Введение к работе
Актуальность проблемы
Болезнь Альцгеймера (БА) - наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание людей пожилого и старческого возраста, которое характеризуется прогрессивным нарушением памяти и деменцией. Одним из ключевых факторов в патогенезе БА являются бета-амилоидные пептиды (A) 39-43, которые образуются в результате последовательного внутримембранного амилоидогенного протеолиза белка предшественника бета-амилоида - и - секретазами. В норме тоже образуются эти пептидные фрагменты, однако при патологии их концентрация сильно возрастает, они начинают полимеризоваться и приобретают токсические свойства. Нейротоксическое действие растворимых олигомеров A и их фибрилл приводит к гибели синапсов и нейронов в гиппокампе и неокортексе (Haass and Selkoe, 2007; Selkoe, 2008; Citron, 2010).
Существенный вклад в патогенез ранних стадий БА вносит окислительный стресс, индуцированный A (Kaminsky et al., 2010; Степаничев и Гуляева, 2010; Nunomura et al., 2001), основной мишенью которого являются компоненты белкового синтеза (мРНК, рибосомы, тРНК и хроматин) (Shan et al., 2007; Ding et al., 2007).
Одним из ранних симптомов БА является прогрессирующее нарушение оперативной и эпизодической памяти, в том числе пространственной памяти (Burgess et al., 2001; Lindeboom and Weinstein, 2004). На моделях БА широко применяется изучение пространственной памяти в водном лабиринте Морриса с использованием разнообразных протоколов обучения (Morris, 2001; Chen et al. 2000; D’Hooge and De Deyn, 2001; Bast et al., 2009; Подольский и Щеглов, 2004; Podolski et al., 2007).
Ни одна из современных экспериментальных моделей БА не является универсальной. Введение в центральную нервную систему (в желудочки мозга, непосредственно в гиппокамп или в кору) агрегированного бета-амилоидного пептида или его токсического фрагмента А25-35 позволяет исследовать непосредственно его действие на морфофункциональное состояние нейронов и когнитивные процессы (Selkoe, 2008; Stepanichev et al., 2000). Исследование ранних нейротоксических эффектов центрального введения A играет важную роль в понимании патогенеза БА и представляет большой интерес для изучения антиамилоидного действия лекарственных средств (Fiala, 2007; Haass and Selkoe, 2007; Makarova et al., 2011; Podolski et al., 2010; Nie et al., 2010).
Лечение БА - наиболее сложная проблема психиатрии и неврологии. Несмотря на интенсивные исследования многих ведущих лабораторий мира лекарства, тормозящие развитие или вызывающие долговременные ремиссии БА отсутствуют. Новым направлением в разработке лекарств для лечения БА являются фуллерены С60. Международные фармацевтические компании, C Sixty and Merck Co., начали разработку на основе фуллеренов антиоксидантов и лекарств для терапии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний (Small times magazine, 2007). Одними из наиболее перспективных являются подходы, нацеленные на создание антиамилоидных лекарственных веществ, предупреждающих образование и агрегацию A (Citron, 2010; Scherzer-Attali et al., 2010). Однако фуллеренам не уделялось внимание в этих исследованиях.
Фуллерены C60 – углеродные наночастицы с уникальными физико-химическими и биологическими свойствами. Одним из основных биологических свойств C60 является способность присоединять реактивные формы кислорода и вести себя как «губка свободных радикалов» (Krusic et al., 1991; Piotrovsky and Kiselev, 2006; Andrievsky et al., 2009; Ali et al., 2008). В ряде работ показано, что фуллерены накапливаются в печени, селезенке и других органах экспериментальных животных (Yamago et al, 1995; Bullard-Dillard et al, 1996; Kubota et al, 2011). Фуллерены могут выводиться из организма (Yamago et al, 1995; Gharbi et al., 2005). Фуллерены действуют на разнообразные клеточные и молекулярные мишени (Piotrovsky and Kiselev, 2006; Dugan et al., 1997; Huang et al., 2000).
Флуоресцентный анализ in vitro показал, что производное фуллерена эффективно снижает агрегацию A1-40. Авторы объяснили такой эффект связыванием фуллереном центрального гидрофобного мотива A KLVFF (Kim and Lee, 2003). Недавно методом высокоразрешающей электронной микроскопии было показано, что фуллерены C60 способны предотвращать агрегацию и разрушать A25-35 и A1-42 фибриллы (Подлубная и др., 2006; Podolski et al., 2007; Бобылев и др., 2010; Bobylev et al., 2011). Эти данные позволили нам предположить, что A пептиды представляют собой одну из мишеней для фуллерена (Podolski et al., 2010). Однако не было известно, будут ли фуллерены защищать нейроны от токсического действия A in vivo.
Таким образом, многие принципиальные вопросы остаются открытыми. Действие фуллеренов С60 на экспериментальных моделях БА in vivo не были изучены. Особый интерес представляет исследование действия фуллеренов на амилоидогенез, нейродегенерацию, синтез белка в нейронах и состояние пространственной памяти на ранних стадиях действия А.
Цели и задачи исследования
Целью работы являлось исследование способности водорастворимого фуллерена С60 предупреждать нейротоксичность бета-амилоида in vivo.
Задачи исследования:
1. Исследовать влияние предварительного введения С60HyFn на пространственную память при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса, морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа и синтез белка в этих нейронах, нарушенные на ранней стадии после интравентрикулярного введения агрегированного А25-35 у крыс.
2. Исследовать влияние предварительной инкубации переживающих срезов гиппокампа в среде, содержащей С60HyFn, на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа, нарушенное инкубацией с А25-35.
3. Исследовать влияние предварительного введения С60HyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа и синтез белка в этих нейронах, нарушенные на ранней стадии после интрагиппокампальной микроинъекции А25-35.
4. Исследовать влияние предварительного введения С60HyFn на пространственное обучение и память, нарушенные в результате интрагиппокампальной микроинъекции А1-42.
Научная новизна
Впервые обнаружено, что предварительное введение водорастворимого фуллерена С60 в гиппокамп предупреждает сильные нарушения пространственной памяти, развитие нейродегенерации, образование депозитов А и нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванные интрагиппокампальной микроинъекцией агрегированного А.
Показана разная динамика нарушения синтеза белка, морфологических изменений, образования депозитов A в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа и нарушения пространственной памяти после интравентрикулярной и интрагиппокампальной микроинъекций агрегированного A. Продемонстрировано, что интрагиппокампальное введение A приводит к более раннему развитию выраженных нейродегенеративных и когнитивных нарушений, чем интравентрикулярное введение.
Научно-практическая значимость работы
Полученные результаты показали, что С60 гидратированный фуллерен (С60HyFn) предупреждает нарушение пространственной памяти, развитие нейродегенерации и нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванные интрагиппокампальной микроинъекцией А. Эти результаты подтверждают заключение нашей группы, что водорастворимые фуллерены С60 представляют чрезвычайный интерес для разработки эффективной профилактики и терапии БА.
Показано преимущество интрагиппокампальной микроинъекции A для исследования ранних цитологических нарушений в гиппокампе и нарушения когнитивных функций по сравнению с интравентрикулярным введением.
Обнаружено, что нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванное интрагиппокампальной микроинъекцией A, происходит гораздо раньше проявления других нейротоксических свойств A и, по-видимому, связано с развитием окислительного стресса.
Материалы диссертационной работы вошли в учебный видеофильм «Нейрон и Память», ред. Ф.А. Филиппов, А.М. Черноризов. Министерство образования и науки России, Тюмень-Москва, 2009. /
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены на 7-ом и 8-ом Международных симпозиумах «Фуллерены и Атомные кластеры» (Санкт-Петербург, 2005, 2007), конференциях по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» (Москва, 2006, 2007, 2010). Международном симпозиуме «Гиппокамп и память» (Пущино, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология (Пущино, 2009), 37-ом Neuroscience Meeting, (Сан-Диего, Калифорния, 2007), 6-ом Международном Форуме FENS Forum of European Neuroscience (Женева, Швейцария, 2008), III и VII Международных и Междисциплинарных Конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007, 2011), Всеукраинской конференции «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Днепропетровск, 2008), Международном форуме «Rusnanotech» (Москва, 2010), 9-ой Международной конференции AD/PD «Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases: Advances, Concepts and New Challenges» (Прага, Чехия, 2009), 1-ой Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Москва, 2009), 10-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука ХХI века» (Пущино, 2006).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ___ страницах, иллюстрирована ___ рисунками и ___ таблицами. Список литературы включает ___ источников.
