Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы. Окислительный статус и регуляция транскриптома при беременности 17
1.1 Окислительный статус клетки и организма 17
1.2 Окислительный статус при беременности 36
1.3 Проблемы системной биологии беременности 42
2 Организация и методы исследования 47
2.1 Организация исследования 47
2.2 Методы исследования 51
3 Результаты исследования 64
3.1 Разработка интерактивной схемы интерактома окислительного статуса клеток и внеклеточной жидкости человека 64
3.2 Исследование показателей окислительного статуса при физиологически протекающей беременности 67
3.3 Изучение окислительного статуса при дисфункциональных отклонениях течения беременности 74
3.4 Анализ транскриптома экстраэмбриональных тканей при дисфунциональных отклонениях беременности в первом и третьем триместрах 83
4 Обсуждение результатов исследования 90
4.1 Аналитически ценные регуляторные контуры про- и антиоксидантной систем, выявленные с помощью карты интерактома окислительного статуса человека 90
4.2 Особенности антиоксидантной и прооксидантной систем и их взаимоотношений на разных этапах физиологически протекающей беременности 98
4.3 Особенности окислительного статуса при дисфунциональных отклонениях течения беременности 105
4.4 Особенности регуляции транскриптома экстраэмбриональных тканей при дисфункциональных отклонениях беременности в первом и третьем триместрах 112
Выводы 116
Практические рекомендации 119
Список использованных источников 120
- Окислительный статус при беременности
- Исследование показателей окислительного статуса при физиологически протекающей беременности
- Анализ транскриптома экстраэмбриональных тканей при дисфунциональных отклонениях беременности в первом и третьем триместрах
- Особенности окислительного статуса при дисфунциональных отклонениях течения беременности
Окислительный статус при беременности
Эстрогеновые хиноны могут быть переведены в состояние радикалов. При условии одноэлектронного восстановления такие хиноны могут входить в циклические реакции, сопряженные с продукцией супероксид-аниона и семихинонов (Dinkova-Kostova A.T., Talalay P., 2010). Сходные процессы могут происходить с целым рядом веществ, в том числе широко используемым антиоксидантом терт-бутил-гидрохиноном (deStafney C.M. et al., 1986). Редокс-циклы характерны и для ионов железа - с окислением от +2 до +3 и +4 (и, наоборот, последующим восстановлением) (Olsson M.G. et al., 2010).
Клеточные (в т.ч. сигнальные) эффекты прооксидантов находятся в зависимости от времени полужизни конкретной активной формы кислорода или азота. Так, гидроксил-радикал - самый активный из АФК и АФА, в частности поэтому он не утилизируется известными сегодня ферментативными системами (Burton G.J., Jauniaux E., 2010) и вряд ли может играть контролируемую клеткой сигнальную роль. Супероксид-радикал способен преодолевать расстояния до 0.4 мкм, что делает его исключительно локальным, но потенциально контролируемым с точки зрения сигнализации, фактором (Myatt L., 2010). Резко отличные от гидроксил-радикала свойства имеют перекись водорода и пероксинитрит: время их полужизни относительно велико, они способен перемещаться на значительные расстояния (перекись способна преодолевать мембраны, а пероксинитрит -диффундировать до 5 мкм). Особенностью пероксинитрита является его способность нитрозилировать белки, что имеет сходные эффекты с фосфорилированием. Пероксинитрит и перекись, способная мигрировать через мембраны, таким образом, являются важными участником аутокринной регуляции ферментативной активности и работы клеточных каскадов (Myatt L., 2010). Моноксид азота способен диффундировать на расстояния до 100 мкм (Myatt L., 2010).
В связи с многогранностью эффектов АФК и АФА ни один из известных их типов не может рассматриваться только в аспекте окислительного стресса и исключительно негативных эффектов на функционирование клетки и организма. Если еще недавно активно велся поиск «центрального», «ключевого» продуктора свободных радикалов в клетке, а сама продукция активных форм кислорода и азота понималась как «необходимое зло», то ряд новейших экспериментальных данных позволяет взглянуть на функционирование окислительного статуса клетки совершенно иначе (Скулачев В.П., 2007; Bayir H., Kagan V.E., 2008; Freinbichler W. et al., 2011). Сегодня доказано, что продукторы активных формы кислорода и азота локализуются во всех компартментах клетки:
В митохондриях АФК продуцируются в основном комплексами I и III ЭТЦ (Hung T.H., Burton G.J., 2006), а также моноаминооксидазами MAOA и MAOB (Uniprot), -кетоглутаратдегидрогеназой OGDH, глицерин-3-фосфат дегидрогеназами (GPD1, GPD2), изоформой p66 SHC1 (Starkov A.A. et al., 2008).
В эндоплазматической сети АФК генерируются цитохромами P450, ферментами b5 (CYB5A, CYB5B) (Gross E. et al., 2006; Uniprot). Также в эндоплазматической сети локализована микросомальная монооксигеназная электрон-транспортная цепь (Lampe J. et al., 1984; Kapitulnik J., Strobel H.W., 1999), которая играет важную роль в АФК-опосредованной сигнализации и является значимым источником АФК (Bondy S.C. et al., 1994; Rashba-Step J. et al., 1994). Эндоплазматический ретикулум, играя значимую роль в фолдинге белка, непрерывно участвует в генерации АФК. Три фермента ЭР: P4HB, ERO1L и EROL1B, - являются ведущими в формировании дисульфидных связей при фолдинге белков (Tu B.P., Weissman J.S., 2004; Gross E. et al., 2006; UniProt). Реакции, катализируемые этими ферментами, включают перенос электронов и окисление остатков цистеина; сопряженный термодинамически выгодный перенос электронов на молекулярный кислород приводит к образованию значительных количеств АФК (Tu B.P., Weissman J.S., 2004; Gross E. et al., 2006).
В пероксисомах содержится группа ферментов, которые генерируют супероксид-анион, перекись водорода, или монооксид азота в качестве нормальных и сопряженных продуктов метаболизма (Antonenkov V.D. et al., 2010, Van Veldhoven P.P., 2010). Пероксисомальные оксигеназы катализируют окисление различных классов жирных кислот, пуринов, D- и L-аминокислот, полиаминов, а-гидрокси-кислот, передавая водород, извлеченный из соответствующего субстрата непосредственно на кислород, с образованием перекиси водорода. К АФК-продуцирующим ферментам пероксисом относятся, например, оксидаза D-аминокислот DAO (Kawazoe T. et al., 2006), оксидазы Ацил-КоА ACOX1, ACOX2 (Oaxaca-Castillo D. et al., 2007), саркозин-оксидаза PIPOX (IJlst L. et al., 2000), пероксисомальная спермин-оксидаза PAOX (Wang Y. et al., 2003), гликолатоксидазы (HAO1 и HAO2) (Jones J.M. et al., 2000; Murray M.S. et al., 2008). Активные формы азота и супероксид-анион продуцируются идуцибельной формой NO-синтазы (NOS2) (Stolz D.B. et al., 2002). Ксантиноксигеназа (XDH), участвующая в катаболизме пуринов, существует в двух функционально различных формах (дегидрогеназой и оксигеназой), при чем оксидазная форма в норме генерирует супероксид-анион и перекись водорода (Engerson T.D. et.al., 1987; Hung T.H., Burton G.J., 2006; Burton G.J., Jauniaux E., 2010). Ivashchenko O. и соавторы (2011) обнаружили, что продуцирующиеся в пероксисомах АФК нарушают окислительно-восстановительный баланс даже в митохондриях, т.е. пероксисомы могут выступать в качестве инициаторов интенсификации продукции митохондриальных АФК (Ivashchenko O. et al., 2011).
Исследование показателей окислительного статуса при физиологически протекающей беременности
Неразвивающаяся (замершая) беременность - феномен неотторжения погибшего плода в течение продолжительного времени. Группа E. Jauniaux E. и G. Burton (2003) показала, что при неразвивающейся беременности плацентарный кровоток устанавливается преждевременно и в центральной, а не периферической, части, как это происходит при физиологической гестации. В результате наблюдаются обширные повреждения трофобласта, вызванные окислительным стрессом. В этом же исследовании показано, что первичной причиной указанных нарушений является неправильная плацентация и, как следствие, недостаточная закупорка спиральных артерий (Jauniaux E. et al., 2003).
Одно из наиболее опасных осложнений беременности второго триместра - истинная угроза прерывания, или истмико-цервикальная недостаточность - патологическое состояние беременности, характеризующееся пассивным безболезненным расслаблением шейки матки без сокращения матки, кровотечением и выходом амниотической оболочки через расслабленную шейку (MeSH). Частота истинной угрозы прерывания беременности составляет порядка 10% от всех беременностей (Owen J., Mancuso M., 2012).
Истинная угроза прерывания беременности охарактеризована как исключительно гетерогенное состояние (Warren J.E., Silver R.M., 2009; Owen J., Mancuso M., 2012). Анатомические характеристики шейки матки коррелируют с риском преждевременных родов, но эта корреляция не абсолютна. Если в случае спонтанных абортов этиология, хоть и разная, но в принципе описана, то для истинной угрозы она неизвестна. Связано это с плохо изученной патофизиологией данного состояния, с тем, что оно далеко не всегда повторяется, если уже было в анамнезе, и с тем, что короткая шейка матки, будучи рисковым фактором, часто функционально состоятельна (Warren J.E., Silver R.M., 2009; Owen J., Mancuso M., 2012). Факторы, которые, как считается, делают вклад в развитие состояния истинной угрозы прерывания беременности, включают и генетические, и средовые: инфекции, воспаление, активность матки, аномальная имплантация, адаптация к средовым воздействиям на уровне клетки. Существуют убедительные данные о роли цитокиновой системы в наступлении преждевременных родов, что в целом указывает на роль иммунной системы и воспаления в развитии истинной угрозы прерывания беременности. (Warren J.E., Silver R.M., 2009; Owen J., Mancuso M., 2012).
Тяжелый гестоз (преэклампсия) – это осложнение беременности, характеризующееся комплексом симптомов, таких как гипертензия, протеинурия, и, в ряде случаев, отеки (MeSH). Обычно тяжелый гестоз диагностируется после 20-й недели беременности, а при нарушениях морфогенеза трофобласта симптомы проявляются даже раньше (MeSH; Walker J.J., 2000). Тяжелый гестоз развивается при беременности с частотой от 0.4 до 2.8 % в развитых странах и до 10 % в развивающихся (Borekc B. et al., 2006). В РФ этот показатель имел пиковые значения более 20 % в 2003 году, постепенно снижается, и в 2011 году составил 17,4 %. Хотя в индустриально развитых странах мира за последние десятилетия заметно упала частота материнской и детской заболеваемости и смертности как результат преэклампсии, она по-прежнему является основной причиной материнской и детской смертности (Авруцкая В.В. и др., 2007; Walker J.J., 2000; Tranquilli A.L., Landi B., 2010).
Более полувека назад было показано, что тяжелый гестоз сопровождается окислительным стрессом, хотя практически все это время появляются данные о том, что это мнение, возможно, не соответствует истине (Roberts J.M., Cooper D.W., 2001; Llurba E. et al., 2004). В большинстве работ описывается более интенсивная продукция метаболитов, являющихся продуктами взаимодействия биомолекул со свободными радикалами или активными формами кислорода или азота (Aris A. et al., 2009). При этом в отдельных работах часто изучается очень ограниченный круг соединений, и в результате в одних исследованиях в плаценте описывается повышенный уровень МДА (Aikgoz S. et al., 2006; Breki B. et al., 2006), а в других - не отличающиеся количества аддуктов МДА (Wiktor H., 2001; Hnat M.D. et al., 2005). В ряде исследований продемонстрировано, что в плацентах и (или) в крови при тяжелом гестозе понижена активность Sod, Gpx, тиоредоксина, тиоредоксинредуктаз (Llurba E. et al., 2004; Vanderlelie J. et al., 2008). Аналогично вопросу о принципиальном наличии окислительного стресса при тяжелом гестозе, некоторые авторы обнаруживают повышенные активности некоторых из перечисленных антиоксидантных факторов (Roland-Zejly L. et al., 2011; Miranda Guisado M.L. et al., 2012; Das B. et al., 2012). Изучение тяжелого гестоза осложняется не только его гетерогенностью, но и большим количеством противоречивых данных.
Таким образом, лишь для некоторых из наиболее социально значимых осложнений беременности установлены нарушения окислительного статуса. Как правило, в таких случаях данные фрагментарны и характеризуют изменения уровня отдельных показателей окислительного стресса или компонентов про- и антиоксидантной систем. В случае истмико-цервикальной недостаточности, впрочем, даже такие данные нами в литературе обнаружены не были. Тяжелый гестоз, в свою очередь, характеризуется значительным количеством противоречивых данных. Еще более важно то, что системное изучение окислительного статуса -включающее оценку состояния регуляторных контуров про- и антиоксидантной систем - ранее не проводилось, что объясняется только начавшимся изменением парадигмы окислительного статуса.
Анализ транскриптома экстраэмбриональных тканей при дисфунциональных отклонениях беременности в первом и третьем триместрах
Интерактомика сегодня стала инструментом, позволяющим объединять разрозненные экспериментальные данные о физиологии клетки на разных уровнях организации последней: от метаболома и до эпигенома. Так как интерактомика предоставляет данные об истинных функциональных связях между клеточными компонентами и об иерархии и структуре метаболических и сигнальных клеточных систем, ее использование может значительно упростить выбор маркеров для исследования функционирования организма с точки зрения системной биологии. Окислительный статус, будучи интегративной клеточной системой, является одной из мишеней интерактомики. Создание карт интерактома окислительного статуса необходимо для более полного изучения физиологии беременности, а также ее нарушений.
Карта интерактома окислительного статуса (Oxidative Status Interactome Map - OSIM) в рамках настоящего исследования была построена по принципу кристаллизации вокруг одного из центральных антиоксидантных транскрипционных факторов - NFE2L2. Интерактивная схема интерактома была построена в среде CellDesigner, для ее создания было проанализировано более 700 литературных источников, отобранных с помощью NCBI PubMed (рисунок 8, приложение 2). Рис. 8. Карта интерактома окислительного статуса человека версии 2.7
По результатам анализа схемы интерактома окислительного статуса человека и наиболее важных контуров регуляции про- и антиоксидантной систем были выбраны факторы, которые могут служить маркерами регуляции окислительного статуса на разных сроках гестации и при разных ее вариантах - физиологическом течении в первом, втором и третьем триместрах, спонтанном аборте и неразвивающейся беременности в первом триместре, истинной угрозе прерывания беременности во втором триместре и тяжелом гестозе в конце третьего триместра.
С помощью интерактивной карты интерактома окислительного статуса человека были отобраны компоненты окислительного статуса, анализ содержания которых в крови отражает состояние внутриклеточных сигнальных каскадов - благодаря секретируемости таких компонентов или их влиянию на клеточные процессы извне клетки. Для интегральной оценки взаимоотношений между про- и антиоксидантами был выбран хемилюминесцентный анализ с усилителем -люминолом - и индукцией перекисью водорода. Интегральный анализ выбран по причине того, что оценка изменения концентраций или состояния отдельных компонентов окислительного статуса (активности глутатионпероксидаз, супероксиддисмутаз, каталазы) не дает достаточной информации для характеристики общей эффективности работы адаптивных каскадов: индивидуальные нарушения работы ферментов могут быть скомпенсированы без изменения общего окислительного статуса (например, дисфункции глутатионпероксидаз могут быть компенсированы повышением активности пероксиредоксинов).
Для оценки возможного замыкания контура НАДФH-оксидаз, ксантиноксидазы и NF-kB в исследуемых группах, были выбраны мочевая кислота и гомоцистеин, как непосредственные активаторы данного контура. Также был рассчитан композитный показатель содержания в образце -среднеранговый индекс мочевой кислоты и гомоцистеина - МГК. МГК был использован для оценки относительной емкости плазмы по отношению к активации контура НАДФH-оксидаз, ксантиноксидазы и NF-kB.
Для оценки состояния контуров, в которых участвует тиоредоксин 1, функционирование которого чрезвычайно важно не только для окислительного статуса, но и клетки в целом, были проанализированы концентрации тиоредоксина 1 в крови. Аналитическая ценность тиоредоксина 1, помимо его вовлечения в ключевые клеточные сигнальные каскады, с практической точки зрения заключается в том, что данный фактор секретируется в кровь несколькими независимыми путями (Rubartelli et al., 1992).
Исследование показателей окислительного статуса при физиологически протекающей беременности При физиологически протекающей беременности ранее изучались отдельные показатели окислительного статуса, не позволяющие выявить особенности взаимоотношений и работы про- и антиоксидантов в процессе гестации. С помощью интерактомики окислительного статуса стал возможен анализ маркеров, характеризующих функционирование про- и антиоксидантных каскадов и результирующую их функционирования.
Нами было проведено изучение показателей, интегрально характеризующих состояние систем окислительного статуса, на разных этапах физиологически протекающей гестации (таблица 8). Все попарные сравнения являются результатом попарного тестирования по Коноверу после применения критерия Краскала-Уолиса.
Особенности окислительного статуса при дисфунциональных отклонениях течения беременности
Сегодня стало возможным применение новых методов изучения физиологии клетки в целом и окислительного статуса в частности, основанных на использовании методов полномасштабного профилирования одного из компонентных уровней клетки (в особенности - транскриптомики) и интерактомики - инструмента системной биологии клетки, интегрирующего экспериментальные данные омик - от метаболомики и до эпигеномики. В результате создания схемы интерактома окислительного статуса человека, были обнаружены несколько положительных и отрицательных контуров обратных связей, компоненты которых могут служить маркерами регуляции окислительного статуса на разных сроках гестации и при разных ее вариантах - физиологическом течении в первом, втором и третьем триместрах, спонтанном аборте и неразвивающейся беременности в первом триместре, истинной угрозе прерывания беременности во втором триместре и осложнении гестации в конце третьего триместра. С помощью выбранных компонент таких контуров были установлены уникальные кинетические характеристики взаимоотношений про- и антиоксидантной систем в начале, середине и в конце физиологически протекающей беременности. Нами была обнаружена активация антиоксидантной системы у обследованных с физиологическим течением гестации во втором триместре - относительно групп первого и третьего триместров. На основе данных об уровнях, динамике и связях мочевой кислоты и гомоцистеина с другими показателями окислительного статуса был сделан вывод о том, что замыкание высоко деструктивного контура NOX/XDH на исследованных сроках не происходит. Также установлено, что характер взаимоотношений между мочевой кислотой, гомоцистеином и общим окислительным статусом при беременности динамичен. Тиоредоксин 1 в значительной степени вовлечен в регуляцию окислительного статуса и выражено сам зависит от него при физиологическом течении беременности. Было установлено, что взаимосвязь между общим окислительным статусом и белковой экспрессией тиоредоксина 1 имеет специфику на разных сроках беременности. Были обнаружены индукторные эффекты мочевой кислоты на тиоредоксин 1 на начальных этапах беременности. Исходя из полученных данных, физиологически протекающая беременность характеризуется динамическим контролем окислительного статуса. На различных сроках, в зависимости от метаболических запросов системы мать-плацента-плод, роль отдельных защитных контуров изменяется. Это обусловлено достаточной специфичностью сенсорных компонентов окислительного статуса и его каскадов к метаболическому и сигнальному фону, сопровождающему беременность.
Физиологическое течение беременности характеризуется выраженной динамичностью окислительного статуса, в т.ч. в аспекте влияния отдельных регуляторных контуров на его формирование. Дисфункциональные нарушения беременности затрагивают на клеточном уровне значительное количество регуляторных каскадов, что отражается на состоянии контуров и общих характеристиках окислительного статуса. В то же время дисфункциональные нарушения могут помочь выявить значимые элементы или характеристики окислительного статуса, определяющие физиологическое течение беременности.
В первом т риме стре беременно сти было выявлено общее прооксидантное смещение окислительного статуса в группе сравнения 1 (что согласуется с литературными данными (Lash G.E. et al., 2008)), но не в группе сравнения 2. Более того, анализ индекса М/50 показал, что у женщин из группы сравнения 1 не наблюдается выраженного повышения интенсивности работы антиоксидантных систем, по сравнению с контролем и группой сравнения 2, т.е. характер их состояния окислительного статуса - это истинный окислительный стресс. Несмотря на значительные изменения в интенсивности окислительных процессов, при этом состоянии не наблюдалось адаптивной гиперактивации экспрессии тиоредоксина 1.
Исходя из полученных данных, окислительный статус группы сравнения 1 характеризуется окислительным стрессом, в основе которого лежит не гиперактивация высокодеструктивного контура NOX/XDH, а дисфункция антиоксидантных систем. При этом такая дисфункция сама по себе может объяснять отсутствие замыкания контура NOX/XDH, так как экспрессия 5 компонент комплекса NOX контролируется тремя ведущими антиоксидантными контурами - NFE2L2, AP1 и NF-kB (Manea A. et al., 2008; Pendyala S. et al., 2011).
Для группы сравнения 2 оказались нехарактерны значимые отклонения в общем окислительном статусе, но у этой группы имелись особенности работы его систем. Так, тиоредоксин 1 обнаруживал сильную положительную корреляцию с индексом М/50, что позволяет предположить ведущую роль тиоредоксин 1-зависимых контуров в работе антиоксидантной системы при данном состоянии. Хотя тиоредоксин 1 и является фактором, необходимым для работы ключевых адаптивных антиоксидантных систем, контролируемых AP1 и NFE2L2, наблюдаемая картина свидетельствует в пользу того, что другие антиоксидантные контуры (в первую очередь -PPARGC1A и NFE2L1), которые должны “страховать” основные адаптивные контуры, не делают достаточного вклада в окислительный статус при данном дисфункциональном нарушении беременности. Интересно, что хотя мочевая кислота и не обнаруживала выраженных отличий между контролем и группой сравнения 2, в последнем случае она сильно отрицательно коррелировала с тиоредоксином 1, а комплексный показатель содержания мочевой кислоты и гомоцистеина, МГК, сильно отрицательно коррелировал с индексом М/50. Эти данные указывают на инверсную корегуляцию общей антиоксидантной системы и обмена мочевой кислоты и гомоцистеина в группе сравнения
Похожие диссертации на Особенности окислительного статуса и регуляции транскриптома в процессе беременности
