно осеменять задолго до всех остальных крупных домашних животных (87). В России ещё в конце XIX - начале ХХ-го века успешно применяли искусственное осеменение кобыл (29).
К концу XIX века появились первые сообщения из нескольких европейских стран о применении искусственного осеменения кобыл. В некоторых крупных американских конных заводах искусственное оплодотворение стало обычным делом. С успехом применяли искусственное осеменение в Англии Sullivan, Sir Blandel Maple. Во Франции, в конном заводе Жарди, искусственное оплодотворение было испытано в 1901 году.
Российский коннозаводчик Енишерлов Н.П. (1896) описал опыт искусственного оплодотворения кобыл с помощью шприца, изготовленного Швабе Г. в Москве. Из 3-х маток одна оказалось жерёбой (10). Разработкой метода искусственного осеменения сельскозяйственных животных впервые начал заниматься Иванов И.И. в конце XIX, начале XX столетия. Иванову И.И. (1900) принадлежит несомненный приоритет не только в практике применения искусственного осеменения в животноводстве, но и в теоретических открытиях по этому вопросу.
Иванов И.И. (1907) впервые получил телят и жеребят при осеменении коров и кобыл семенем, полученным из придатков семенников, которые хранили до 26 часов на льду. Несмотря на большое принципиальное значение работ Иванова И.И., относящихся к дореволюционному времени, период быстрого, научно обоснованного развития искусственного осеменения и внедрения этого метода в массовую практику животноводства наступил в советский период. В 1917-1927г.г. автор занимался искусственным осеменением лошадей и научными разработками в области сохранения и разбавления спермы, выяснял возможности искусственного осеменения других видов животных, кроме лошадей. В более ограниченных размерах развивали исследования Иванова И.И. зарубежные его последователи (И. Ямане в Японии, Дж. Хэммонд в Англии) (25).
Кудряшов С.А. (1930) описал следующий способ искусственного осеменения кобыл. Кобыле, пришедшей в охоту и приведённой на случной пункт, во влагалище особым прибором вставляется губка. Далее кобыла покрывается жеребцом. После этого губка вынимается, а впитавшаяся в неё сперма выжимается в посуду. Собранная таким образом сперма тут же используется для искусственного осеменения кобыл, приведённых на случной пункт (24).
Между первой и второй мировыми войнами искусственное осеменение интенсивно развивалось не только в Советском Союзе, но и в ряде центрально - европейских и балканских стран. После 1945 года применение метода искусственного осеменения стало уменьшаться параллельно со снижением использования лошади, как сельскохозяйственного животного.
В 1962 году было подсчитано, что всего в мире искусственным методом было осеменено 750 тыс. кобыл, из которых 80% были осеменены в Китае. В то же время, число коров, осеменённых искусственно, составило свыше 58 млн.
Искусственное осеменение замороженной спермой в коннозаводстве менее популярно, чем в скотоводстве, по ряду причин: 1. - Наблюдаются значительные колебания выживаемости сперматозоидов после замораживания и оттаивания у отдельно взятых жеребцов. 2. - Только 30% жеребцов имеют сперму, сохраняющую хорошую подвижность половых клеток после оттаивания. 3. - У кобыл в связи со значительными колебаниями продолжительности эструса и с тем, что взаимосвязь между ним и овуляцией менее точная, по сравнению с другими крупными домашними животными, необходим большой опыт в определении оптимального времени осеменения. Особенно это актуально при использовании замороженной спермы, которая может иметь короткий период выживаемости в половых путях кобылы. Результатом явилось то, что искусственное осеменение в коневодстве не получило столь широкого распространения и, соответственно, исследования по сохранению спермы жеребца отстали от уровня исследований в других отраслях животноводства (87).
В конце 1990-х годов применение искусственного осеменения криоконсервированной (замороженной) спермой утвердилось в разведении лошадей (за исключением чистокровной верховой породы) в Великобритании и Ирландии. Этот метод приобретает всё большую популярность у заводчиков в остальных европейских странах и в США, где сложилась торговля импортированной и экспортированной спермой.
В докладе о состоянии дел в сельском хозяйстве за 1996 год министр сельского хозяйства Великобритании сказал, что количество замороженной спермы, импортированной в страну, выросло больше, чем на 200% между 1993 и 1995 гг. Кроме того, число кобыл, осеменённых замороженной спермой высококлассных спортивных жеребцов (конкур и выездка) с континента и из США, возросло на 500% в 1994-1995 гг. Свыше 100 кобыл осеменены этой спермой в 2003 году.
С 1 октября 1995 года в Брюсселе было достигнуто соглашение по урегулированию торговли спермой жеребцов в рамках Европейского Союза, и появилась возможность продавать охлаждённую и замороженную сперму в пределах стран членов ЕС (94).
В настоящее время для достижения высоких показателей осеменения сельскохозяйственных животных необходимо проводить целый комплекс подготовительных мероприятий, включающих мониторинг состояния полового цикла самок с целью максимально точно определить сроки овуляции и вычислить оптимальный срок осеменения. В данной области перспективным направлением является «технология микрокапсулирования», которая развивается применительно к сперме сельскохозяйственных животных уже более 20 лет.
Методика получения, оценки, разбавления и подготовки спермы к замораживанию
Экспериментальные исследования по теме диссертации проведены в лаборатории физиологии размножения ВНИИ коневодства, Локотском конном заводе Брянской области, ООО «Русь» Липецкой области, Рязанском конном заводе и в отделе биологии воспроизводства института ВНИИГРЖ (г.Пушкин, Ленинградской области) в период с 2004 по 2006г.
В опытах была использована сперма жеребцов-производителей, содержащихся на экспериментальной конюшне ВНИИ коневодства и жеребца-производителя Локотского конного завода. Во время проведения экспериментальных исследований условия кормления, содержания и использования жеребцов-производителей соответствовали установленным нормам и требованиям.
Сперму от жеребцов брали два раза в неделю на искусственную вагину, в соответствии с «Инструкцией по искусственному осеменению кобыл» (1969). Жеребец делал садку на кобылу с выраженной половой охотой или на кобылу спокойного нрава с применением случной шлеи.
Обработку инструментов, лабораторной посуды, искусственных вагин проводили согласно санитарным требованиям. После получения спермы, каждый эякулят первоначально оценивали по следующим показателям: цвет, запах, объём, концентрация и подвижность сперматозоидов. Свежеполученную сперму исследовали под микроскопом при температуре 38С. Определяли количество сперматозоидов с активными прямолинейно поступательными движениями, с колебательными и манежными движениями, а также количество неподвижных. Подвижность сперматозоидов оценивали по десятибалльной шкале.
Концентрацию сперматозоидов определяли в счётной камере Горяева и по стандартам ВНИИК. Дальнейшую оценку проводили в процессе хранения спермы по времени выживаемости сперматозоидов в часах при температуре от 0 до +4С до прекращения прямолинейно-поступательного движения. При определении выживаемости сперматозоидов в часах брали время от начала наблюдения до момента установления единично подвижных сперматозоидов. Из полученной суммы вычитали половину времени между предпоследним и последним наблюдением.
Центрифугирование по отечественной технологии Фоминой Е.Л. (1988) проводили в режиме 1500 об/мин в течение 15 минут, а по зарубежной технологии Loomis Р. (1983) - в режиме 3000 об/мин в течение 7-8 минут.
Для разбавления по отечественным технологиям замораживания спермы (технология Науменкова А.И., Романьковой Н.К., 1971 и технология Фоминой Е.Л., 1988) использовали лактозо- хелато- цитратно-желточную среду (ЛХЦЖ) в соотношении объёмов 1:3. Состав среды представлен .
Для разбавления по зарубежной технологии замораживания спермы (технология Loomis Р., 1983) использовали два разбавителя: до центрифугирования (глюкозо-ЭДТА) и после центрифугирования (глюкозо-ЭДТА с лактозой) в соотношении объёмов 1:1. Состав сред представлен .
Замораживание спермы проводили по технологии Науменкова А.И., Романьковой Н.К., (1971) и упаковывали в алюминиевые тубы по 15-20мл, по технологии Фоминой Е.Л. (1988) - в алюминиевые тубы по 5мл, по технологиии Loomis Р. (1983) - в соломины по 0,5мл. Хранили замороженную сперму в жидком азоте при температуре -196С.
Изучение морфологии сперматозоидов разных фракций спермы жеребцов после центрифугирования
После поэтапного сравнения разных технологий замораживания спермы жеребцов, мы изучали морфологию различных фракций спермы в зависимости от технологической обработки. Это необходимо для того, чтобы выяснить, какого качества сперматозоиды находятся в осадке, которые мы в дальнейшем криоконсервируем, и какие сперматозоиды удаляются с надосадком по технологиям с центрифугированием. Данные по этим исследованиям представлены в таблице 11. Из таблицы 11 видно, что больше всего нормальных сперматозоидов содержится в нативной сперме и в сперме по отечественной технологии (Н.) (эта технология без центрифугирования). Процент нормальных сперматозоидов составил 67,1%, а патологических 32,9%). В зарубежной технологии по (L.) этот показатель составил 60%) нормальных сперматозоидов и 40% патологических. В сперме по отечественной технологии (Ф.) содержится 57,5%) нормальных и 42,5 % патологических.
В надосадке после подготовки по зарубежной технологии в сперме содержится больше нормальных сперматозоидов (64,3% ), чем в надосадке, ПОЛучеННОМ ПО Отечественной ТеХНОЛОГИИ (61,1%)).
После центрифугирования как в верхних, так и в нижних частях центрифугата появляется больший процент патологических сперматозоидов по сравнению с нативной спермой и спермой, замороженной по отечественной технологией (Н.). Качество спермы после оттаивания в зависимости от технологической обработки представлено. В технологиях с центрифугированием по (Ф.) и по (L.) количество патологических и нормальных сперматозоидов находится практически на одном уровне. Кроме влияния качества спермы в зависимости от технологической обработки, мы определили уровень и характер нарушений морфологии сперматозоидов по каждой технологии. 71 При анализе уровня и характера нарушений морфологии сперматозоидов выявлено (таблица 12), что нарушения чаще всего встречаютя в акросоме и хвостовой части. С применением центрифугирования по технологиям (Ф.) и (L.) процент этих нарушений возрастает.
В осадке центрифугированной спермы (у жеребца Малыша) по зарубежной технологии (L.) выявлено 66,2% нормальных сперматозоидов, а в надосадке 77,3%. Значит, в надосадке соответственно встречается меньше патологий, чем в осадке. В осадке спермы, замороженной по отечественной технологии (Ф.), у этого жеребца 59,1 % нормальных сперматозоидов, а в надосадке 67,4%. По отечественной технологии (Ф.) выбрасывается с надосадком на 2,8% нормальных сперматозоидов меньше, чем по зарубежной технологии (L.). В осадке центрифугированной спермы (у жеребца Нарзана) по зарубежной технологии (L.) выявлено 52,2%) нормальных сперматозоидов, а в надосадке 53,9%. В осадке по отечественной технологии (Ф.) у этого жеребца 57% нормальных сперматозоидов, а в надосадке 54,6% . При подготовке спермы по отечественной технологии (Н.) без применения центрифугирования не выявлено изменений в уровне и характере нарушений морфологии сперматозоидов по сравнению с нативной спермой. Как наглядно видно по рис.9, больше всего нормальных сперматозоидов в сперме, замороженной по отечественной технологии (Н.). В опыте 1 (у жеребца Малыша) нормальных сперматозоидов больше в сперме по зарубежной технологии (L.) Во 2-ом опыте (жеребец Нарзан) нормальных сперматозоидов больше в сперме по отечественной технологии (Ф.).
В отношении характера патологии больше всего нарушений обнаружено в акросоме и в хвосте. У жеребца Нарзана (опыт №2) спермиев с нарушениями в хвостовой части больше, чем у жеребца Малыша (опыт №1).
Сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов
Сравнительный анализ экономической эффективности разных технологий замораживания спермы жеребцов (одной зарубежной и двух отечественных) складывается из 3-х составляющих.
1. Потери спермодоз после центрифугирования спермы в разных технологиях.
2. Расход хладоагента для замораживания спермы по разным технологиям.
3. Стоимость дополнительного оборудования, необходимого для замораживания спермы по разным технологиям.
1. Потери спермодоз.
По зарубежной технологии (L.) удаляется 30% спермодоз ценного генетического материала (спермы). По отечественной технологии (Ф.) удаляется 3% спермодоз ценного генитического материала. По отечественной технологии (Н.) нет потерь спермы, т.к. эта технология не предусматривает центрифугирование. Таким образом, потери спермадоз по отечественным технологиям на 27-30% меньше, чем по зарубежной технологии.
2. Расход хладоагента.
По зарубежной технологии в среднем на одну дозу осеменения необходимо 5-6соломин, по отечественной технологии (Ф.) - 1 туба по 5мл, по отечественной технологии (Н.) - Ітуба по 15-20мл. По объёму 1 туба по 5 мл занимает такой же объём, как 5 соломин. Расход хладоагента в 4 раза больше по отечественной технологии (Н.), чем в зарубежной технологии и отечественной технологии по (Ф.). Уровень зажеребляемости кобыл по технологии (Н.) на 27% выше по сравнению с зарубежной технологией (L.) (таблица 13) и нет потерь спермы.
Это компенсирует затраты на расход хладоагента по отечественной технологии (Н.).
3. Стоимость дополнительного оборудования, необходимого для замораживания спермы по разным технологиям, представлена в таблице 17, без учёта затрат на основное оборудование, которое необходимо по всем трём технологиям.
Из данных таблицы 17 видно, что самой дешёвой технологией замораживания спермы жеребцов по стоимости дополнительного оборудования является отечественная технология, разработанная (Н.), т.к. эта технология замораживания спермы жеребцов не предусматривает центрифугирование и фасовку спермы в соломины (не требует затрат на дополнительное оборудование). По отечественной технологии (Ф.) из дополнительного оборудования необходима центрифуга. Отечественную центрифугу можно приобрести за 20 тыс. руб. ( По данным за 2005 год).
По зарубежной технологии (L.) из дополнительного оборудования необходима полуавтоматическая фасовочно-укупорочная система для замораживания спермы жеребцов, которая стоит 202 тыс. руб. (Автоматическая фасовочно-укупорочная система стоит 905 тыс. руб.). Стоимость зарубежной центрифуги -112тыс. руб. (По данным за 2007 год).
Затраты на дополнительное оборудование в отечественных технологиях в 15-300 раз меньше, чем в зарубежной технологии. Сравнительный анализ экономической эффективности показал, что отечественные технологии превосходят зарубежную по 3-м составляющим:
1.- потери спермодоз при использовании отечественных технологий на 27-30% меньше, чем в зарубежной технологии;
2.-расход хладоагента по отечественной технологии (Ф.) на уровне зарубежной технологии по (L.), но в 4 раза меньше, чем по технологии (Н.);
3.- стоимость дополнительного оборудования (отечественные технологии в 15 - 300 раз дешевле зарубежной).
