Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нейрофизиология префронтальной коры и ее функции (литературный обзор) 12
1.1. Критерии для определения префронтальной коры 12
1.2. Функции префронтальной коры 13
1.3. Эволюция префронтальной коры. Сравнительная анатомия префронтальной коры у крыс и обезьян 16
1.4. Развитие и инволюция префронтальной коры в онтогенезе 19
1.5. Цитоархитектоника префронтальной коры обезьян 21
1.6. Афферентные и эфферентные связи префронтальной коры у приматов 23
1.7. Нейроны префронтальной коры и их основные характеристики 27
1.8. Заключение по литературному обзору 37
Глава 2. Методы исследования 39
2.1. Приготовление переживающих срезов коры мозга макаки и крысы 39
2.2. Регистрация и анализ электрофизиологических свойств нейронов префронтальной коры 41
2.3. Гистологические методы и морфологическая реконструкция нейронов 52
2.4. Статистическая обработка данных 54
Глава 3. Пирамидные нейроны префронтальной коры обезьяны 55
3.1. Электрофизиологическая классификация пирамидных клеток на основе многомерного статистического анализа 55
3.2. Электрофизиологические свойства пирамидных клеток разных классов 62
3.3. Особенности электрофизиологии пирамидных клеток обезьян 76
3.4. Функциональная роль пирамидных клеток разных электрофизиологических классов в коре обезьян 79
Глава 4. Интернейроны префронтальной коры обезьяны 82
4.1. Морфологические группы интернейронов 2-3 слоев дорсолатеральной префронтальной коры мозга макаки 83
4.2. Электрофизиологические характеристики интернейронов 92
4.3. Иммуногистохимические характеристики интернейронов префронтальной коры макаки 107
4.4. Функциональная роль разных типов интернейронов префронтальной коры макаки 116
Глава 5. Сравнение свойств нейроглиаформных и корзинчатых интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны 126
5.1. Характеристики нейроглиаформных нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы 127
5.2. Характеристики быстроразряжающихся парвальбумин-положительных корзинчатых нейронов префронтальной коры у обезьяны и крысы 138
5.3. Функциональное значение межвидовых различий в морфологических и физиологических свойствах нейроглиаформных и корзинчатых клеток крысы и обезьяны 148
Глава 6. Функциональные особенности возбуждающих синаптических входов у различных нейронов префронтальной коры обезьяны и крысы 151
6.1. Свойства миниатюрных ВПСП и ВИСТ пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов у обезьян и крыс 152
6.2. Свойства вызванных ВПСП пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов крыс и обезьян 157
6.3. Субъединичный состав глутаматных AMP А рецепторов различается у интернейронов и пирамидных клеток 164
6.4. Функциональное значение различий в свойствах ВПСП у интернейронов и пирамидных клеток: механизм упреждающего дисинаптического торможения в коре 166
6.5. Значение различий в организации возбуждающих входов для функционирования префронтальной коры крысы и обезьяны 171
Глава 7. Особенности взаимодействия быстроразряжающихся интернейронов и пирамидных клеток префронтальной коры крысы 173
7.1. Свойства синаптических соединений между пирамидными нейронами и быстроразряжающимися интернейронами 175
7.2. Краткосрочная динамика синаптической передачи в возбуждающих и тормозных синапсах 180
7.3. Реципрокные синаптические соединения имеют более высокую эффективность и надежность, чем односторонние 183
7.4. Пресинаптические потенциалзависимые кальциевые каналы 185
7.5. Функциональное значение 188
Глава 8. Особенности долговременной синаптической пластичности пирамидных клеток префронтальной коры крысы 193
8.1. Синаптическая пластичность во 2-3 слоях префронтальной коры, вызванная синхронизирующим протоколом, не подчиняется правилу Хэбба 194
8.2. Ингибирование кальцийзависимого калиевого тока, обеспечивающего медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливает хэббову пластичность 198
8.3. Нейромодуляторы, подавляющие медленную следовую гиперполяризацию, восстанавливают хэббову пластичность 201
8.4. Сайт экспрессии синаптической пластичности в префронтальной коре 204
8.5. Фармакологические свойства пластичности в префронтальной коре 206
8.6. Функциональное значение 209
Глава 9. Особенности функционального созревания возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макаки 211
9.1. Плотность шипиков на дендритах пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры макаки значительно уменьшается в возрасте от 15 до 42 месяцев 212 9.2. Функциональное созревание глутаматергической передачи в префронтальной коре макаки в возрасте от 3 до 84 месяцев: постсинаптические изменения 214
9.3. Функциональное созревание глутаматергической передачи в коре макаки: пресинаптические изменения 219
9.4. Функциональные значение выявленных изменений в работе возбуждающих синапсов префронтальной коры макаки в ходе постнатального развития 223
Заключение 227
Выводы 231
Список литературы 233
- Эволюция префронтальной коры. Сравнительная анатомия префронтальной коры у крыс и обезьян
- Регистрация и анализ электрофизиологических свойств нейронов префронтальной коры
- Особенности электрофизиологии пирамидных клеток обезьян
- Иммуногистохимические характеристики интернейронов префронтальной коры макаки
Введение к работе
Актуальность. Префронтальная кора - важнейший интегративный центр нервной системы млекопитающих. К префронтальной коре относят часть лобной коры, тесно связанную с ассоциативным медиодорсальным ядром таламуса и получающую многочисленные дофаминергические проекции от стволовых ядер. Эта область мозга также связана с большинством вторичных и третичных сенсорных и моторных областей коры, многими ядрами таламуса, покрышки мозга, гипоталамуса, бледного шара, амигдалы, гиппокампа, ретикулярной формации среднего мозга, черной субстанции среднего мозга, мозжечка и ряда других структур (Fuster, 2008). Префронтальная кора обеспечивает организацию целенаправленных действий во времени, удержание в памяти недавних событий (сенсорных стимулов), концентрацию внимания на целевых стимулах и подготовку к выполнению будущих действий. Важную роль префронтальная кора играет в регуляции эмоций, социальном поведении, контроле вегетативных функций.
Префронтальная кора значительно увеличивается в размерах в ходе эволюции млекопитающих, достигая наибольшего размера у приматов. У человека она составляет до 29% от общей поверхности коры. В онтогенезе развитие префронтальной коры идет в течение длительного времени: у человека созревание префронтальной коры продолжается до 20-летнего возраста (Paus, 2005, Toga et al., 2006, White et al., 2010). Префронтальная кора напрямую задействована в патогенезе многих психических заболеваний, включая шизофрению, депрессию и другие (Lewis and Levitt, 2002, Puig and Gulledge, 2011).
Исходя из исключительно важной роли префронтальной коры в организации психической деятельности человека и ее вовлеченности в ряд патологических процессов, в настоящее время во многих лабораториях мира ведется изучение нейрофизиологических механизмов ее функционирования. Одно из ведущих направлений - это исследование свойств структурных элементов коры (нейронов) и особенностей их взаимодействий.
Часто предполагается, что нейронные сети внутрикорковых модулей состоят из сходных структурных элементов и построены по единому каноническому принципу у всех видов млекопитающих (Douglas and Martin, 2004, Nelson et al., 2006). Межвидовые различия в корковых функциях возникают в основном из-за различий в количестве этих модулей и особенностей их внешних связей. Так как срезы коры грызунов существенно доступнее для изучения, то большинство сведений о нейронных механизмах работы коры были получены именно на этом объекте. Однако сейчас накоплено большое количество данных, указывающих на то, что сами структурные компоненты корковых модулей могут различаться у различных видов (Letinic et al., 2002, Butt, 2005). Поэтому остается дискуссионным вопрос, насколько правомерно использование этих результатов для выяснения функций префронтальной коры приматов и в том числе человека. Вместе с тем экспериментальных работ, непосредственно посвященных изучению свойств нейронов префронтальной коры приматов, в особенности ГАМКергических тормозных интернейронов крайне мало. Это делает необходимым проведение комплексного физиологического изучения нейронов префронтальной коры приматов.
Цель работы. Провести комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки (Масаса fascicularis), выявить основные типы нейронов
и дать описание их характеристик, определить свойства их синаптических связей, а также провести сравнение свойств нейронов префронтальной коры крысы и макаки, и тем самым приблизиться к пониманию особенностей механизмов работы префронтальной коры и роли отдельных типов нейронов в осуществлении функций.
Основные задачи исследования.
-
Изучить электрофизиологические свойства популяции пирамидных нейронов 2-3-го слоев префронтальной коры макаки и выявить основные физиологические классы пирамидных нейронов, используя методы многомерного статистического анализа; определить возможную роль разных классов пирамидных клеток в функционировании префронтальной коры.
-
Изучить и проанализировать морфологические, электрофизиологические и биохимические свойства гетерогенной популяции ГАМКергических интернейронов 2-3-го слоев префронтальной коры макаки и разработать их классификацию; предсказать возможную функциональную роль каждого из изученных типов интернейронов.
-
Провести сравнение электрофизиологических и морфологических свойств сходных типов интернейронов префронтальной коры крысы и макаки и тем самым установить, насколько схожи и насколько различаются гомологичные элементы нейронных сетей у двух видов, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.
-
Изучить и сопоставить свойства возбуждающих постсинаптических ответов у разных типов нейронов префронтальной коры крысы и макаки. В частности, исследовать свойства миниатюрных и вызванных постсинаптических возбуждающих ответов. Выявить функциональное значений различий в постсинаптических ответах у разных типов нейронов, их роль в реализации упреждающего дисинаптического торможения. Исследовать особенности синаптических связей между пирамидными нейронами и тормозными быстроразряжающимися корзинчатыми клетками в префронтальной коре крысы.
-
Выявить специфические особенности формирования долговременной синаптической пластичности у пирамидных клеток префронтальной коры крысы. Изучить роль и механизм действия некоторых нейромодуляторов на синаптическую пластичность.
-
Определить, есть ли связь между массовой элиминацией глутаматергических кортикальных синапсов и их функциональным созреванием в подростковом возрасте у приматов. Для этого исследовать особенности функционального созревания возбуждающих синапсов пирамидных клеток 2-3-го слоя префронтальной коры макаки, выявить пресинаптические (вероятность освобождения медиатора) и постсинаптические (соотношение вклада АМРА и NMDA рецепторов, субъединичный состав рецепторов) изменения в ходе онтогенеза.
Научная новизна. На основе репрезентативной серии экспериментов и статистического анализа результатов впервые выявлено, что пирамидные клетки 2-3-го слоев коры приматов по своим электрофизиологическим свойствам подразделяются на 4 класса. Эти результаты существенно отличаются от данных, полученных ранее при изучении коры грызунов, где почти все пирамидные клетки 2-3 слоев относятся к одному классу регулярноразряжающихся нейронов.
Впервые проведено комплексное исследование ГАМКергических интернейронов префронтальной коры макаки, включающее изучение морфологических, электрофизиологических и биохимических характеристик, на основе чего была разработана классификация интернейронов коры макаки. Впервые обнаружены и охарактеризованы типы интернейронов, не встречающиеся в коре грызунов.
Впервые проведено прямое сравнение свойств некоторых типов интернейронов префронтальной коры крысы и обезьяны, выявлено, что, морфологически сходные интернейроны крысы и обезьяны могут относиться к разным функциональным типам, что обнаруживается при электрофизиологическим исследовании. Впервые показано, что интернейроны у обезьяны характеризуются большей возбудимостью, чем у крысы.
Впервые всесторонне изучены и сопоставлены возбуждающие постсинаптические ответы пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов префронтальной коры крысы и макаки. Выявлено, что у обоих видов постсинаптические ответы быстроразряжающихся интернейронов характеризуются более быстрой кинетикой, большей амплитудой и при суммации раньше вызывают потенциалы действия, чем у пирамидных клеток. При изучении синаптически связанных пар интернейронов и пирамидных клеток крысы впервые показано, что латеральное торможение в префронтальной коре, реализуемое через быстроразряжающиеся интернейроны, слабее, чем возвратное торможение.
Впервые обнаружено, что в префронтальной коре крысы при использовании синхронизирующих протоколов наблюдается нарушение правила Хэбба о знаке долговременной синаптической пластичности: протоколы с негативной задержкой и позитивной задержкой вызывают долговременную депрессию в отличие от других областей коры. Впервые установлено, что подавление медленной следовой гиперполяризации позволяет восстановить выработку долговременной потенциации при использовании синхронизирующего протокола с позитивной задержкой. Выявлен возможный механизм действия нейромодуляторов на синаптическую пластичность через ингибирование медленной следовой гиперполяризации.
Впервые показано, что функциональное созревание возбуждающих синапсов пирамидных клеток префронтальной коры макак завершается до подросткового возраста, и что массовая элиминация возбуждающих синапсов в подростковом возрасте происходит через механизмы, не связанные с их функциональной зрелостью.
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенное комплексное электрофизиологическое и морфологическое изучение гетерогенной популяции нейронов дорсолатеральной префронтальной коры макаки позволяет лучше понять клеточные механизмы работы префронтальной коры и предсказать роль отдельных типов нейронов в осуществлении функций в норме и при патологиях ЦНС. Использованные в работе методы многомерного статистического анализа позволили выявить фундаментальные закономерности в проявлении электрофизиологических свойств нейронов, полученные результаты прямо свидетельствуют в пользу существования ограниченного числа классов нейронов с определенным набором свойств.
Межвидовое сравнение некоторых типов интернейронов выявило, что ряд их электрофизиологических характеристик существенно отличается у крысы и обезьяны, что свидетельствует о различиях в функционировании префронтальной коры у этих
видов. Проведенное исследование позволяет лучше понять ход основных изменений в филогенетическом развитии префронтальной коры у млекопитающих. Результаты исследования показывают, что экстраполяцию данных, полученных на грызунах, к приматам, и, в конечном счете, к людям надо делать очень осторожно.
Новые данные об особенностях функционального становления синаптической передачи в онтогенезе, а также синаптической пластичности в префронтальной коре важны для понимания механизмов развития психических функций в норме, также они будут полезны при изучении патогенеза ряда заболеваний ЦНС, связанных с нарушениями в развитии. Важное практическое значение имеют результаты, полученные при изучении субъединичного состава синаптических рецепторов у разных типов нейронов, они позволяют разрабатывать фармакологические подходы с избирательным воздействием на целевые группы нейронов.
Положения, выносимые на защиту
-
Методы многомерного статистического анализа позволяют идентифицировать непересекающиеся группы нейронов коры и выявить наиболее важные критерии для классификации и идентификации типов нейронов.
-
Морфологически сходные интернейроны префронтальной коры крысы и макаки могут различаться по электрофизиологическим свойствам, что свидетельствует о функциональных различиях в организации работы префронтальной коры грызунов и приматов.
-
Различия в свойствах синаптических входов у пирамидных клеток и интернейронов имеет важное функциональное значение для обеспечения работы коры.
-
В префронтальной коре крысы, в отличие от других областей коры и гиппокампа, протоколы с синхронизацией пре- и постсинаптической активности независимо от их последовательности вызывают долговременную депрессию синаптической передачи.
-
Функциональное и морфологическое созревание возбуждающих синапсов в префронтально коре приматов происходит в онтогенезе в разное время.
Личный вклад автора. Планирование и выполнение экспериментов, обработка, анализ и подготовка результатов к публикации проводилось лично автором или совместно с сотрудниками Питтсбургского университета (США), университета Тринити-Колледж (Ирландия), ИЭФБ РАН (Россия) Н.В. Повышевой; D.A. Lewis; R. Anwyl, L.S. Krimer; G. Gonzalez-Burgos; D. Rotary; Л.Г. Магазаником, Д.Б. Тихоновым, К.Х. Ким. Техническую помощь оказывали сотрудники Питтсбургского университета О. Krimer и J. Kosakowski.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Annual Meetings of Society for Neuroscience (Новый Орлеан, 2003; Сан-Диего, 2004; Вашингтон, 2005; Атланта, 2006; Вашингтон, 2008; Чикаго, 2009), FENS Forams of Neuroscience (Амстердам, 2010; Барселона, 2012), WPIC's Fourth Annual Research Day (Питтсбург, 2004), WPIC's Sixth Annual Research Day (Питтсбург, 2006), 3rd Annual Neuroscience Ireland Conference (Дублин, 2008), III съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011), XIV Международного совещания и VII Школы по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2011), Восьмом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Ялта, 2012), II Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология»
(Пущино, 2012), XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), FENS Featured Regional Meeting (Прага, 2013) и др.
Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 49 печатных работах, в числе которых 16 статей в журналах, включенных в систему цитирования Web of Science.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 278 страницах и состоит из введения, обзора литературы, характеристики методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, изложенных в 9 главах, заключения, выводов и списка литературы, включающего 590 источников. Диссертация иллюстрирована 125 рисунками и 22 таблицами.
Эволюция префронтальной коры. Сравнительная анатомия префронтальной коры у крыс и обезьян
Гистогенез и созревание префронтальной коры идет аналогично другим областям коры и включает в себе миграцию нервных клеток, распределение их по слоям и дальнейшую дифференцировку и синаптогенез [73]. У грызунов послойная архитектура префронтальной коры продолжает формироваться после рождения [93], тогда как у человека послойная организация префронтальной коры практически завершается к седьмому месяцу внутриутробного развития [94]. После того, как послойная организация сформирована, начинается рост дендритов [95]. Апикальные дендриты формируются раньше базилярных. У человека дендриты пирамидных нейронов префронтальной коры рудиментарны при рождении, но быстро увеличиваются в размерах в течение первых двух лет жизни, а затем их рост замедляется [96]. Рост дендритов определяется внешними воздействиями, как было показано на крысах [97, 98].
Развитие префронтальной коры продолжается в онтогенезе длительный период. В целом созревание более глубоких слоев (4-6) происходит раньше, чем более поверхностных 2-3 слоев [73]. У человека дифференцировка пирамидных нейронов 3 слоя префронтальной коры продолжается в подростковом возрасте [99, 100]. Следует отметить, что именно пирамиды 3 слоя получают основные синаптические входы от других корковых отделов и от них же идут основные потоки к различным областям коры. Таким образом, этот слой наиболее важен для выполнения высших ассоциативных функций [1, 101]. Синаптогенез в префронтальной коре приматов происходит примерно в те же сроки, что и в остальных областях коры [102-104]. Плотность синапсов резко возрастает перед рождением остается наиболее высокой сразу после рождения. Затем часть синапсов элиминируется и количество синапсов стабилизируется к подростковому возрасту. В настоящее время остаются разногласия о том, как протекает элиминация синапсов во времени. Идет ли оно синхронно во всех областях коры мозга [102] или с некоторой задержкой в префронтальной коре [105, 106]. Предполагается, что у человека элиминация синапсов в префронтальной коре может по времени совпадать с манифестацией подростковой шизофрении [107].
Миелинизация волокон в префронтальной коре начинается намного позже, чем в других областях мозга и продолжается долгие годы [108, 109]. Как у человека [ПО], так и обезьян [111] миелинизация завершается в последнюю очередь во 2 и 3 слоях префронтальной коры. Хронология миелинизации тесно связана с развитием функций коры.
Современные методы визуализации (магнитно-резонансная томография) также свидетельствуют о том, что созревание лобных долей мозга и в особенности префронтальной коры продолжается у человека до 20 лет или даже дольше [15-19]. Согласно большинству исследований развитие коры сопровождается уменьшением объема серого вещества, что связано с элиминацией избыточных синапсов и нейронов и увеличением доли белого вещества (миелинизацией). Эти нейробиологические данные хорошо соотносятся с тем, что высшие психические функции, напрямую связанные с работой префронтальной коры, такие как, принятие решений, планирование, языковые навыки достигают своего полного развития примерно в этот же возраст [1]. Морфологическое развитие коры сопровождается созреванием нейромедиаторных систем, при этом эти процессы могут не совпадать по времени, например, созревание моноаминергических систем происходит дольше [112-114].
В зрелом возрасте морфологических изменений в коре практически не наблюдается, однако, при старении наблюдается процесс дегенерации коры, сопровождающийся истончением и уменьшением объема серого вещества коры, уменьшением плотности нейронов [115, 116]. У обезьян в дорсолатеральной коре происходит сокращение числа синапсов [117] и уменьшение миелинизации волокон [118]. К 70-80 годам у человека размер, объем и плотность нейронов значимо уменьшаются в префронтальной коре [119, 120]. Изменения в размерах обусловлено уменьшением и исчезновением части дендритного дерева нейронов [120, 121]. Наряду с морфологическими изменениями при старении наблюдаются и изменения биофизических мембранных свойств нейронов [122, 123].
Интерес к морфологии префронтальной коры приматов сохраняется в течение многих десятилетий. Первые полные цитоархитектонические карты коры больших полушарий человека и обезьяны были опубликованы Кэмпбелом и Бродманом соответственно в 1905 год (цит. по [1]). В дальнейшем целым рядом исследователей было проведено детальное изучение цито- и миелоархитектоники коры с уточнением корковых полей [90, 124-131]. Так как префронтальная кора произошла как минимум из двух источников, то можно выделить 2 отдельных тренда (дорсальный и вентральный) в которых прослеживается усложнение цитоархитектоники, с выделением 4 типов корковой организации. Наиболее примитивной является трехслойная кора (аллокортекс), непосредственно к ней примыкает периаллокортекс со слабо дифференцированными слоями. К периаллокортексу примыкает произокортекс с зарождающейся ламинарной организацией. Наиболее эволюционно продвинутой является новая кора (изокортекс) с хорошо выраженной шестислойной организацией [132]. Дорсальный (гиппокампальный) тренд происходит от медиального префронтального аллокортекса и включает в себя медальную и дорсолатеральную префронтальную кору. Вентральный (пириформный) тренд происходит от заднего орбитального аллокортекса и объединяет вентральную и вентролатеральную префронтальную кору.
Латеральная часть префронтальной коры макак (поля 8, 9, 10, 45, 46 и 47 [131, 133], Рис. 3) состоит из 6 хорошо различимых слоев клеток с выраженным внутренним гранулярным слоем (слой IV). Наличие четвертого слоя отличает префронтальную кору от других отделов лобной коры [32, 130, 134]. Этот слой становится толще по мере приближения к фронтальному полюсу, тогда как сама кора становится тоньше. В четвертом слое найдены малые пирамидные клетки, гранулярные клетки, малые клетки Гольджи II типа, обладающих значительным полиморфизмом. Наиболее распространенными являются звездчатые клетки с короткими дендритами, которые разветвляются в непосредственной близости от тела нейрона во всех направлениях, образуя сферическое дендритное дерево. Их аксоны также достаточно короткие, не покидают коры и формируют аксонные сети вокруг соседних пирамидных клеток. Пирамиды III и V слоев тем больше по размеру, чем ближе они расположены к слою IV.
Регистрация и анализ электрофизиологических свойств нейронов префронтальной коры
Первая часть экспериментов была проведена на переживающих срезах префронтальной коры мозга половозрелых (3.5-6 кг, 3.5-5 лет) особей яванских макак (Macacafascicularis). Эти эксперименты были выполнены в Питтсбургском университете (США) в соответствие с правилами по работе с лабораторными животными, разработанными Национальным Институтом Здоровья США. Биопсию ткани мозга с участком префронтальной коры производил профессор Д. Льюис. Биопсия осуществлялась по стандартной процедуре. Сначала животное получало кетаминовый наркоз (кетамина гидрохлорид, 25 мг/кг и дексаметазона фосфат, 0.5 мг/кг, внутримышечно; атропина сульфат, 0,05 мг/кг, подкожно). Для поддержания анестезии в трахею вводились эндотрахеальные трубки, в течение операции дыхание производилось смесью 1% галотана / 28% Ог в воздушной смеси. Далее животное помещалось в стереотаксическую установку, краниотомия проводилась в области черепа над дорсолатеральной префронтальной корой. Определение нужного участка коры производилось по стереотаксическим координатам и расположению борозд и извилин на поверхности мозга. Для экспериментов извлекался участок коры содержащий латеральный и медиальный края основной борозды (s. principalis), поля 9 и 46 (Рис. 4).
После операции животным вводились антибиотик широкого спектра действия (хлорамфеникол (левомицетин); 15 мг/кг, внутримышечно) и анальгетик (гидроморфон, 0.02 мг/кг, внутримышечно) 3 раза в сутки в течение 3-х дней. Животные быстро восстанавливались, никаких видимых нарушений поведения у них не наблюдалось. Через 2-4 недели производилась вторая операция, в ходе которой производилась биопсия участка дорсолатеральной префронтальной коры другого полушария. После второй операции животное усыпляли.
Примерно у половины экспериментальных животных первая операция производилась на левом полушарии, а другой половины - на правом полушарии. Чтобы уменьшить возможный эффект компенсаторных реакций, развивающихся в контралатеральном полушарии, при второй биопсии участок мозга выбирался более рострально или каудально по отношению к участку, изъятому в ходе первой биопсии. Сравнение результатов экспериментов, полученных на срезах мозга после первой и второй биопсии, а также из разных полушарий не выявило никаких значимых различий, поэтому в дальнейшем все данные приводятся без учета этих факторов.
Экспериментальная процедура приготовления переживающих срезов коры обезьяны и крысы. (А) Схематическое изображение мозга макаки, оранжевым отмечена область коры мозга, из которой осуществлялась биопсия. PS - основная борозда (s. principalis). (В) Схематическое изображение типичного среза префронталъной коры макаки. Цифрами отмечены корковые поля 9 и 46, WM - белое вещество. (С) Схематическое изображение типичного среза коры мозга крысы. Серой рамкой отмечена зона, в которой производились регистрации. PL - прелимбическая и IL -инфралимбическая кора.
Кусочек коры мозга сразу после биопсии помещался в ледяную искусственную спинномозговую жидкость (ИСМЖ) следующего состава, в мМ: 230 сахарозы, 1.9 КС1, 1.2 Na2HP04, 33 NaHCCb, 6 MgCh, 1 СаСЬ, 10 глюкозы и 2 кинуреновой кислоты; рН 7.3-7.4; раствор аэрировался газовой смесью 95% Ог/5% СОг.
Вторая часть экспериментов была проведена на переживающих срезах медиальной фронтальной (прелимбической и инфралимбической) коры мозга крысы (Рис. 4С) в Питтсбургском университете (США), Тринити колледже Дублина (Ирландия) и Институте эволюционной физиологии и биохимии РАН (РФ). Для экспериментов использовались крысы линии Вистар в возрасте 14-120 дней. Все эксперименты проводились в соответствии с правилами по работе с лабораторными животными.
Коронарные срезы коры мозга обезьян и крыс толщиной 300-350 мкм приготавливали на вибротоме (VT 1000S, Leica, Германия или на вибротомах других моделей) и инкубировали в течение часа при температуре 37 С, а затем при комнатной температуре до начала электрофизиологических опытов в ИСМЖ следующего состава, в мМ: 126 NaCl, 2.5 КС1, 1.2 Na2HP04, 25 NaHC03, 2.0 СаСЬ, 1.0 MgCh, 10 глюкозы; pH 7.3-7.4; раствор аэрировался газовой смесью 95% Ог/5% СОг. ИСМЖ такого же состава обычно использовалась и при проведении электрофизиологических регистрации. Эксперименты на срезах коры крысы обычно продолжались в течение 4-6 часов после их изготовления, на срезах мозга макаки - в течение 12-16 часов, в течение этого срока существенного ухудшения качества срезов не происходило.
Для регистрации электрофизиологических свойств нейронов срез помещался под микроскоп, в перфузируемую записывающую камеру общим объемом около 1-2 см3. В этой камере обеспечивался постоянный проток ИСМЖ, подогретой до 30-32 С и аэрируемой газовой смесью 95% Ог/5% СОг. Скорость потока жидкости составляла не менее 1.5-3 мл/мин.
Визуализация нейронов обеспечивалась с помощью оптики Номарского (дифференционно-интерференционного контраста, DIC). На микроскопе для улучшения визуализации использовался инфракрасный (ИК) источник света, так как ИК свет меньше рассеивается в ткани мозга. Для визуализации нейронов использовался длиннофокусный водный иммерсионный объектив (40х). Изображение передавалось на камеру и демонстрировалось на мониторе. Такая комбинация методов визуализации позволяла хорошо различать форму нейронов и производить их первоначальную идентификацию (Рис. 5).
Регистрация токов и/или потенциалов производилась методом локальной фиксации потенциалов/токов (voltage clamp/current clamp) в конфигурации целая клетка (whole cell mode). Электроды изготавливались из боросиликатного стекла на пуллере (Sutter Instrument). В зависимости от типа эксперимента и его задач сопротивление электродов менялось в диапазоне от 2 до 8 МОм. Преимущественно использовались электроды с низким сопротивлением (3-5 МОм), что позволяло уменьшить сопротивление доступа (access resistance) и улучшить характеристики записи. Однако в экспериментах, требующих морфологической реконструкции интернейронов обычно использовались электроды с более высоким сопротивлением (5-7 МОм), так как эти клетки имеют малые размеры и электроды с большим кончиком могут повредить клетку. В тех случаях, когда планировался иммуногистохимический анализ на наличие растворенных в цитоплазме белков, также использовали электроды с высоким сопротивлением, чтобы уменьшить скорость диализа. Для изготовления электродов использовались капилляры с внешним диаметром 1.5 мм и внутренним 0.86 мм, либо с внешним диаметром 1.0 мм и внутренним 0.58 мм.
Особенности электрофизиологии пирамидных клеток обезьян
Как описано выше, пирамидные клетки 2-3 слоев префронтальной коры обезьяны очень разнообразны по мембранным электрофизиологическим свойствам и относятся к разным классам. Эти результаты существенно отличаются от данных, полученных при изучении коры грызунов, где почти все пирамидные клетки 2-3 слоев относятся к регулярноразряжающимся; пирамидные клетки с другими мембранными свойства обычно находят в глубоких слоях коры грызунов [212-215, 266, 272, 273]. Тем не менее, различные по электрофизиологическим свойствам пирамидные нейроны были обнаружены в 2-3 слоях коры кошки и человека [248, 263, 264, 268, 274]. Таким образом, кора головного мозга обезьяны, как и кора мозга человека, отличается от коры грызунов по электрофизиологическим свойствам пирамидных клеток 2-3 слоев.
На основе результатов кластерного анализа пирамидные клетки 2-3 слоев префронтальной коры обезьяны были разделены на четыре электрофизиологических класса. Два класса содержат регулярноразряжающиеся клетки, что составляет 52% от общего числа пирамидных клеток, следующий класс включает в себя низкопороговые клетки (17%), а последний класс состоит из клеток с промежуточным паттерном (31%).
Два класса регулярноразряжающихся клеток отличаются входным сопротивлением мембраны, постоянной времени мембраны, реобазой, амплитудой потенциала действия и частотой потенциалов действия (Таблица 4). Пирамидные клетки с высоким входным сопротивлением более возбудимы, чем пирамидные клетки с низким входным сопротивлением, и в ответ на синаптическую стимуляцию будут отвечать с меньшим порогом, а при одинаковой стимуляции будут разряжаться с более высокой частотой. Благодаря этому функциональная роль этих клеток в коре может различаться. Следует отметить, что в предыдущих исследованиях пирамидных клеток различия во входном сопротивлении мембраны учитывались крайне редко [244, 275]. Обычно регулярноразряжающиеся пирамидные клетки разделяли на две или три подгруппы на основе изменений величины порога потенциалов действия и частотной адаптации в течение пачки спайковых разрядов [214, 262, 267].
В отличие от ранее опубликованных данных, у пирамидных клеток коры обезьяны мы обычно не наблюдали изменений величины порога потенциалов действия и уменьшения амплитуды ответов во всем диапазоне прилагаемых деполяризующих токов. Кроме того, в данной популяции нейронов не было обнаружено пирамидных клеток с быстрой частотной адаптацией (RS fast-adapting pyramidal cells), которые отвечают только на включение деполяризующего тока 2-10 потенциалами действия, в дальнейшем эти нейроны спайков не генерируют [214, 262, 268, 276]. Регулярноразряжающиеся пирамидные клетки, найденные нами в префронтальной коре обезьяны по своим свойствам в наибольшей степени походили на описанные в литературе RS1 [267], RS [215, 244, 265], медленно адаптирующиеся RS1 [214] пирамидные клетки из коры крысы; медленно адаптирующиеся RS [268], RS [248, 274] из коры кошки; non-LTS RSI коры макаки [262]; RS [263] и non-LTS пирамидные клетки коры человека [264].
Важно подчеркнуть, что во 2-3 слоях префронтальной коры обезьяны по крайней мере 1/3 популяции пирамидных клеток не является регулярноразряжающимися. Низкопороговые клетки начинают ответ с высокочастотного залпа потенциалов действия даже при пороговой деполяризации, а клетки промежуточного типа генерируют высокочастотные пачки потенциалов действия при более сильной деполяризации. Залп спайковой активности пирамидной клетки состоит, как правило, из 2-5 потенциалов действия, при этом залп из двух потенциалов действия более характерен для пирамидных клеток промежуточного типа, залп из 3-5 спайков для низкопороговых клеток. Как уже упоминалось выше, залповые пирамидные клетки у грызунов встречается только в глубоких слоях коры головного мозга [213, 215, 275, 277]. Например, в медиальной префронтальной коре грызунов низкопороговые залповые клетки составляют до 64-68% в 5 и 6 слоях и не более 5% во 2-3 слоях [213, 265, 273]. В то же время клетки, генерирующие залпы из двух потенциалов действия (дублеты), описаны в разных слоях коры [243, 267, 278].
Стоит также отметить, что описанные ранее низкопороговые пирамидные клетки коры головного мозга человека [263] больше похожи на клетки промежуточного типа обезьяны, чем на собственно залповые низкопороговые клетки. Так, низкопороговые клетки коры человека отвечают типичным регулярным паттерном спайкового ответа при потенциале мембраны более позитивном, чем -69 мВ; в то время как при более низком потенциале покоя они отвечают коротким залпом из двух, реже трех потенциалов действия, за которым следуют регулярные спайки [263, 264].
Принято считать, что низкопороговый паттерн спайковых ответов определяется присутствием низкопороговых кальциевых каналов [213, 265]. В настоящем исследовании прямо не исследовались ионные механизмы низкопорогового паттерна пирамидных нейронов коры обезьян, однако некоторые наблюдения позволяют предположить наличие низкопороговых кальциевых каналов в низкопороговых клетках и клетках промежуточного типа. Например, было обнаружено, что деполяризационный горб у нейронов этих двух электрофизиологических классов был сильнее выражен, если деполяризующий ток применялся с более отрицательного мембранного потенциала. Регулярноразряжающиеся пирамидные клетки обычно не выказывали деполяризационный горб ни при каком мембранном потенциале. Еще одним признаком низкопороговых кальциевых каналов является присутствие следовой деполяризации после потенциала действия [265]. Хотя ионные механизмы следовой деполяризации сильно отличается в различных центральных нейронах [279]; в пирамидных нейронах префронтальной коры крысы, вход ионов Са2+ играет основную роль в электрогенезе следовой деполяризации [265]. Клетки промежуточного типа выказывали максимальную по амплитуде следовую деполяризацию, в низкопороговых клетках следовая деполяризация была настолько сильна, что вызывала всплеск спайковой активности
Иммуногистохимические характеристики интернейронов префронтальной коры макаки
Результаты проведенного межвидового сравнения показали, что между нейроглиаформными и быстроразряжающимися корзинчатыми интернейронами крысы и обезьяны есть ряд морфологических и электрофизиологических различий. Оба типа интернейронов крысы имели больше разветвлений аксонов и большую суммарную длину аксона, чем соответствующие типы обезьяны, однако большинство других морфологических показателей были сходны.
Следует подчеркнуть, что густая сеть аксонов у нейроглиаформных клеток играет важную функциональную роль. Особенность этих интернейронов - очень близкое расположением пресинаптических окончаний вдоль аксона, а кроме того медиатор может выделяться и вне пресинаптических терминалей [316, 368, 369]. Благодаря этому возбуждение нейроглиаформной клетки обеспечивает объемную нейротрансмиссию - активацию не только синаптических, но и экстрасинаптических ГАМКд рецепторов во всем занимаемом клеткой объеме [369], при этом вызванные ими ТПСТ характеризуются очень медленной кинетикой [370]. Еще одна важная особенность нейроглиаформных клеток - это их способность обеспечивать долговременное торможение пирамидных клеток посредством ГАМКв рецепторов [316]. Учитывая, что нейроглиаформные клетки у обезьян занимают меньший объем, чем у крысы, можно предполагать, что оказываемое ими действие в нейронной сети распространяется более локально.
Среди электрофизиологических отличий выделяется большее входное сопротивление мембраны и меньший порог возникновения потенциала действия у клеток обезьяны, чем у крысы. При пороговой стимуляции потенциал действия у клеток обезьяны генерируется с существенно меньшим латентным периодом, при надпороговой стимуляции число спайков (и их частота) при сходной силе стимуляции больше, чем у клеток крысы. Эти показатели свидетельствуют о большей возбудимости корзинчатых и нейроглиаформных клеток обезьяны.
Следует подчеркнуть, что у нейроглиаформных клеток крысы длительный латентный период возникновения спайка при пороговой деполяризации является настолько характерным признаком, что послужил основанием для выделения этих клеток в особый класс поздноразряжающихся клеток. У нейроглиаформных клеток обезьяны латентный период ответа гораздо короче и не отличается по длительности от ответов других типов нейронов. Задержанный спайковый ответ на синаптическую стимуляцию может играть определяющую роль в выполнении функций в нейронной сети. Нейроглиаформные клетки коры крысы при пороговой синаптической активации будут отвечать только при длительной активации, тогда как транзиентное возбуждение будет отфильтровываться. Для нейроглиаформных клеток обезьяны характерна быстрая частотная адаптация, поэтому эти нейроны, наоборот, будут генерировать спайки чаще в начале действия стимула.
У быстроразряжающихся корзинчатых клеток крысы в ходе продолжающейся деполяризации мембраны спайковый ответ часто прерывается молчащими периодами, тогда как клетки обезьяны отвечают без перерывов. Иррегулярность спайкового ответа у крысы по всей вероятности связана с работой низкопороговых потенциалзависимых калиевых каналов Kvl типа, так как их блокада специфическим антагонистом дендротоксином приводила к исчезновению молчащих периодов. Так как спаиковая активность нейрона возникает в ответ на приходящее синаптическое возбуждение, то наличие молчащих периодов может искажать передачу информацию в нейронных сетях.
Выявленные электрофизиологические различия между гомологичными типами интернейронов позволяют лучше понять различия в функционировании префронтальной коры, обнаруженные в экспериментах in vivo при изучении оперативной памяти. Например, «клетки памяти» префронтальной коры, остающиеся активными в течение периода задержки в тестах на оперативную память, генерируют потенциалы действия с меньшей частотой у крысы, чем у обезьяны, это справедливо как для пирамидных клеток, так и для интернейронов [63, 68, 394].
Полученные результаты свидетельствуют, что даже морфологически схожие интернейроны, по крайней мере по ряду электрофизиологических свойств, различаются у разных видов, что указывает на необходимость более осторожной экстраполяции данных от грызунов к приматам, и, в конечном счете, к людям.
Нейроны префронтальной коры получают основные возбуждающие входы от пирамидных клеток, расположенных локально, либо в других корковых полях того же полушария, либо второго полушария, а также от таламуса [1]. Ранее, на примере соматосенсорной и зрительной коры, было показано, что свойства возбуждающих синаптических входов у интернейронов и пирамидных клеток существенно различаются, что приводит к различиям в порогах возбуждения интернейронов и пирамидных клеток. Так, в экспериментах in vivo, было обнаружено, что в ответ на приходящее возбуждение быстроразряжающиеся интернейроны отвечают с меньшим латентным периодом и при меньшей силе раздражителя, чем пирамидные клетки [395-397]. Такие особенности более раннего вовлечения интернейронов в спайковую активность обусловлены специфическими свойствами их постсинаптических возбуждающих ответов. Возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП) интернейронов обычно больше по амплитуде и имеют более быструю кинетику, чем у пирамидных клеток [392, 393, 398].
В предыдущих исследованиях сенсорных областей коры грызунов были также показаны различия между свойствами возбуждающих ответов в быстроразряжающихся интернейронах и пирамидных клетках, записанных в синаптически соединенных парах пирамида -быстроразряжающийся интернейрон, пирамида - пирамида [399, 400].
Тем не менее, простая экстраполяция этих результатов на префронтальную кору приматов невозможна в силу того, что нейроны приматов имеют ряд отличий от нейронов грызунов. В частности, быстроразряжающиеся интернейроны макаки обладают большей возбудимостью, обусловленной большим входным сопротивлением мембраны и меньшим порогом возникновения потенциала действия, чем у крысы. (Глава 5). Поэтому основной задачей данной работы стало проведение сравнения свойств возбуждающих входов к пирамидным клеткам и быстроразряжающимся интернейронам в префронтальной коре обезьяны и крысы. Для этого регистрировали миниатюрные ВПСП/ВПСТ, ВПСП, вызванные внеклеточной стимуляцией и ВПСП в соединенных парах пирамидных клеток и интернейронов. Также были изучены механизмы, лежащие в основе упреждающего дисинаптического торможения.
Свойства миниатюрных ВПСП и ВПСТ пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов у обезьян и крыс
Для сравнения возбуждающих входов пирамидных клеток и быстроразряжающихся интернейронов крысы и обезьяны была проведена регистрация миниатюрных ВПСП, возникающих в результате спонтанного выделения глутамата в синаптическом окончании. Чтобы исключить постсинаптические события, вызванные потенциалами действия, во всех экспериментах во внеклеточный раствор добавлялся тетродотоксин (0.5 мкМ) (Рис. 62).
