Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ б
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. СТРОЕНИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ 11
1. 1. 1. Сенсорные нейроны 13
1. 1. 2. Модуляторные нейроны 16
1. 1. 3. Командные нейроны 18
1. 1. 4. Мотонейроны 21
1. 2. ФОРМЫ ПОВЕДЕНИЯ УЛИТКИ И ИХ НЕЙРОННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
1.2. 1. Формы поведения улитки 21
1. 2. 2. Обучение и память 25
1. 2. 3. Пластические изменения в отдельных нейронах 26
1. 2. 4. Морфологическая пластичность нейронов 29
1. 3. МЕДИАТОР-СПЕЦИФИЧНЫЕ НЕЙРОННЫЕ СИСТЕМЫ УЛИТКИ 31
1. 4. ОНТОГЕНЕЗ ЦНС УЛИТКИ
1.4. 1. Общие принципы формирования ЦНС в эмбриогенезе 39
1. 4. 2. Особенности формирования ЦНС моллюсков 40
1. 4. 3. Источник происхождения нейронов в ЦНС 41
1. 4. 4. Пионерные нейроны в онтогенезе и их возможная роль в развитии ЦНС..42
1. 4. 5. Развитие медиатор-специфичных систем нейронов в ЦНС 43
1. 4. 6. Развитие форм поведения в онтогенезе моллюсков 44
Глава 2 МЕТОДЫ
2. 1. ОБЪЕКТЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ 47
2. 2. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
2. 2. 1. Ретро- и антероградные прокраски нейронов 47
2. 2. 2. Изучение содержания металлов в нервной системе 49
2. 2. 3. Эмбриологические исследования 50
2. 2. 4. Неиммуноцитохимическое выявление моноаминов 51
2. 2. 5. Иммуноцитохимические методы 53
2. 2. 6. Метод гибридизации in situ 54
2. 2. 7. Электронно-микроскопические исследования 56
РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 3 ОНТОГЕНЕЗ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ
3. 1. ФОРМИРОВАНИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ Helix В ОНТОГЕНЕЗЕ 58
3.2. РАЗВИТИЕ ПРОЦЕРЕБРУМА 64
Глава 4 МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ В СИСТЕМЕ КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ УЛИТКИ
4. 1. РОЛЬ МОДУЛЯТОРНЫХ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНОВ В
ОБОРОНИТЕЛЬНОМ ПОВЕДЕНИИ УЛИТКИ 69
4. 2. МОРФОЛОГИЯ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ И ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ
НЕЙРОНОВ В ЦНС ВЗРОСЛЫХ ЖИВОТНЫХ 70
4. 3. ПРОЕКЦИИ НЕЙРОНОВ ПЕДАЛЬНЫХ ГАНГЛИЕВ 75
4. 4. ПРИНЦИП ДЕЛЕГИРОВАНИЯ 79
4. 5. ФОРМИРОВАНИЕ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ И ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ
НЕЙРОНОВ И ИХ ПРОЕКЦИЙ В ОНТОГЕНЕЗЕ 85
4. 6. ЮВЕНИЛЬНАЯ НЕРВНАЯ СИСТЕМА: МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА
ВОЗРАСТНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОВЕДЕНИЯ 89
Глава 5 ГАМК-ергическая СИСТЕМА НЕЙРОНОВ УЛИТКИ
5. 1. МОРФОЛОГИЯ ГАМК-ергической СИСТЕМЫ В ЦНС ВЗРОСЛЫХ УЛИТОК... 100
5. 2. РАЗВИТИЕ ГАМК-ергической СИСТЕМЫ В ОНТОГЕНЕЗЕ 104
5. 3. РОЛЬ ГАМК-ергических НЕЙРОНОВ В ПОВЕДЕНИИ 114
Глава 6 НЕИРОПЕПТИДЫ С ПОСТОЯННЫМ ТИПОМ ЭКСПРЕССИИ В ЦНС УЛИТКИ
6. 1. НЕЙРОНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИНСУЛИН-ПОДОБНЫЕ ПЕПТИДЫ 116
6. 2. ПЕДАЛЬНЫЙ ПЕПТИД И FMRFaMHfl 127
Глава 7 НЕИРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ МОЛЛЮСКОВ
7. 1. ЭКСПРЕССИЯ НЕЙРОПЕПТИДОВ СЕМЕЙСТВА CNP В ЦНС Helix 134
7. 2. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОДУКТОВ ГЕНА
HCS2 В КОМАНДНЫХ НЕЙРОНАХ УЛИТКИ Helix 147
7. 3. НЕИРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP В СЕНСОРНЫХ НЕЙРОНАХ Helix
1.3. 1. Проекции первично-сенсорных нейронов щупалец 154
7. 3. 2. CNP нейропептиды в первично-сенсорных нейронах щупалец 161
7. 4. НЕИРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У ДРУГИХ МОЛЛЮСКОВ
7. 4. 1. Нейропептиды семейства CNP в ЦНС Aplysia 165
7. 4. 2. Нейропептиды семейства CNP в ЦНС Lymnaea 168
Глава 8 НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У НАСЕКОМЫХ
8. 1. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP В ЦНС Drosophila 170
8. 2. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP В ЦНС СВЕРЧКА, ПЧЕЛЫ, ТАРАКАНА,
КОМАРА 179
Глава 9 НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У КОЛЬЧАТЫХ ЧЕРВЕЙ
9. 1. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У ДОЖДЕВОГО ЧЕРВЯ Lumbricus 186
9. 2. НЕЙРОПЕПТИДЫ СЕМЕЙСТВА CNP У ПИЯВКИ Hirudo 195
Глава 10 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
10. 1. РАЗВИТИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ 199
10. 2. КЛАССИЧЕСКИЕ МЕДИАТОРЫ
10. 2. 1. Роль серотонинергических нейронов в оборонительном поведении. Основа
возрастных особенностей поведения. Делегирование и дублирование 201
10. 2. 2. ГАМКергическая система нейронов: развитие и роль в поведении 208
10. 3. ПЕПТИДНЫЕ МЕДИАТОРЫ
10. 3. 1. Методы выявления нейронов: иммуноцитохимия - выявление наличного
медиатора и РНК-гибридизация - выявление синтезируемого медиатора 210
10. 3. 2. Нейроны, содержащие инсулин моллюсков 213
10. 3. 3. Нейропептиды семейства CNP у виноградной улитки 218
10. 3. 4. Морфологические основы функции обонятельного анализатора улитки и
роль CNP нейропептидов 226
10. 3. 5. Нейропептиды семейства CNP у насекомых 230
10. 3. 6. Нейропептиды семейства CNP у кольчатых червей 233
10. 3. 7. Классические медиаторы и нейропептиды 237
10. 3. 8. Колокализация нейропептидов 238
10. 4. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФУНКЦИЙ НЕЙРОНОВ
10. 4. 1. Сетевое или объемное проведение? 239
10. 4. 2. Ограничения морфологического подхода 243
10. 4. 3. Идентифицированные и идентифицируемые нейроны 245
10. 4. 4. Сома и отросток: две единые, но разные части нейрона 249
10. 4. 5. Существует ли соматотолия? 250
10. 4. 6. Связан ли медиатор с определенной функцией и морфологией? Связана ли межвидовая консервативность неиропептидов с консервативностью их
функций? 251
ВЫВОДЫ 257
СПИСОК СТАТЕЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 258
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 261
Введение к работе
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОРФОЛОГИЯ МЕДИАТОР-СПЕЦИФИЧНЫХ СИСТЕМ НЕЙРОНОВ
Работа нервной системы основана на реализации имеющихся морфологических связей и на их изменении при обучении и в развитии. Для понимания того, как работают нейроны - системы нейронов — мозг, как организовано поведение, морфофункциональный подход является не только актуальным, но и необходимым. Для установления связи между морфологией и функцией необходимо выявить и идентифицировать нервные элементы или их ансамбли.
Естественно, что многие вопросы, имеющие общее значение в физиологии, могут быть особенно успешно решены на «простых» нервных системах моллюсков, насекомых, червей. Особенностью так называемых простых нервных систем, на которых выполнено данное исследование, является наличие ограниченного числа нейронов, причем нейронов идентифицируемых, т.е. обладающих индивидуальными морфологическими и физиологическими свойствами и, в силу этого, узнаваемых в эксперименте. Рекордсменом среди нейронов является нейрон R2 Aplysia, имеющий размер до 1000 микрон. Но и другие нейроны обладают часто крупными размерами. Самые крупные нейроны виноградной улитки имеют размер сомы до 250 микрон, что почти в 10 раз превышает размеры наиболее крупных нейронов позвоночных. Система гигантских тел нейронов или гигантских волокон существует у многих беспозвоночных животных: гигантские аксоны кальмаров, ракообразных и кольчатых червей, гигантские сомы нейронов гастропод. Интересно, что функция этих «гигантов» часто идентична: запуск быстрой реакции отдергивания в ответ на нанесение опасного стимула.
Основой для идентификации служат три подхода. Во-первых, морфологический: характерное положение и размер сомы, тип ветвления отростков и органы, где заканчиваются отростки. Во-вторых, электрический: тип активности, частота импульсаций или ее отсутствие, определенные тормозные и возбуждающие связи с другими нейронами. В-третьих, нейрохимический: определенный тип классического медиатора или нейропептида (нейропептидов). В совокупности, эти особенности нейронов придают им уникальность и определяют их роль в поведении животного. Классификация нейронов по наличному нейроактивному веществу приводит к понятию медиатор-специфичных систем нейронов. Таких систем описано к настоящему времени много (серотонинергические нейроны, ГАМКергические нейроны и т.д.). Анализ
7 экспрессии различных генов в нервных системах беспозвоночных выявляет все новые системы нейронов, объединенные наличием в них различных нейропептидов (Bogdanov et al 1996; Balaban et al 2001). Зачастую, экспрессия определенного гена выявляет единство среди на первый взгляд мало связанных групп и отдельных нейронов. Однако, по-видимому, единство медиатора в разнородных клетках не является случайным фактором, и нейроны в такой системе могут играть общую роль или набор ролей в целостном поведении животного (McCormick et al 1999). Поэтому принято говорить о роли медиатора в поведении. Яркий пример такого рода — серотонин в нервной системе моллюсков (Сахаров 1990; Дьяконова 2007). Хотя по мере накопления знаний в этой области картина все усложняется, медиатор-специфичные системы нейронов по-прежнему являются вполне обособленной единицей в работе нервной системы. Некоторые из этих систем представляют собой единое целое по локализации, морфологии, поведенческой роли (как нейроны, содержащие инсулин-подобные пептиды у Lymnaea - см. van Heumen, Roubos 1990). Другие подразделяются, в свою очередь, на локальные группы (компартменты), как серотонинергические нейроны Helix (Балабан, Захаров 1992). При этом отдельные компартменты одной медиатор-специфичной системы имеют разные соматотопические организации проекций и участвуют в разных формах поведения.
Развитие в онтогенезе многих (но далеко не всех) медиатор-специфичных систем нейронов моллюсков было исследовано (Voronezhskaya, Elekes 1993; Elekes et al 1996; Croll et al 1999). Как правило, для их развития характерны определенные закономерности, отличающие их от других аналогичных систем нейронов (сроки и темпы развития, преимущественное развитие отдельных кластеров). Возрастные изменения внутри этих систем, как правило, не заканчиваются в эмбриогенезе и могут лежать в основе меняющегося с возрастом поведения животного (Marois, Carew 1997; Marois, Croll 1992). Система нейронов может меняться морфологически и в процессе обучения (Alvarez, Sabatini 2007).
Для нервных систем беспозвоночных весьма характерно численное преобладание нейронов, содержащих нейропептид (нейропептиды) над нейронами, содержащими какой-либо классический медиатор. Так, например РМИРамид-содержащих нейронов в ЦНС улитки Helix выявлено около 1100 (Elekes, Nassel 1990), педальный пептид-содержащих нейронов - около 1300 (Pavlova, Willows 2005), а серотонинергических нейронов - всего около 250 (Hernadi et al 1989). Для большинства выявленных в ЦНС беспозвоночных нейропептидов не доказано, что они являются медиаторами, то есть непосредственно выделяются в синапсе. Напротив, показано, например, для Drosophila, что подавляющее большинство ее нейропептидов выделяется внесинаптически (Santos et al 2007). Однако,
8 внесинаптическое выделение нейроактивных веществ вообще типично для беспозвоночных. Оно существует в различных видах: выделение веществ из сомы, из варикозностей на отростках и т.д. (Noel, Mains 1991; Szapiro, Barbour 2007). Внесинаптическое выделение вещества из конкретного нейрона может сочетаться с его синаптическим выделением (De-Miguel, Trueta 2005). Поэтому внесинаптическое выделение веществ, особенно если это - единственный способ выделения для данного вещества или данного класса нейронов, не может считаться в настоящее время критерием того, что вещество не является медиатором.
До настоящего времени большинство нейрофизиологических работ делается при явном или неявном признании теории синаптической организации нейронных сетей ("wiring transmission"), у истоков которой стоял Рамон-и-Кахал. Идея Гольджи о диффузной нервной сети (непрерывность межнейронных связей) получает все большее признание по мере накопления знаний (Zoli, Agnati 1996). Взаимодействие нейронов помимо их синаптических связей многообразно (Agnati et al 2006). Кроме электрических и химических сетевых сигналов между нейронами существуют и электрические связи через посредство экстраклеточных полей и передача химического сигнала с нейрона на нейрон, в той или иной степени минуя синапс ('volume transmission"). Эти два внешне альтернативных, а на самом деле - взаимодополняющих способа регуляции вносят свой вклад, величина которого зависит от конкретной ситуации.
По мере накопления знаний о тех ролях, которые играют нейроактивные вещества, ситуация становится все менее описываемой: ни про одно вещество нельзя сказать, что оно участвует только в данном типе поведения или хотя бы взаимодействует только с данным типом рецепторов, как и ни про одну функцию нельзя сказать, что она зависит только от данного медиатора (Brezina, Weiss 1997). Функционально-морфологические исследования могут, тем не менее, несколько прояснить ситуацию: выявить единство разнородных клеточных элементов по их медиаторности, определить тип нейронов, экспрессирующий данное вещество, обнаружить закономерности в регуляции экспрессии данного вещества. Эта область пока изучена явно недостаточно, мало описаны изменения в экспрессии медиаторов (включая нейропептиды), вызванные возрастными изменениями или функциональными регуляциями.
Вопросам, связанным с закономерностями в возрастной и функциональной экспрессии некоторых нейроактивных веществ, и посвящена данная работа. В работе исследовано развитие нервной системы улитки в онтогенезе и становление в ней некоторых медиаторных систем. Исследована роль проекций нейронов в реализации ими своих функций. Рассмотрен вопрос о том, где и как экспрессированы нейропептиды в
9 нервной системе беспозвоночных. Сравнительное распределение нейропептидов исследовано на ряде моллюсков, червях (пиявка, дождевой червь) и некоторых насекомых.
Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было исследование развития медиатор-специфичных систем нейронов беспозвоночных животных в сопоставлении с поведением и изучение общих морфологических особенностей строения и функциональной регуляции экспрессии пептидергических систем нейронов у различных беспозвоночных. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:
Изучить развитие ЦНС улитки Helix в онтогенезе.
Исследовать в ЦНС взрослых и ювенильных улиток Helix распределение ссротонин - и дофаминсодержащих нейронов. Исследовать проекции серотонинергических модуляторных нейронов педальных ганглиев у взрослых и ювенильных животных. Выяснить, какие морфологические особенности серотонинергических нейронов в ювенильной ЦНС могут лежать в основе наблюдаемых возрастных отличий поведения.
Изучить онтогенетическое развитие ГАМКергических нейронов улитки Helix и исследовать их роль в поведении.
Провести сравнительное исследование регуляции синтеза нескольких нейропептидов в ЦНС улитки Helix (нейропептиды семейства CNP, педальный пептид, FMRFaMim). Изучить в ЦНС беспозвоночных, принадлежащих к различным типам (моллюски, насекомые, кольчатые черви) строение системы нейронов, содержащих нейропептиды семейства CNP, и исследовать возрастные и функциональные изменения в этой системе. Исследовать особенности проекций различных типов первично-сенсорных нейронов в щупальцах улитки Helix в связи с их медиаторностью. Изучить морфологические основы функций нейронов, содержащих инсулин-подобные пептиды, в ЦНС улитки Helix.
Научная новизна работы.
Впервые описано развитие нервной системы улитки Helix в онтогенезе и составлена шкала стадий развития.
Впервые показано, что влияние целой группы модуляторных серотонинергических нейронов на командные нейроны оборонительного поведения осуществляется через посредство одного нейрона (Пд4). Выяснено, что в основе возрастных особенностей поведения у ювенильных животных лежит отставание в
ю развитии серотонинергических модуляторных нейронов (меньшее число и меньшие относительные размеры нейронов).
Впервые описано формирование ГАМКергической системы нейронов в ЦНС улитки в эмбриональный и ранний постэмбриональный периоды жизни.
Впервые показано, что в ЦНС беспозвоночных различных типов нейроны, содержащие нейропептиды CNP семейства, имеют сходный тип морфологии: интернейроны, сенсорные нейроны и нейроэндокринные клетки. Показано, что экспрессия CNP нейропептидов лабильна, тогда как синтез РМБРамида и педального пептида не зависит от внешних воздействий.
Основные положения, выносимые на защиту.
В основе работы серотонинергических нейронов, модулирующих оборонительное поведение, лежат принципы компартментализации медиатор-специфичной системы и делегирования функций, выражающиеся в определенной соматотопике проекций, меняющейся в онтогенезе.
Нейропептиды можно классифицировать по степени зависимости их экспрессии от возрастного и функционального состояния животного. Нейропептиды одного семейства экспрессируются в сходных функциональных типах нейронов у разных беспозвоночных животных.
![Динамика морфобиохимических показателей системы нейрон - глия - капилляр и процессы липопероксидации в структурах моста головного мозга человека при старении [Электронный ресурс]](/i/i/4288/192299.png "Динамика морфобиохимических показателей системы нейрон - глия - капилляр и процессы липопероксидации в структурах моста головного мозга человека при старении [Электронный ресурс] Григорьев Олег Глебович")
