Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Структурно-функциональные особенности эритроцитов и гемоглобина млекопитающих 10
1.1.1. Структура мембраны эритроцита 10
1.1.2. Осмотическая и кислотная резистентность эритроцитов 12
1.1.3. Структура и гетерогенность гемоглобина млекопитающих 16
1.2. Экдистероиды: краткая характеристика 21
1.3. Биологическая активность экдистероидов у позвоночных животных 23
1.4. Влияние фитоэкдистероидов на систему крови теплокровных 32
2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Материалы исследования 36
2.2. Реактивы и оборудование 36
2.3. Методы исследования 38
3. Результаты исследования 46
3.1. Параметры крови крыс линии Wistar при экспериментальной гемолитической анемии и при действии ЭС Серпистен 46
3.1.1. Показатели крови крыс при развитии гемолитической анемии и влиянии на них ЭС Серпистен 47
3.1.2, Характер восстановления крови крыс при гемолитической анемии под влиянием предварительного введения ЭС Серпистен, 67
3.2. Динамика восстановления параметров крови кроликов после кровопускания при влиянии ЭС Серпистен 92
3.3. Состояние эритроцитов и гемоглобина крови лабораторных животных при однократном введении ЭС Серпистен 111
3.3.1. Нелинейные лабораторные крысы 111
3.3.2. Мыши линии СВА 132
3.3.3. Нелинейные белые лабораторные мыши 137
3.3.4. Кролики породы Шиншилла 146
3.4. Свойства эритроцитов и гемоглобина крови нелинейных белых крыс при многократном введении ЭС Серпистен 152
4. Обсуждение результатов 156
4.1. Возможный механизм действия фитоэкдистероидов при гемолитической анемии 156
4.2. Роль фитоэкдистероидов в регенерации крови в условиях постгеморрагической анемии 165
4.3. Свойства некоторых компонетов крови лабораторных животных при действии фитоэкдистероидов 170
Выводы 177
Литература
- Структурно-функциональные особенности эритроцитов и гемоглобина млекопитающих
- Структура и гетерогенность гемоглобина млекопитающих
- Показатели крови крыс при развитии гемолитической анемии и влиянии на них ЭС Серпистен
- Возможный механизм действия фитоэкдистероидов при гемолитической анемии
Введение к работе
В природных и производственных условиях нашего времени организм нередко испытывает влияние необычных, чрезмерных и жестких факторов среды. Адаптация к ним может носить самый различный характер и затрагивать все стороны организации и жизнедеятельности человека и животных. Такую адаптацию можно охарактеризовать как совокупность биологических, социальных и психологических свойств и особенностей, необходимых для существования организма в конкретной экологической среде обитания (Н.А. Агаджанян и соавт., 1997; Н.А. Агаджанян, Н.А. Ермакова, 1997). Неспецифическую сопротивляемость организма можно повысить с помощью физиологически активных соединений природного происхождения адаптогенов. Актуальной задачей современной физиологии является выяснение роли этих веществ в обменных процессах. В настоящее время исследуют, как наиболее перспективные, вещества подобного рода - экдистероиды. Эти соединения выполняют функции гормонов линьки у животных (беспозвоночных), стоящих на низших ступенях эволюции, играя существенную роль в регуляции клеточного метаболизма на разных этапах их роста и развития. Для теплокровных животных экдистероиды не являются эндогенными. Тем не менее, многие стороны обменных процессов в клетках и органах высших животных восприимчивы к действию экдистероидов в большей степени, чем ко многим другим веществам растительного происхождения (А.А. Ахрем, Н.В. Ковганко, 1989). В то время как сравнительные эксперименты с кортизолом млекопитающих, не показали его активности у насекомых. Это можно объяснить тем, что гормональная система млекопитающих является более узкоспециализированной и не может вызывать соответствующих эффектов у низших организмов. Более же примитивная гормональная система насекомых, влияя на общие стороны метаболизма клетки, сохраняет свою активность и у высших организмов (В.В. Володин, 2006). Экдистероиды обнаружены у представителей более 80 семейств высших
растений (Р. Лафон, 1998; R. Bergamasco, D.H. Horn, 1983). Выявление растений с высоким содержанием экдистероидов (до 1-2% сухой массы) дало возможность создания экономически целесообразных технологий получения этих веществ и, таким образом, открыло перспективу их практического применения в народнохозяйственной практике: медицине, ветеринарии и т.д. (В.В. Володин, 1999; Фитоэкдистероиды, 2003; R. Lafont, 1997; V.V. Volodin et al., 2002). Лекарственные препараты, созданные на основе растительных веществ, имеют ряд преимуществ: низкую токсичность, широкий спектр действия, отсутствие привыкания, такие соединения легко включаются в метаболизм, усваиваются организмом, выводятся из него и являются сравнительно экологически чистыми. Известно, что фитоэкдистероиды оказывают анаболическое (И.Н. Тодоров и соавт., 2000), адаптогенное и тонизирующее (Н.К. Абубакиров и соавт., 1988; А.П. Азизов, 1997; Р.Д. Сейфулла, 1998), кардиотропное и иммуномодулирующее действие (М.М. Маликов и соавт., 1982; Г.Н. Фомовская и соавт., 1992; D.S. Trenin, V.V. Volodin, 1996), а так же обладают свойствами антирадикального агента и антиоксиданта (Л.Ф. Осинская и соавт., 1992). Особого внимания заслуживают результаты исследований, показавших высокую эффективность фитоэкдистероидов при некоторых патологических состояниях, сопровождающихся ослаблением белкового и других обменов: гепатит, диабет и др. (О.А. Ермишина и соавт., 1982; В.Н. Сыров и соавт., 1986). Показан положительный эффект фитоэкдистероидов на гемореологию при синдроме повышенной вязкости крови (М.Б. Плотников и соавт., 2000). Этот класс соединений является одним из немногих классов стероидов, не оказывающих гормональных эффектов на млекопитающих (К. Slama, R. Lafont, 1996; R. Lafont, L. Dinan, 2003). Однако многие стороны действия этих веществ, в частности, на систему крови, остаются либо не изученными, либо носят отрывочный, эпизодичный характер. Выяснение влияния этих веществ на систему крови очень важно, так как кровь является интегральной системой, связывающей воедино и затрагивающей все органы и ткани, поэтому изменение
её состояния может сказаться на работе функциональных систем организма в целом (Г. И. Козинец, 1990). Клетки крови одними из первых встречаются с веществами как экзогенного, так и эндогенного происхождения и чутко реагируют на изменения, происходящие в организме, а стабилизация физиологических реакций, ответственных за доставку и обмен газов в тканях является одним из критериев адаптации (Н.А. Агаджанян, 1989). Цель исследования.
Целью настоящей работы является исследование морфо-функциональных свойств эритроцитов (Эр) и гемоглобина (НЬ) лабораторных животных при действии экдистероидсодержащей субстанции Серпистен (смесь фитоэкдистероидов) в норме и в условиях анемии.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Охарактеризовать параметры крови лабораторных животных после развития экспериментальной гемолитической фенилгидразиновой анемии при введении ЭС Серпистен.
Исследовать особенности развития гемолитической анемии на фоне предварительного курсового введения ЭС Серпистен.
Исследовать динамику и характер восстановления параметров крови млекопитающих в условиях постгеморрагической анемии и при действии ЭС Серпистен.
Изучить влияние режима и дозы введения ЭС Серпистен на показатели и свойства Эр и НЬ, в зависимости от пола и возраста животного, сезона исследования.
Исследовать в опытах in vitro щелочерезистентность (ЩР) и электрофоретические свойства НЬ эритроцитарной массы и НЬ гемолизата крови нелинейных белых крыс при действии ЭС Серпистен.
Научная новизна.
Впервые показано стимулирующее эритропоэз действие ЭС Серпистен, что выражается в увеличении относительного и абсолютного количества ретикулоцитов (Rt), ускорении созревания циркулирующих в русле крови Rt,
сопровождающееся уменьшением количества в клетках ретикуло-филаментозной субстанции, что является отражением процесса стимуляции биосинтеза НЬ.
Впервые показано стабилизирующее действие фитоэкдистероидов на мембрану Эр в реакциях осмотического и кислотного гемолиза, и опосредованное мембраной стабилизирующее действие их на содержащийся в клетках НЬ.
Впервые показано нормализующее действие ЭС Серпистен на кислотно-основное состояние крови лабораторных животных.
Морфология Эр крыс, мышей и кроликов модифицируется при введении ЭС Серпистен.
Впервые показан защитный эффект вещества на Эр при постгеморрагической (кролики) и экспериментальной гемолитической (фенилгидразин (ФГ), крысы) анемиях: уменьшение уровня Эр с тельцами Гейнца у животных с вызванной гемолитической анемией как при предварительном введении препарата, так и на фоне развивающейся анемии.
В опытах с кровопусканием на кроликах показан антистрессовый и адаптогенный эффекты ЭС Серпистен. Ретикулоцитоз (один из показателей стресса) наименее выражен у животных, получавших ЭС Серпистен. Научно-практическая значимость.
Полученные результаты по влиянию фитоэкдистероидов на кровь лабораторных животных несомненно найдут своё место в понимании физиолого-биохимических механизмов действия вещества в организме млекопитающих, а также при разработке лекарственных препаратов и (или) биологически активных пищевых (кормовых) добавок.
На основании проведенного исследования ЭС Серпистен можно рассматривать как гематопротекторное средство при приобретенной гемолитической анемии и острой кровопотере. В результате проведенного исследования расширено представление о влиянии фитоэкдистероидов на кровь млекопитающих, предложен возможный механизм действия этих веществ.
Основные положения, выносимые на защиту:
Усиление и ускорение регенерации крови в условиях анемии может быть достигнуто введением ЭС Серпистен.
При анемиях и в норме ЭС Серпистен оказывает мембраностабилизирующее действие на поверхностную мембрану Эр лабораторных животных. Эффект зависит от вида, пола и возраста животного, от дозы вводимого вещества, а так же сезона, в котором проводилось исследование.
В условиях in vitro и iv vivo изменяются физико-химические свойства НЬ: относительная электрофоретическая подвижность отдельных фракций НЬ (ОЭФП) и щелочерезистентность НЬ при влиянии ЭС Серпистен. Эффект опосредован поверхностной мембраной Эр и зависит от вида, пола животных и сезона исследования.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на XVIII Съезде физиологического общества (г. Казань, 2001); научной конференции «Экологическая ботаника: наука, образование, прикладные аспекты» (г. Сыктывкар, 2002); Симпозиуме с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды» (г. Ульяновск, 2002); II конференции «Медицинские, социальные и экономические проблемы сохранения здоровья населения» (Турция, г. Анталия, 2004); XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Екатеринбург, 2004); IV Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (г. Сыктывкар, 2005); IX Международном Съезде «Фитофарм 2005» (г. Санкт-Петербург, 2005); IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (г. Сыктывкар, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы, из них 5 статей.
Структурно-функциональные особенности эритроцитов и гемоглобина млекопитающих
Эр - высокоспециализированная клетка периферической крови, содержащая важнейший дыхательный пигмент НЬ и обеспечивающая доставку кислорода от легочных альвеол ко всем клеткам тела и углекислоты от клеток к легким. Поддержание на достаточном уровне общей массы Эр осуществляется системой эритрона - сложного комплекса клеток, со сложными путями их взаимодействия, включающего в себя ранние клетки-предшественники, ядросодержащие клетки эритроидного ряда костного мозга на разных этапах дифференцировки, Rt и зрелые Эр (Ю.М. Захаров и соавт., 2004). Эр составляют популяцию, в которую в определенных сочетаниях входят клетки различного размера, возраста, физико-химических свойств, с разным содержанием НЬ и его дериватов (Л.И. Иржак, 2003). Важным свойством Эр является их способность к деформации. При циркуляции крови Эр, взаимодействуя друг с другом и со стенками сосуда, без потери нативности могут удлиняться, перегибаться, закручиваться (В.В. Новицкий и соавт., 2004; С.А. Сторожок и соавт., 1997). Форма Эр и их высокая деформируемость играют важную роль в выполняемых ими функциях и имеют непосредственное отношение к газообмену (A.M. Казеннов, М.Н. Маслова, 1987; В.В. Зинчук, 2001). Эр в форме двояковогнутого диска характеризуются высоким отношением площади поверхности к объему. Объем, соответствующий диску, может умеренно изменяться без растяжения клеточной мембраны, что обусловливает высокую деформируемость Эр. Поэтому от формы Эр частично зависит их стойкость к осмотическому гемолизу, к аутогемолизу и, в меньшей степени, к механической травме. Поверхностная мембрана - важнейший элемент любой клетки, участвующий во многих обменных процессах. Плазматическая мембрана Эр -наиболее сложная природная мембрана и тем не менее изучена сравнительно детально. Строение её в принципе согласуется с общепринятой моделью строения биологической мембраны С. Зингера, Дж. Николсона (1972). Причиной сложных механических свойств мембраны Эр является специфика её строения, которая состоит в том, что она фактически включает две структурные единицы: мембранный бислой и мембранный скелет из периферических белков (A.M. Казеннов, М.Н. Маслова, 1987; М.М. Козлов и соавт., 1989). В среднем 40% сухой массы мембраны Эр составляют липиды (В.К. Рыбальченко, М.М. Коганов, 1988). Их можно разделить на три группы: нейтральные (глицериды, холестерин, причем в мембране обнаружена гетерогенность в распределении холестерина, что может быть обусловлено неравномерным распределением его в мембране и наличием двух его пулов (Е.Г. Попова, Т.М. Повалий, 1991), гликолипиды и фосфолипиды. Липиды играют фундаментальную роль в регуляции метаболизма клетки, в передаче и хранении энергии, определяют активность мембрано-связанных ферментов, определяют проницаемость для ионов, и, следовательно, осмотические и электрические свойства клетки. В мембране Эр обнаружено много простых и сложных белков, два основных -белок полосы 3 и гликофорин А, остальные минорные (А.А. Болдырев и соавт., 1990; О.И. Моисеева, 1985). Мембрана асимметрична, что проявляется прежде всего в асимметричном расположении липидов в разных слоях мембраны: в наружном содержится больше фосфатидилхолина, во внутреннем фосфатидилэтоноламина и фосфатидилсерина. Такая асимметрия обеспечивается во-первых разностью состава цитоплазмы и внешней среды, а во-вторых, ферментами липидного обмена и липидпереносящими белками (А.А. Болдырев и соавт., 1990, Р. Геннис, 1997). Асимметрично в бислое располагаются и мембранные белки. Фосфолипидный состав мембран непостоянен. Он может меняться в зависимости от сезона и режима питания, в ходе развития и дифференцировки клетки (В.Г. Ивков, Г.Н. Берестовский, 1982). Выявлена положительная корреляция между увеличением процентного содержания фосфатидилсерина в Эр во время оксигенации и артериовенозной разностью по кислороду при острой кровопотере (О.В. Каплан, 1996), между объемом транспорта воды через мембрану Эр и содержанием в ней сфингомиелина (G. Benga, Т. Borza, 1995). Отмечено уменьшение доли фосфатидилэнаноламина, увеличение доли фосфатидилхолина в Эр полевок-экономок, находящихся на территории с повышенным уровнем радиации (А.Г. Кудяшева и соавт., 2003). Цитоскелет Эр состоит из элементарных ячеек, каждая имеет ядро - актин, с которым соединено несколько длинных тяжей -спектриновых гетеродимеров. Ячейки связываются в единую сеть при химическом соединении с анкирином (М.М. Козлов, В.Л. Маркин, 1986). Цитоскелет способствует сохранению формы Эр, позволяет клетке проходить через капилляры, диаметр которых уже ее собственного. В основе цитоскелета Эр белки полос 1 и 2 (а- и (3- цепи спектрина), связанные с актиновыми филаментами посредством адуцина (С.Н. Орлов и соавт., 1997). С актином связан АДФ (А. Фултон, 1987). Анкирин - бифункциональный белок, он способен взаимодействовать и с микротрубочками и с [3-цепями спектрина. Белки 4.1 и 4.2 (паладин) участвуют во взаимодействии гликофорина с актиновыми филаментами в местах их стыковки со спектриновой сетью. Положение различных частей мембраны Эр по отношению к форме клетки, вероятно, не фиксировано: часть мембраны, которая в данный момента расположена в центре клетки, в другой момент может оказаться на периферии (Э. Бойтлер, 1981; М. Bessis, N. Mohandas, 1975). Эр имеют рецепторы к трансферрину, витамину Е, компонентам комплемента, некоторым гормонам и другим веществам (Л.П. Бобова и соавт., 2003).
Структура и гетерогенность гемоглобина млекопитающих
Свою основную функцию - транспорт ( и СОг - Эр осуществляют благодаря наличию в них НЬ, составляющего около 95% белка Эр. НЬ относится к группе хромопротеидов. Он способен взаимодействовать со многими веществами - лигандами. Одни лиганды присоединяются к макромолекуле в области гема, другие - в различных участках глобина. Присоединяя и отдавая лиганды, НЬ изменяет свою пространственную, объемную конфигурацию - конформацию, отчего существенно изменяются физико-химические и функциональные свойства молекулы.
НЬ в эволюции возник на сравнительно поздних её стадиях и принадлежит, главным образом, позвоночным животным. Количество НЬ в клетках крови максимально у млекопитающих. У всех позвоночных молекула НЬ состоит из 4-х субъединиц, каждая из которых представлена белковой частью — глобином и присоединенной к нему группой гема (производное порфирина, которое содержит железо в центре порфиринового кольца) (П.А. Коржуев, 1964; Л.И. Иржак, 1975; А. Терней, 1981). Порфириновое кольцо взаимодействует с глобином за счет электростатического взаимодействия (A.M. Cianciarullo et al., 2003)
Каждая субъединица НЬ (М=68000) имеет М= 17000. Выяснены первичная, вторичная и третичная структуры субъединиц молекулы НЬ. Они оказались попарно идентичными и были названы субъединицами типа а и р.
Субъединица типа а представлена у человека полипептидной цепью из 141 аминокислотного остатка, р - из 146. Третичная структура их сходна. Таким образом, 4 субъединицы (2а, 2р) соединяются в единую молекулу НЬ, располагаясь в узлах почти правильного тетраэдра. Возникает почти шаровидная молекула с параметрами 0,50x0,55x0,64 нм. Находясь в четвертичной структуре, молекула НЬ встраивается в состав Эр, образуя прочный комплекс с эритроцитарной мембраной (Л.И. Иржак, 1975). Свойства НЬ, находящегося в растворе и цельной крови, неодинаковы. Основной причиной этого служат Эр, от свойств которых зависит в конечном счете количество кислорода и углекислоты, связываемых кровью. Содержание Эр в крови и их свойства изменяются на протяжении онтогенеза (Л.И. Иржак, 1975). Сам по себе НЬ - неоднородная структура. С помощью электрофореза и других методов фракционирования белков НЬ делится на отдельные компоненты - фракции. В основе способности к делению лежит молекулярная гетерогенность НЬ. Последняя создается отчасти, как артефакт в силу того, что во время эксперимента НЬ может диссоциировать на ди- и мономеры (субъединицы) и образовывать комплексы друг с другом, с компонентами буферных сред, с лекарственными препаратами и т.д. Эти свойства проявляются по-разному в зависимости от молекулярной природы НЬ, от условий среды, отчего количество фракций в электрическом поле может варьироваться. Это так называемая наведенная или искусственная (артефактная) гетерогенность (Л.И. Иржак, 1975). Наряду с искусственно вызванной гетерогенностью существует реальная гетерогенность НЬ, обусловленная одновременным или последовательным синтезом нескольких молекулярных вариантов этого вещества. Содержание двух и более фракций НЬ в крови зрелого организма означает постоянную (истинную) гетерогенность этого белка. Наряду с ней существует временная (переходная) гетерогенность за счет изменения числа фракций с возрастом организма. В экспериментах сравнивают число фракций, количество содержащегося в них белка, физико-химические и функциональные свойства изолированных фракций белка. На основании этих сведений складывается представление об общей, усредненной функции всего Hb-го комплекса (Л.И. Иржак, 1975; Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко, 1987). У взрослых мышей синтез НЬ контролируется двумя семействами генов: НЬ а, расположенными в 11-ой хромосоме, и Hb b - в 7-ой хромосоме (Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко, 1987). Семейство генов Hb Ь, координирующие синтез Р-цепей, может быть представлено тремя локусами: s, d и р. Гаплотип с локусом s продуцирует гомогенные 3-цепи. Локусы d и р контролируют синтез идентичных pd-major и pp-minor цепей глобина. У пяти гаплотипов животных обнаружены семейства генов НЬ а, контролирующих синтез а-цепей. А.А. Стрекалов (1967) предлагает взрослых линейных мышей делить на две основные группы: линии с гомогенным Hb (Hb s) и линии с диффузным Hb (НЬ d). С помощью различных методов электрофореза и хроматографии из НЬ мышей выделено от 1 до 3 фракций (линии с Hb s) и от 2 до 6 фракций (линии с Hb d). Л.И. Иржаком (1975) отмечено наличие одиночного или диффузного типов НЬ, не делящихся на фракции и оговорено, что за кажущейся однородностью НЬ мыши можно рассмотреть известную степень гетерогенности. НЬ мышей, принадлежащих к тому или иному гемотипу (А.А. Стрекалов, 1967), различаются по целому ряду физико-химических характеристик.
Показатели крови крыс при развитии гемолитической анемии и влиянии на них ЭС Серпистен
Важную роль в приспособлении организма животных и человека к окружающей среде выполняет газотранспортная функция крови. Она обеспечивает адаптацию организма прежде всего на клеточном (за счет Эр) и молекулярном (НЬ) уровнях, которые в свою очередь тесно связаны с особенностями гемодинамики и органами дыхания. Показателями функциональной активности Эр являются, в частности, их деформируемость и агрегационный потенциал, характеризующие способность клеток проникать в микроциркуляторное русло для осуществления газообмена, что в свою очередь зависит от состояния их мембраны (С.А. Сторожок и соавт., 1997; В.В. Новицкий и соавт., 2004). Особенно важно изучение механизмов изменения свойств Эр и НЬ при гипоксических состояниях, сопровождающихся недостатком кислорода в тканях, как например, при развитии гемолитических анемий. Причиной нарушения нормального функционирования Эр и НЬ, считается нарушение кислородсвязывающей способности НЬ в связи с окислением гемового железа в трехвалентное (M.D. Tingle et al., 1990; S.J. Grossman et al., 1992). Среди веществ способных стимулировать окисление НЬ, внутрисосудистый гемолиз, можно выделить производные гидразина (гидразиды, гидразоны, диметиламин, ФГ, монометилгидразин), гидроксиламин и др. (Н.А. Богданов, 1970; А.А. Белов, 2000). Эти вещества нашли широкое применение в различных отраслях промышленности, сельском хозяйстве, медицине (Г.Н. Проданчук, Г.М. Балан, 2005).
В наших экспериментах ФГ был использован как мощный яд и гемолитик, как фактор вызывающий гиперрегенераторную реакцию (ретикулоцитоз) со стороны системы крови (Л.И. Дворецкий, 2002), Проведены несколько серий эксперимента с вызванной гемолитической анемией на крысах линии Wistar. При этом экдистероидсодержащую субстанцию Серпистен (ЭС) вводили как до введения ФГ, так и на фоне уже развивающейся анемии.
По данным нашего исследования концентрация общего НЬ в крови интактных крыс линии Wistar в среднем (независимо от сезона и пола животных) составила 118,9±2,31 г/л, что соответствует данным А.А. Кудрявцева и Л.А Кудрявцевой (1974). По D.B. Morton et al. (1993) этот показатель находится в пределах 120-180 г/л, что несколько превышает полученный в данном исследовании. Показатель Гт в данной работе составил 38,3±0,5%, что соответствует данным D.B. Morton et al. (1993), у которых он находится в пределах 35-45%, и несколько ниже, чем у Е. Станчевой и соавт. (2003). Концентрация Эр, полученная нами, составила 4,40±0,09 1012/л, что ниже данных полученных другими авторами: 5,5-6,5 млн/мм3 (А.А. Кудрявцев, Л.А. Кудрявцева, 1974); 6,88±0,78 млн/мм3 (Е. Станчева и соавт., 2003); 4,5-6,5 млн/мм (СП. Куротченко и соавт., 2003); 7,2-9,6 млн/мм (D.B. Morton et al., 1993). Концентрация Rt в наших исследованиях составила 24,27±2,8%о, что совпадает с данными D.B. Morton et al. (1993) - 1,4 - 21,1 %о и Е. Станчевой и др. (2003) - 222,41±19,84 109/л, но несколько выше 1-2% (СП. Куротченко и соавт., 2003).
В первой серии эксперимента использовали крыс линии Wistar (только самцы, п=36), ЭС (однократно, доза 20 мг/кг) вводили на третьи сутки развития анемии. На 6-е сутки крыс декапитировали.
Показано, что у крыс контрольной группы №2 (введен только ФГ) снижены концентрация Эр (р 0,01) и показатель Гт (р 0,01) по сравнению с интактной группой (табл.4). При этом отмечается тенденция (с вероятностью более 90%) к снижению концентрации общего НЬ в крови, увеличение абсолютной ( 10 /л) и относительной (%о) концентрации Rt (р 0,01 и р 0,01, соответственно), появление Rt II стадии зрелости по Гейльмейеру, отсутствующих в норме у интактных крыс. Кроме того, появляются Эр, содержащие тельца Гейнца. Такие Эр в конечном итоге подвергнутся лизису in vivo.
Все эти изменения указывают на то, что в крови животных развилась анемия. Известно, что доля Эр с тельцами Гейнца, характерных для гемолитических анемий, является индикатором глубины анемии (Я.Г. Ужанский, 1968). Наряду с этими изменениями у крыс отмечено увеличение среднеклеточного диаметра Эр по сравнению с крысами интактной группы. Такое увеличение диаметра Эр - характерный признак макроцитарной анемии, когда в мазках крови присутствуют (9% и более от общего числа клеток) Эр большого диаметра ( 8,1 мкм). Макроцитоз сопровождается увеличение площади поверхности Эр (ПП) среднеклеточного объема Эр (СрОЭ) (до мкм ) и, соответственно, среднеклеточного содержания НЬ в одном Эр (до 32 пг) (ССЭ) (Исследование системы..., 1996), что обнаружено нами у крыс контрольной группы №2. Увеличение СрОЭ обычно связано с уменьшением концентрации Эр. Дело в том, что известна отрицательная корреляция между количеством и средним объемом Эр у крыс (В.Б. Матюшичев и соавт., 2000). Взаимозависимость этих параметров связана с реологией крови. Действительно, мы наблюдаем уменьшение вязкости крови крыс контрольной группы №2. Известно (Л.Н. Катюхин, 1995), что вязкость крови зависит от концентрации в ней Эр и НЬ. Снижение этих показателей и повлекло за собой уменьшение вязкости крови в наших экспериментах. Кроме того, отмечено некоторое увеличение СОЭ крови крыс контрольной группы №2 по сравнению с интактной (р 0,1), что так же может быть связано со снижением концентрации Эр и НЬ. Имеются сведения о том, что скорость оседания Эр имеет обратную зависимость от количества НЬ в крови (И.В. Ямайкина, Д.А. Фурманчук, 1999) и Эр (И. Тодоров, 1968). Кроме того известно, что увеличение СОЭ характерно для гемолитических анемий.
Однократное введение ЭС на 4-й день развития анемии практически не сказалось на форме клеток, хотя отмечен сдвиг кривой распределения Эр по диаметру вправо, в сторону клеток большего диаметра (рис.4), вызванный увеличением в популяции доли макроцитов с 9 до 12%. Это отразилось и на СрОЭ и диаметре Эр. Среднеклеточная толщина Эр полностью соответствует таковой у интактных. В ответ на введение 0,9% NaCl (контроль №1) Эр так же увеличились в объеме и среднеклеточной толщине, на фоне тенденции к уменьшению среднеклеточного диаметра, по сравнению с контролем №2.
Все это - свидетельства сферуляции клеток. Доля макроцитов в ответ на 0,9% NaCl тоже возросла, но только на 0,9%. Наблюдаемые эффекты -иллюстрация к разному механизму действия ЭС и 0,9% NaCl на морфологию Эр.
Возможный механизм действия фитоэкдистероидов при гемолитической анемии
Многие эффекты фитоэкдистероидов связывают с геномным действием стероидов (А.В. Коцюруба и соавт., 1993). Ядерный ответ посредством транскрипции определенных генов обычно наступает через несколько дней после введения стероидов. Мы исследовали действие ЭС, который вводили в течение 5 дней в дозе 5 мг/кг, курсовая доза составила 25 мг/кг. Эксперименты проведены на нелинейных крысах обоего пола (п=59).
Параметры крови крыс самцов и самок представлены в табл. 42.
Показано, что при введении крысам-самцам ЭС и 0,9% NaCl вследствие некоторого снижения концентрации Эр (имеющих меньший объем) уменьшается показатель Гт (на 6,8 и 5,9%), соответственно), при этом увеличивается СКГ (на 11,3 и 7,8%) по сравнению с интактными. У контрольной группы животных отмечено увеличение вязкости плазмы (на 5,9%).
У самок опытной и контрольной групп наблюдается более значительное, чем у самцов высокодостоверное уменьшение Гт (на 6,6 и 9,5%, соответственно). Кроме того, у крыс-самок опытной группы повышены СКГ (на 4,4%), вязкость плазмы и СОЭ (на 5 и 55%, соответственно). У крыс-самок контрольной группы снижены концентрация НЬ и СрОЭ (на 5,4 и 9,4%). Наблюдается уменьшение среднеклеточных диаметра и толщины Эр, увеличение индекса сферичности, то есть Эр оказываются более мелкими и плоскими.
Так же как и после однократных инъекций увеличивается доля Rt и их абсолютное содержание в крови в ответ на введение исследуемых растворов (Р 0,2) у самцов. Распределение по стадиям зрелости Rt у самцов опытной и контрольной групп практически такое же, как и у самцов интактнои группы. У самок (рис. 63) в ответ на введение ЭС увеличивается доля Rt III и IV стадий зрелости (на 79,6 и 42,6%, соответственно), снижается доля V (на 13,6%). Для крыс контрольной группы показано увеличение доли Rt III и V стадий зрелости (на 42,4 и 22,4%, соответственно).
Изменения концентрации Rt и распределения их по стадиям зрелости в крови крыс-самок через 5 дней после введения ЭС и 0,9% NaCI. По оси ординат-изменение параметров красной крови в % к интактнои группе,
ПРИНЯТОЙ за 100%. Примечание: - разница достоверна при р 0,1 (с пониженной надежностью); -р 0,05; -р 0,01;апо сравнению с интактнои группой; ь-с контрольной.
ЩР НЬ самцов после введения растворов повышается (рис. 64), особенно выраженное на ЭС. У самок количество ЩР НЬ так же увеличено, но очень незначительно у всех групп крыс по сравнению с интактными.
В ответ на введение 0,9% NaCI ОЭФП всех фракций НЬ крыс самцов достоверно и высоко достоверно увеличивается по сравнению с итактными животными (табл. 43). Почти то же самое мы получаем в ответ ЭС - увеличение ОЭФП всех фракций НЬ, однако, увеличение это недостоверно, то есть ОЭФП фракций НЬ крыс под влиянием ЭС оказывается ближе к исходному уровню. В этом можно видеть адаптогенное действие ЭС.
Анемия - патологическое состояние, характеризующееся в большинстве случаев уменьшением концентрации НЬ и Эр. Часто при этом в крови появляются патологические формы Эр (шизоциты, макроциты, Эр с разными включениями). Гемолитические анемии составляют группу анемий, обусловленных сокращением продолжительности средней жизни Эр (С.Н. Орлов и соавт., 1993). В механизме вызванных, приобретенных анемий (к которым относится фенилгидразиновая) могут играть роль изменения структуры мембраны Эр и содержащегося в них НЬ (Исследование системы..., 1996). Показано, что под действием ФГ в Эр образуется гемихром (продукт катаболизма НЬ). Сродство гемихромов к участку цитоплазматического домена белка полосы 3 выше, чем у нативной формы НЬ. Связывание гемихромов с этими участками мембраны приводит к образованию кластеров и вызывает необратимые изменения в мембране Эр. Этот процесс является сигналом для лизиса Эр in vivo (Т.П. Молчанова, 1989).
Одним из гемотоксических эффектов ФГ является формирование телец Гейнца в Эр. Считается, что это белковые гранулы, образующиеся из денатурирующегося глобина после диссоциации гемопротеида на гем и глобин (Н.М. Василенко, 2002; P. Gross, 1990; A.M. Spooren, СТ. Evelo, 1997). Образованию их обязательно предшествует превращение НЬ в метНЬ, поэтому количество телец обычно зависит от интенсивности токсического воздействия и уровня метНЬ. Тем не менее, далеко не все формы токсических метгемоглобинемий сопровождаются образованием телец Гейнца. В формировании телец Гейнца не исключена роль смешанных дисульфидных образований между глутатионом и НЬ. Показано, что смешанные дисульфидные образования между глутатионом и НЬ могут привести к частичной потере нормальной третичной и четвертичной структуры Hb (A.M. Spooren, СТ. Evelo, 1997; 1998).
