Введение к работе
Актуальность темы исследования. Долгое время считалось, что
каждый отдельный нейрон центральной нервной системы (ЦНС)
высвобождает только один тип нейромедиатора из всех своих синаптических
окончаний. Данная идея была названа Экклсом «принципом Дейла». С конца
70-х годов появились многочисленные работы, показывающие, что несколько
нейропептидных медиаторов могут присутствовать в качестве
нейромодуляторов в одном нейроне совместно со всеми видами быстрых
нейромедиаторов. Затем была выявлена ко-локализация классических
нейромедиаторов.
На сегодняшний день продемонстрировано, что в различных отделах
ЦНС позвоночных многие классические нейромедиаторы могут быть
совместно локализованы в одном нейроне. Например, была
продемонстрирована совместная локализация ацетилхолина и ГАМК (Jia et
al, 2003), ГАМК и серотонина (Barreiro-Iglesias, Cornide-Petronio et al, 2009),
ГАМК и АТФ (Jo and Schlichter, 1999), глутамата и ацетилхолина (Li et al.,
2004; Nishimara et al, 2005), дофамина и ГАМК (Barreiro-Iglesias, Villar-
Cervino et al, 2009), дофамина и серотонина (Zhou et al, 2005), глутамата и
дофамина (Hnasko et al., 2010), глутамата и ГАМК (Seal and Edwards, 2006;
Somogyi, 2006), а также ГАМК и глицина (Todd et al, 1996). Таким образом,
согласно существующей на данный момент модели, одиночный нейрон
представляет собой гибкую систему с вариабельным набором
нейромедиаторов, высвобождаемых в разных сочетаниях. При этом
продемонстрирована возможность как высвобождения разных сигнальных
веществ в разных синапсах одного нейрона, так и совместного
высвобождения нескольких сигнальных веществ в одном синапсе
(Виноградова, 2000). Дальнейшие исследования этой особенности нервных
клеток показали, что при совместном высвобождении нескольких
сигнальных веществ, процессы, запускаемые ими, могут влиять друг на
друга.
ГАМК и глицин - основные тормозные нейромедиаторы центральной нервной системы позвоночных. Оба этих вещества являются аминокислотами. Ионотропные рецепторы, активируемые данными нейромедиаторами, принадлежат к суперсемейству лиганд-управляемых ионных каналов и имеют сходное строение (Jentsch et al., 2002). Но при этом, особенности процесса торможения, вызываемого действием глицина и ГАМК, могут существенно отличаться. На нейронах млекопитающих продемонстрировано, что ГАМК и глицин могут совместно накапливаться в одной синаптической везикуле и совместно высвобождаться в синаптическую щель (Jonas et al., 1998; O'Brien and Berger, 1999). Результаты, демонстрирующие возможность совместного высвобождения глицина и ГАМК в спинном мозге лягушки, были получены в лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия с применением как иммуноцитохимических, так и электрофизиологических методов. Так, например, результаты иммуноцитохимических исследований показывают, что в значительном проценте тормозных синапсов (70%) на мотонейронах спинного мозга лягушки возможно совместное высвобождение глицина и ГАМК (Аданина et al., 2010). Также сотрудниками этой лаборатории продемонстрировано наличие трех типов миниатюрных тормозных потенциалов, вызываемых спонтанным высвобождением глицина, ГАМК и совместным высвобождением глицина и ГАМК из одной синаптической везикулы в синапсе на мотонейроне спинного мозга лягушки (Полина et al., 2006). Таким образом, можно заключить, что в нейронах спинного мозга лягушки существуют физиологические условия для осуществления взаимодействий процессов, вызываемых одновременной активацией рецепторов глицина и ГАМК.
В настоящий момент имеется информация о взаимодействии ответов, опосредованных активацией глициновых и ГАМКд-рецепторов. Это взаимодействие проявляется в особенностях ответов нейронов на одновременное действие нейромедиаторов. Продемонстрировано, что в
нейронах млекопитающих ГАМК-глициновое взаимодействие носит сложный нелинейный характер и характеризуется окклюзией ответов и их перекрестной десенситизацией (Li et al, 2003; Li and Xu, 2002; Russier et al, 2002). Охарактеризованы некоторые молекулярные механизмы, участвующие в осуществлении данного взаимодействия (Li et al., 2003). Но в целом, особенности регуляции возбудимости нейрона посредством одновременной активации рецепторов глицина и ГАМК изучены недостаточно.
Основным объектом, на котором проводятся исследования взаимодействия ГАМК- и глицин-опосредованных процессов являются нейроны различных отделов ЦНС млекопитающих. Имеющиеся сведения о ГАМК-глициновом взаимодействии у низших позвоночных немногочисленны и противоречивы. Полученные предварительные результаты позволяют заключить, что особенности ГАМК-глицинового взаимодействия у низших позвоночных существенно отличаются от таковых у млекопитающих. Исследование этих особенностей позволяет пролить свет на эволюционное развитие механизмов тонкой регуляции возбудимости нейронов. Амфибии, как эволюционное звено, практически не исследованы в ракурсе этой проблемы и поэтому представляют собой интересный объект. В представленной работе объектом исследования являются свежевыделенные переживающие нейроны поясничного отдела спинного мозга лягушки (Rana temporaria, Rana ridibunda). Целью работы является выяснение возможных механизмов взаимодействия ГАМК- и глицин-опосредованных ответов мотонейронов спинного мозга лягушки.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Исследовать свойства ответов, вызываемых действием глицина и ГАМК на нейроны спинного мозга лягушки.
Исследовать взаимовлияние ГАМК- и глицин-опосредованных ответов при различных физиологических условиях
Проверить возможность реализации известных из опубликованных исследований механизмов ГАМК-глицинового взаимодействия
Научная новизна работы
Впервые описано взаимодействие ГАМК- и глицинергических процессов в нейронах спинного мозга амфибий. Выявлены основные факторы и механизмы, влияющие на его протекание.
Впервые показано, что в нейронах спинного мозга амфибий ГАМК в физиологических концентрациях может с относительно высокой эффективностью активировать рецепторы глицина, что играет важную роль при совместном действии этих нейромедиаторов.
Научно-практическое значение работы. Данное исследование
посвящено малоизученным особенностям процесса торможения активности
нейрона. Результаты проведенного исследования представляют интерес для
общей нейрофизиологии, нейробиологии, физиологии и биофизики нервной
клетки. Они вносят существенный вклад в понимание механизмов
торможения и его регуляции в нервной системе позвоночных. В работе
впервые проведено прямое сопоставление результатов, полученных методом
пэтч-кламп и методом внутриклеточного отведения, и даны объяснения
полученным различиям результатов, что представляет методический интерес
и позволяет выявить новые особенности применения
электрофизиологических методов. Результаты настоящей работы могут быть полезны для понимания эволюционного развития тормозной рецепции у позвоночных. Полученные результаты могут быть использованы при разработке рациональных подходов лечения расстройств нервной системы, связанных с нарушением тормозных процессов.
Апробация работы. Результаты данной работы были представлены и
обсуждены на следующих конференциях: Одиннадцатая и Двенадцатая
Всероссийской медико-биологической конференции молодых
исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина»,
проходившие в Санкт-Петербурге, 2008 г. и 2009 г., соответственно; XXI
съезд российского физиологического общества им. И.П.Павлова, проходивший в Калуге, 2010 г.; Корейско-Российский научно-технологический форум, проходивший в Москве, 2010 г. Также результаты были представлены и обсуждены на коллоквиумах и семинарах лаборатории эволюции межнейронного взаимодействия ИЭФБ им. И.М.Сеченова РАН
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах и 5 публикаций в сборниках тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 269 источников. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 44 рисунка, 5 таблиц.
