Введение к работе
Актуальность проблемы. Программирование функций взрослого организма воздействиями в раннем онтогенезе в настоящее время не вызывает сомнения. Несмотря на то, что возможноаь длительных эффектов воздействий в критические периоды раннего развития была впервые продемонстрирована полвека назад (Levine, 1957), механизмы, их обеспечивающие, в полной мере не выяснены до сих пор. Вновь вспыхнувший интерес в данной области связан с появлением в последние годы значительного числа эпидемиологических доказательств, ясно свидетельствующих, что низкий вес новорожденных является сопутствующим признаком последующего развития ожирения, гипертонии, ишемической болезни сердца, сахарного диабета второго типа (Levitt et al., 2000; Barker, 2002; Ward et al., 2004b; Ward et al., 2004a; Phillips et al., 2005). Взаимосвязь между весом тела при рождении и развитием с возрастом различных отклонений обнаружена и в экспериментах на животных (Langley et al., 1994; Levitt et al., 1996; Lindsay et al., 1996b; O'Regan et al., 2001). Полученная аналогия свидетельствует о возможном сходстве механизмов, лежащих в основе выявленных патологий. Ключевая роль в программировании функций взрослого организма принадлежит стероидным гормонам. Если половые стероиды детерминируют развитие систем с выраженным половым диморфизмом (Угрюмов, 1989; McEwen et al., 1997; Шишкина, Дыгало, 1999), то гормоны надпочечников - глюкокортикоиды - обеспечивают координацию развития в конкретных условиях среды, регулируя экспрессию гормон-зависимых генов "и многие метаболические процессы организма (Дыгало, 1993; Welberg, Seckl, 2001; Weinstock, 2005; Kapoor et al., 2006; Seckl, Meaney, 2006). Сниженный вес тела новорожденных указывает на задержку их общего развития (Barker et al., 1990; Hales et al., 1991; Fall et al., 1995; Curhan etal., 1996), хорошо известную при избытке глюкокортикоидов (Meyer, 1985; Hochberg, 2002). В пре- и ранний постнатальный периоды онтогенеза плоды и новорожденные особенно подвержены действию эндогенных и экзогенных глюкокортикоидов. Причиной повышения эндогенных гормонов могут быть любые стрессирующие факторы, активирующие собственную или материнскую гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему (ГГНС). Кроме того, глюкокортикоиды используются в педиатрической практике для ускорения созревания сурфактанта в легких и предотвращения респираторного дистресс синдрома при угрозе преждевременных родов (NIH, 1994; Crowley, 1995), а после рождения - для терапии аутоиммунной гемолитической анемии, гипогликемии, травм ЦНС, менингита (Huang et al., 1999; Edwards, Burnham, 2001; Kapoor et al., 2006). Глюкокортикоидные гормоны достаточно свободно проникают через гематоэнцефалический барьер, и, следовательно, способны менять развитие и функционирование головного мозга. Известно, что стресс и его гормоны в раннем онтогенезе приводят к
долговременным изменениям поведения и нейроэндокринных функций, регулируемых норадреналином (Науменко et al., 1979; Peters, 1982; Дыгало, Науменко, 1983; Peters, 1984; Дыгало, 1986; Дыгало и др., 1986; Дыгало, Науменко, 1988; Matthews et al., 2001; Kreider et al., 2006). Исследование механизмов, определяющих состояние и функционирование медиаторных систем взрослого мозга после неблагоприятных воздействий в раннем онтогенезе, остается наименее изученным и, вместе с тем, наиболее важным аспектом проблемы. Обусловлено это ролью медиаторных систем мозга в регуляции функций. Так, норадренергическая система принимает непосредственное участие в регуляции многих физиологических систем - кардиоваскулярной, нейрозндокринной, различных форм поведения, включая стрессорные реакции, половое поведение, психоэмоциональные состояния депрессии и тревожности (Kable et al., 2000; Ressler, Nemeroff, 2000; Шишкина, Дыгало, 2002; Carson, Robertson, 2002; Berridge, Waterhcuse, 2003; Marien et al., 2004). Таким образом, актуальность проводимого исследования определяется необходимостью выявления неизвестного на сегодняшний день механизма гормональной модификации норадренергической медиаторной системы мозга в онтогенезе.
Глюкокортикоидные гормоны являются генетическими индукторами, регулирующими уровень генной активности. «Программирующие» эффекты глюкокортикоидов на норадренергическую систему головного мозга могут быть обусловлены неясным в настоящее время влиянием гормонов на экспрессию генов, обеспечивающих активность нейрохимической системы, а также генов, участвующих в процессах морфогенеза мозга в целом.
Формирование норадренергической медиаторной системы в мозге грызунов начинается с середины эмбрионального развития и завершается, в основном, к полуторамесячному возрасту (Раевский, 1991). В онтогенезе любой системы существуют периоды активного формирования, в течение которых темпы развития системы опережают происходящий в эти же сроки быстрый рост организма в целом. Однако до настоящего времени такие периоды в онтогенезе норадренергической системы мозга не определены. Вместе с тем, именно в сроки высокой активности специфических процессов развития система, согласно концепции Скотта, как правило, наиболее чувствительна к регуляторным факторам и внешним воздействиям и потому эти периоды могут быть "критическими" для ее онтогенеза (Scott et al., 1974). Возможное изменение уровня генной экспрессии в чувствительные периоды развития под действием глюкокортикоидов способно оказывать длительное и даже постоянное изменение функционирования норадренергической системы головного мозга.
Ключевому ферменту биосинтеза норадреналина - тирозингидроксилазе (ТГ) и адренергическим рецепторам альфа2А-подтипа (альфа2А-АР), регулирующим выброс медиатора в синаптическую щель, принадлежит определяющая роль в функционировании норадрєнергическои системы. В зрелом мозге активность ТГ позитивно, а экспрессия альфа2А-АР негативно соотносятся с уровнем активности норадренергических нейронов. Периоды установки внутрисистемной регуляторной взаимосвязи уровня биосинтеза, содержания норадреналина и его ауторецепторов в процессе развития остаются невыясненными и до последнего времени не выделялись в качестве предмета для самостоятельного направления исследований.
Изучение уровня экспрессии генов, определяющих активность норадрєнергическои системы и генов, участвующих в процессах морфогенеза мозга, в период быстрого формирования нейрохимической системы и установки внутрисистемных регуляторных связей, под действием глюкокортикоидов важно для понимания закономерностей регуляции онтогенеза и выяснения механизма ранних воздействий для функционирования взрослого организма. Изучение поставленных вопросов необходимо для поиска средств управления развитием медиаторной системы и связанных с нею функций.
Цель и задачи исследования. Основная цель проведенных исследований состояла в изучении механизма регуляции глюкокортикоидами онтогенеза норадрєнергическои системы мозга.
Для решения поставленной цели было необходимо:
Определить периоды наиболее активного формирования норадрєнергическои системы мозга и установки внутрисистемных регуляторных связей медиаторной системы в онтогенезе;
Изучить онтогенез норадрєнергическои системы мозга после введения глюкокортикоидов в критический период формирования нейрохимической системы;
Исследовать влияние глюкокортикоидов на уровень экспрессии генов, определяющих активность норадрєнергическои системы и генов, связанных с процессами морфогенеза мозга, в раннем онтогенезе;
Оценить возможный вклад наследственных особенностей животных в модифицирующее действие глюкокортикоидов в развивающемся мозге.
Научная новизна. В работе впервые установлено, что в основе длительного модифицирующего действия глюкокортикоидов на норадренергическую систему мозга находится изменение экспрессии генов, детерминирующих активность медиаторной системы, и генов, обеспечивающих процесс морфогенеза формирующегося мозга, в критический период раннего онтогенеза.
Впервые определены ранее неизвестные внутрисистемные закономерности развития норадренергической системы головного мозга. Обнаружены периоды наиболее активного формирования медиаторной системы в онтогенезе, которые приходятся у крыс на конец внутриутробного периода онтогенеза и четвертую неделю после рождения. В эти сроки онтогенеза темп роста показателя активности медиаторной системы, ключевого фермента синтеза норадреналина тирозингидроксилазы - превышает скорость развития мозга в целом, оцененную по увеличению содержания общего белка. В последнюю треть внутриутробного онтогенеза устанавливается регуляция альфа2А-адренорецепторами уровня норадреналина в мозге. Обратная регуляция медиатором экспрессии альфа2А-адренорецепторов не выявляется в головном мозге плодов и формируется в раннем постнатальном онтогенезе.
Исследован онтогенез норадренергической системы мозга крыс после повышения уровня глкжокортикоидов в пренатальный период активного формирования медиаторной системы. Показано, что введение кортикостерона самкам крыс линии Вистар на 16 и 18 дни беременности вызывает последовательные фазные изменения пресинаптических маркеров медиаторной системы в постнатальном онтогенезе: повышение активности тирозингидроксилазы и содержания дофамина и норадреналина в коре 7-дневных, активности фермента в коре 16-дневных, но снижение содержания норадреналина в коре 1б-дневных, дофамина в стволе 21-дневных и активности фермента в стволе 35-дневных крысят.
Впервые установлено активирующее действие глкжокортикоидов на экспрессию тирозингидроксилазы в развивающемся мозге крыс. Гормон увеличивал уровень мРНК и активность фермента в стволе головного мозга плодов. Изменение экспрессии тирозингидроксилазы под действием гормона проявляется только в определенный в работе критический для нейрохимической системы период пренатального онтогенеза. Активирующее влияние глюкокортикоидов на норадренергическую систему сопровождается угнетением общего развития и повреждающим действием гормона на развитие мозга, которое проявляется индукцией мРНК основного фермента апоптоза нейронов каспазы-3 и усилением фрагментации ДНК.
Впервые обнаружена зависимость интенсивности проявления стимулирующего и повреждающего действия гормона от наследственных особенностей животных, что предопределяет направление долговременных изменений норадренергической системы мозга после нарушения баланса глюкокортикоидов в раннем онтогенезе и обеспечивает угнетение, стимуляцию или отсутствие действия гормона на интенсивность биосинтеза и уровень медиатора в мозге плодов и взрослых
животных. Линия агрессивных серых крыс с преобладающим активирующим действием гормона на норадренергическую систему в раннем онтогенезе имеет повышенный уровень тирозингидроксилазы во взрослом мозге, в отличие от линии ручных серых крыс, у которых превалирует повреждающее действие глюкокортикоидов на развитие мозга и организма в целом.
Взаимодействие между противоположными - стимулирующим и повреждающим - эффектами глюкокортикоидов в критический период онтогенеза, в основе которых лежит изменение экспрессии генов, определяет активность норадренергической системы мозга и активность процессов морфогенеза мозга в целом, что обусловливает зависимое от генотипа итоговое направление развития мозга и нейрохимической системы, обеспечивая изменения в регуляции медиаторной системой функций взрослого организма.
Положения, выносимые на защиту.
В конце внутриутробного периода развития и четвертую неделю жизни темп формирования норадренергической системы опережает общий темп развития мозга. В последнюю треть внутриутробного онтогенеза формируются внутрисистемные регуляторные связи норадренергической медиаторной системы - экспрессия альфа2А-адренорецепторов начинает контролировать уровень норадреналина. Обратная регуляция медиатором экспрессии альфа2А-адренорецепторов не'выявляется в головном мозге плодов и устанавливается в раннем постнатальном онтогенезе.
Модифицирующее действие глюкокортикоидов на норадренергическую систему мозга определяется соотношением действия гормона на экспрессию генов, определяющих активность медиаторной системы, и генов, обеспечивающих процессы морфогенеза мозга, в чувствительный период раннего онтогенеза. Глюкокортикоиды повышают уровень мРНК и активность ключевого фермента биосинтеза норадреналина - тирозингидроксилазы в стволе головного мозга плодов. Изменение экспрессии тирозингидроксилазы под действием глюкокортикоидов происходит только в определенный в работе критический для нейрохимической системы период пренатального онтогенеза. Активирующее влияние на норадренергическую систему сопровождается угнетением общего развития и повреждающим действием глюкокортикоидов на развитие мозга, которое проявляется индукцией мРНК основного фермента апоптоза нейронов каспазы-3 и усилением фрагментации ДНК.
Интенсивность проявления повреждающего и стимулирующего эффектов гормона детерминирована генотипом животных. Соотношение стимулирующего
и повреждающего действия глюкокортикоидов в критический период онтогенеза, в основе которого лежит изменение уровня генной активности, определяет итоговое направление развития мозга и активность норадренергической системы, обеспечивая изменения в регуляции медиаторной системой функций взрослого организма.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные не только развивают необходимые теоретические представления о механизмах регуляции онтогенеза одной из основных нейрохимических систем головного мозга после повышения уровня глюкокортикоидных гормонов, что является обычным следствием действия стресса и(или) гормональной терапии, но и представляют определенное практическое значение в педиатрии и акушерстве. Использование глюкокортикоидов в перинатальной медицине при различных патологиях требует обоснования целесообразности их применения с учетом длительных изменений функционирования мозга. В случае неизбежности гормональной терапии необходима оценка и коррекция возможных неблагоприятных последствий, что будет способствовать поиску средств управления развитием медиаторной системы и связанных с нею функций.
Апробация работы. Материалы данной работы были доложены или представлены на 1-5 съездах физиологов Сибири (Новосибирск: 1986, 1995, 1997, 2002, Томск: 2005); 10 Всесоюзной конференции "Фундаментальные достижения нейрохимии медицине" (Горький, 1987); Всесоюзном совещании "Медиаторы и поведение" (Новосибирск, 1988); Международном совещании "Онтогенетические и генетико - эволюционные аспекты нейроэндокринной регуляции стресса" (Новосибирск, 1988); 3 школе по эволюции биосистем (Ленинград, 1989); 3 школе семинаре по генетики и селекции животных (Алтайский край, 1989); 5 Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1990); 7 симпозиуме "Катехоламины" (Амстердам, 1992); Международном симпозиуме "Физиологические и биохимические основы функций мозга" (Санкт-Петербург, 1994); Всероссийских конференциях "Нейроэндокринология" (Санкт-Петербург, 1995, 2005); б-ом симпозиуме «Катехоламины и стресс» (Братислава, 1995); 4 и б конгрессах IBRO (Киото, Япония, 1995; Прага, 2003); конференции "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций" (Санкт-Петербург, 1995); 1 и 2 конференциях «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 1997, 2002); Международном симпозиуме «Genetic and Developmental Psychoneuroendocrinology» (Novosibirsk, 1999); 7-ом Международном симпозиуме «Catecholamines and other neurotransmitters in stress» (Slovakia, 1999); VIII всероссийской конференции «Физиология нейротрансмиттеров» (Москва,
2000); 18 и 19 Съездах Физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004); Международной конференции "RNA as Therapeutic and genomics Target" (Novosibirsk, 2001); The 5-th Internationa! congress of Neuroendocrinology (Bristol, 2002); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, Россия, 2003); Международном симпозиуме «Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals» (Москва, 2003); Международной конференции «Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference» (Новосибирск, 2003); 33-м и 35 собрании общества нейронаук (Новый Орлеан, Вашингтон, США, 2003, 2005); конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005); Международной конференции "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, 2006), а также на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН 1988,1994, 1997, 2003, 2006 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 94 научные работы, из них статей - 36, в том числе в зарубежной печати - 12.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, результатов, обсуждения, заключения и списка литературы, который содержит 762 источника. Работа изложена на 240 страницах машинописного текста, включая 43 рисунка, 5 схем и 14 таблиц.
