Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Обзор литературы 8
Сетевые свойства гиппокампа в раннем постнатальном периоде развития 8
Сигнальная роль пуринов 11
АТФ рецепторы 12
Аденозиновые рецепторы 14
Глава 3. Материалы и методы 17
Краткое описание структуры гиппокампа 17
Приготовление срезов и электрофизиологическая регистрация ответов в переживающих срезах гиппокампа новорожденных крыс 17
Протокол электрофизиологической регистрации 21
Использование фармакологических веществ 23
Обработка данных по ГДП и спонтанной постсинаптическои активности 25
Статистическая оценка данных 25
Компьютерное моделирование сети гиппокампа новорожденного животного 26
Глава 4. Результаты исследований 31
Результаты экспериментального и теоретического исследования ГДП и спонтанной постсинаптической активности 31
Действие АТФ на ГДП и на спонтанную постсинаптическую активность 31
Исследование вклада А1 рецепторов в эффект влияния АТФ на ГДП и спонтанную постсинаптическую активность 35
Исследование роли АТФ рецепторов в эффекте модуляции часто ты ГДП и частоты спонтанной постсинаптической активности 39
Действие агонистов 39
Действие антагонистов 43
Эксперименты с блокаторами глутаматергических и ГАМКергических входов 47
Влияние тетродотоксина 52
Модельное исследование гигантских деполяризующих потенциалов 55
Анализ механизма действия АТФ на частоту ГДП на основе нейросетевой модели гиппокампа новорожденных крыс 60
Глава 5. Обсуждение результатов 61
Глава 6. Заключение 68
Глава 7. Выводы 69
Список работ, опубликованных по теме диссертации 70
Список литературы , 71
- Сетевые свойства гиппокампа в раннем постнатальном периоде развития
- Приготовление срезов и электрофизиологическая регистрация ответов в переживающих срезах гиппокампа новорожденных крыс
- Действие АТФ на ГДП и на спонтанную постсинаптическую активность
- Эксперименты с блокаторами глутаматергических и ГАМКергических входов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение механизмов, лежащих в основе пластичности синаптической передачи в ЦНС, является одним из основных направлений исследований в современной нейробиологии. Нервная система новорожденных животных обладает рядом существенных функциональных особенностей. На раннем этапе развития нервной системы во многих отделах мозга, в том числе и в гиппокампе, регистрируется спонтанная активность в виде гигантских деполяризующих потенциалов (Ben-Ari et al., 1989). Считается, что существование гигантских деполяризующих потенциалов в этом возрасте связано с возбуждающей функцией ГАМК. Это предположение основывается на том факте, что гигантские потенциалы регистрируются в первую неделю после рождения и исчезают в старшем возрасте, когда ГАМК становится тормозным медиатором (Ben-Ari et al., 1989). Показано, что в распространении гигантских потенциалов принимают участие как глутаматергические, так и ГАМКергические связи большой группы нейронов (Khazipov et al., 1997). На сегодняшний момент существует как пейсмекерная, так и сетевая гипотезы генерации гигантских потенциалов. Согласно сетевой гипотезе гигантские деполяризующие потенциалы являются результатом положительной обратной связи между пирамидными клетками и интернейронами (Tabak et al., 2001). В то же время в других работах рассматривается способность интернейронов-пейсмекеров генерировать гигантские деполяризующие потенциалы в гиппокампальной сети (Strata et al., 1998). Таким образом, природа генеза гигантских деполяризующих потенциалов остается нераскрытой.
Считается, что гигантские потенциалы играют важную роль в росте аксональных волокон и синаптогенезе (Jakobson et al., 1991). Во время гигантских потенциалов происходит мощный вход кальция в клетку (Garaschuk et al., 1998), который может запускать внутриклеточные биохимические процессы, модулирующие работу генома, и тем самым влиять на клеточное развитие. Таким образом, гигантские потенциалы являются важным звеном в развитии и формировании нейронных связей на раннем этапе онтогенеза, определяя тем самым состояние
-"' - ' '*!
нейронных связей у взрослых животных и, следовательно, такие процессы как память.
Существование гигантских деполяризующих потенциалов свидетельствует о повышенной нейрональной активности в раннем постнатальном возрасте. Известно, что медиаторы могут находиться в синаптических пузырьках в виде комплекса с АТФ и кислыми полипептидами (Глебов, Крыжановский, 1978). В работах на взрослых животных было показано, что при повышенной нейронной активности во внеклеточное пространство из нервных терминалей выбрасывается АТФ (Глебов, Крыжановский, 1978; Wieraszko et al., 1989). В синаптаческой щели АТФ быстро гидролизуется до АДФ, АМФ и аденозина под действием АТФ-аз.
Иммунногистохимические исследования выявили наличие как пресинаптических, так и постсинаптических пуринорецепторов в гиппокампе новорожденных и взрослых животных (Khakh, 2000, Rubio and Soto, 2001). Показано, что через воздействие на пуринорецепторы может осуществляться модуляция синаптической активности. Было обнаружено, что во взрослом гиппокампе пресинаптически локализованные метаботропные АТФ рецепторы могут ингибировать выброс глутамата (Mendoza-Fernandes, 2000). Так как гигантские потенциалы являются феноменом, связанным с гипервозбудимостью нейронов, то можно предположить, что выброс АТФ во время гигантского потенциала во внеклеточное пространство играет модулирующую роль в работе сети и влияет на формирование нервной системы. Таким образом, исследование действия АТФ на нейронную активность новорожденного гиппокампа позволит получить экспериментальные данные о ее модулирующей роли в раннем онтогенезе.
Цель и задачи исследования
Целью исследования являлось выяснение роли АТФ в модуляции нейронной активности новорожденного гиппокампа. Такая работа предполагала решение следующих основных задач:
- исследование изменения частоты гигантских потенциалов и частоты спонтанных постсинаптических потенциалов в зависимости от концентрации апплицируемой АТФ.
фармакологическое исследование вклада различных пуринорецепторов в наблюдаемые эффекты АТФ.
модельное представление генерации и распространения гигантских потенциалов, включающее сравнение результатов модели с экспериментальными данными, полученными при регистрации активности пирамидных клеток области САЗ гиппокампа, и анализ на основе модели механизма действия АТФ на гигантские потенциалы.
Научная новизна
-
Впервые показано, что АТФ способна модулировать частоту гигантских деполяризующих потенциалов.
-
Выявлена зависимость частоты гигантских деполяризующих потенциалов и частоты спонтанной синаптической активности от концентрации АТФ. Показано, что АТФ снижает частоту гигантских деполяризующих потенциалов и увеличивает частоту спонтанной синаптической активности.
-
Выявлено, что в феномене влияния АТФ на частоту гигантских деполяризующих потенциалов и на частоту спонтанной синаптической активности в гиппокампе новорожденных крыс принимают участие ионотропные пуринергические (Р2Х) и аденозиновые (А1) рецепторы.
-
На основе предположения участия электрических связей между интернейронами в генерации гигантских деполяризующих потенциалов впервые создана модель, описывающая форму и длительность гигантских деполяризующих потенциалов в гиппокампе новорожденных крыс.
(5) На основе модели, описывающей определенные параметры и свойства гигантских
деполяризующих потенциалов (форма, длительность, амплитуда, чувствительность к
блокаторам синаптических связей), предложена гипотеза модуляции ритма этих
потенциалов за счет воздействия АТФ через пуринорецепторы на
гиперполяризационные токи в интернейронах.
Теоретическая и практическая значимость
Данное исследование представляет собой работу по экспериментальному и теоретическому исследованию влияния АТФ на спонтанную электрическую активность гиппокампа новорожденных крыс. Обнаружено ингибирующее действие АТФ на частоту гигантских деполяризующих потенциалов и возбуждающее действие на частоту спонтанных постсинаптических потенциалов. Такое действие обусловлено комплексным эффектом АТФ и ее продукта гидролиза - аденозина. Показано участие пуринорецепторов в модуляции сетевой активности новорожденного гиппокампа. Создана модель, описывающая гигантские деполяризующие потенциалы, на основе которой сделано предположение о влиянии АТФ на гиперполяризационные токи в интернейронах гиппокампа. Полученные новые данные расширяют представление о сетевых механизмах распространения возбуждения и о модулирующих свойствах АТФ в гиппокампе новорожденных крыс. Эти результаты позволили выявить роль АТФ как модулятора нейрональной активности в раннем периоде постнатального развития гиппокампа.
Апробация работы
Основные результаты были доложены на совместном заседании лабораторий нейробиологии обучения и нейроонтогенеза Института высшей нервной деятельности РАН (2003), на 3 - м Международном симпозиуме в Магдебурге "Neuroprotection and Neurorepair", на 7 - й Пущинской школе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА » (2003), конференция "Важнейшие достижения ИВНД и НФ" (2003).
Структура и объем работы
Сетевые свойства гиппокампа в раннем постнатальном периоде развития
Синхронная ритмическая спонтанная активность является неотъемлемой частью развития центральной нервной системы. Начиная с первых работ по изучению этого феномена, были экспериментально обнаружены спонтанные осцилляции у новорожденных животных в нервных структурах, таких как ганглиозные клетки сетчатки глаза (Meister et al, 1991), спинной мозг (Gu and Spitzer, 1995) и кора головного мозга (Ben-Ari et al, 1989; Menendez de la Prida et al, 1996; Yuster et a I, 1995). Полученные данные подтверждают идею гипервозбудимости нейронной сети в определенный ограниченный период развития организма. Однако механизмы генерации и синхронизации клеточной активности в нейронных системах изучены недостаточно.
В гиппокампе новорожденных животных спонтанная синхронная активность нейронов выражается в генерации так называемых гигантских деполяризующих потенциалов (ГДП) - высокоамплитудных длительных сдвигах мембранного потенциала нервных клеток
. Экспериментально показано участие в генерации ГДП глутаматергических и ГАМКергических входов нейронов и интернейронов (Ben-Ari, 2002; Maggi et al, 2001). ГДП имеют длительность 500 - 800 мс, амплитуду порядка 70 - 90 мВ и регистрируются только в первую неделю постнатального развития гиппокампа.
Известно, что в первую неделю развития ГАМКергические связи являются возбуждающими. Это связано с высокой концентрацией внутриклеточного хлора, определяемой развитием хлорных ко-транспортеров (Rivera et al, 1999; Rayne et a!, 2003). Из экспериментов следует, что ингибиторы ГАМКергических и глутаматных связей подавляют появление ГДП (Khazipov et al, 1997). Кроме того, было обнаружено большое количество электрических связей между интернейронами, при этом число таких связей уменьшается с возрастом животных (Strata et al, 1997). Блокирование электрических связей октанолом приводит к исчезновению ГДП (Strata et al, 1997). Таким образом, существование ГДП связано с наличием как синаптических связей между нейронами и интер нейрона ми, так и электрических и синаптических связей между интернейронами. ГДП наблюдаются во всех областях гиппокампа (СА1, САЗ, зубчатая фасция) (Menendez de la Prida et al, 1998). В то же время, остается невыясненным, является ли генерация ГДП следствием особой работы сети или имеет пейсмекерное происхождение.
В литературе изложена идея сетевого механизма генерации ГДП (Ben-Ari et al, 1989; Menendez de la Prida et al, 1998). Исходя из сетевого представления, ГАМКергические интернейроны являются связующим звеном в спонтанной ритмической активности гиппокампа. Активация глутаматергических входов от пирамидных клеток ведет к деполяризации постсинаптической мембраны интернейрона, приводящей к открытию НМДА каналов, через которые Са2+ входит в клетку. Увеличение концентрации Са2+ в клетке ведет к увеличению кальций-зависимой калиевой проводимости, приводящей к гиперполяризации интернейрона. Таким образом, активация глутаматергических входов ведет к деполяризации интернейрона и появлению потенциалов действия, а кальцийзависимая калиевая проводимость прекращает разряд клетки за счет ее гиперполяризации. В свою очередь, деполяризация, вызванная активацией ГАМКергических синапсов, ведет к развитию потенциала действия за счет деполяризации, обусловленной входом кальция через потенциалзависимые кальциевые каналы (Leinekugel et al, 1995). Таким образом, считается, что ГДП являются результатом положительной обратной связи между пирамидными нейронами и интернейронами. Предполагается, что в такой системе механизмом торможения может быть наличие быстрой синаптической депрессии (O Donovan, 1999; Tabak et al, 2000). По мнению авторов, наличие быстрой синаптической депрессии может обеспечивать периодичность ГДП.
С другой стороны, существуют экспериментальные работы, показывающие возможность существование пейсмекеров в гиппокампе новорожденных крыс. Так, например, в интернейронах хилуса гиппокампа новорожденных крыс были зарегистрированы "пейсмекерные" гиперполяризационные токи Ih (Strata et al, 1997), аналогичные "пейсмекерным" токам в кардиомиоцитах (Di Francesco, 1993). Эти токи определяют работу клетки как генератора ритмической активности (Clapham, 1998; Luthi and McCormick, 1998). Ионные каналы, отвечающие за существование Ih токов, получили название HCN каналов. Кинетические и функциональные свойства каналов кодируются 4 генами (Santoro et al, 1997, 1998; Ishii et al, 1999; Seifert et al, 1999; Monteggia et al, 2000). Недавно все четыре изоформы были экспрессарованы в гиппокампе новорожденных крыс (Bender et al, 2001), причем экспрессия в интернейронах и пирамидных клетках различна и отличается от экспрессии этих генов в гиппокампе взрослых крыс (Moosmang et al, 1999; Monteggia et al, 2000; Santoro et al, 2000).
В теоретической работе (Vasilyev and Barish, 2002) была предпринята попытка моделирования пейсмекерной активности в гиппокампе новорожденных животных. Эта модель основана на предположении, что ритмическая активность в гиппокампе новорожденных животных определяется свойствами гиперполяризационных Ih токов. Авторы работы считают, что свойства Ih токов связаны с двумя механизмами: быстрой и медленной компонентами активации, зависящими от мембранного потенциала, и задаются величинами, меняющимися от возраста. Такая зависимость отражает изменение свойств гиперполяризационных токов гиппокампа в онтогенезе. Путем варьирования параметров активационных компонент авторы показали, что максимальная ритмическая активность, определяемая Ih токами, наблюдается в первую неделю онтогенеза, что соответствует экспериментальным данным.
Показано, что действие ГАМК в этом возрасте может быть регулирующим для различных процессов (Meier et al, 1983). Так, например, выявлено, что хроническое блокирование ГАМКа рецепторов бикукуллином ингибирует развитие гиппокампальных клеток в культуре и развитие фоторецепторов в сетчатке (Barbin et al, 1993; Messersmith and Redburn, 1993). Более того, ГАМК вызывает хемокинез (увеличивает случайное движение нейронов) и, таким образом, может быть своеобразным сигналом, который инициирует и направляет миграцию клеток к их конечным позициям (Behar et al, 1994). Помимо этого, действие ГАМК в этом возрасте может вызывать внутриклеточные кальциевые осцилляции (Connor et al, 1987; Yuste and Katz, 1991), которые в свою очередь играют важную роль в клеточном развитии (Reichling et al, 1994; Spitzer, 1994; Gu and Spitzer, 1995). Связанные с возбуждающим действием ГАМК сетевые особенности, такие как гигантские деполяризующие потенциалы (Ben-Ari et al, 1989), играют важную роль в росте аксональных волокон и формировании синаптических связей (Hinkle et al, 1981; Purves and Lichtman, 1985; Jacobson, 1991).
Исследование механизмов генерации и распространения ГДП помогает расширить представления о сетевых свойствах гиппокампа в этом возрасте. В работах на взрослых животных было показано, что при повышенной нейрональной активности во внеклеточное пространство из нервных терминален выбрасывается АТФ (Глебов, 1978). Так как ГДП является феноменом, связанным с гипервозбудимостью сети, то предполагается, что выброс АТФ во время ГДП во внеклеточное пространство может играть важную модулирующую роль в сетевой активности гиппокампа.
Приготовление срезов и электрофизиологическая регистрация ответов в переживающих срезах гиппокампа новорожденных крыс
Поперечные срезы толщиной 500 мкм приготовлялись с помощью вибротома (Vibrating Microtom, 500-202, TSE). Фиксация при резке производилась с использованием цианакрилата. Резка осуществлялась при полном погружении ткани в оксигенированный охлажденный раствор ИЦОК.
После резки срезы по одному переносились в инкубационную камеру, содержащую оксигенированную ИЦОК при комнатной температуре (22-24 С). Оксигенированная ИЦОК (Yamamoto, 1979) имела следующий состав (в мМ): NaCI 130, KCI 3.5, NaHz Р04 1.2, MgCI2 1.3, CaCI2 2, NaHC03 25, глюкоза 25, рН=7.2-7.4. После 1 часа нахождения в инкубационной камере срезы по одному помещали в регистрационную камеру.
Температуру в регистрационной камере поддерживали в пределах 32-33. В работе использовалась проточная термостабилизированная камера. Солевой раствор поступал в камеру вследствие перепада высот между емкостью, в которой он находился, и, собственно, регистрационной камерой, через которую протекала ИЦОК со скоростью 3-5 мл/мин. Для стабилизации уровня раствора в регистрационной камере использовалась дополнительная камера по типу сообщающихся сосудов.
Уровень раствора поддерживался на 1-2 мм выше поверхности среза (Alger а. Nicoll, 1980). Это позволяло получать стабильные внутриклеточные записи и обеспечивать равномерную аппликацию фармакологических веществ. Используемая система перфузии давала возможность плавно переключать подачу растворов с заданной концентрацией в регистрационную камеру. Полное замещение одного раствора другим в камере объемом 2 мл происходило в течение примерно 1 минуты. Внутриклеточный регистрирующий электрод изготовлялся из 2 мм боросиликатного стекла и имел сопротивление 4-5 МОм при заполнении внутриклеточным раствором. Внутриклеточный раствор имел следующий состав (мМ): KCI 140, МдСЬ 1, EGTA 1, Hepes 10, Мд АТР 2, рН 7.2 (титрование с КОН).
Используя методику „пэтч-кламп" (patch clamp) в конфигурации "целая клетка 7 (Blanton et al, 1989; Hamill et al, 1984), мы регистрировали спонтанные внутриклеточные ГДП и спонтанные ПСП в пирамидных нейронах области СА 3 гиппокампа (Рис. 2). Все записи были сделаны в режиме фиксации токов при помощи стандартного усилителя (Axoclamp 2В, Axon Instruments, Foster City, CA, USA) после компенсации последовательного сопротивления и ёмкости. Последовательное (10-30 МОм) и мембранное входное сопротивление определялось с помощью анализа ступеньки потенциала (амплитуда 5 мВ и длительность 200 мс) или тока (амплитуда 5 пА и длительность 200 мс), пропускаемого через регистрирующий электрод. На рисунке 3 показана схема установки.
От пирамидных клеток слоя СА 3 регистрировались гигантские деполяризующие потенциалы (ГДП) и спонтанная активность при различных мембранных потенциалах, начиная с потенциала покоя. С помощью программы Clampex 7 (Axon Laboratory) производилась непрерывная запись потенциалов клеток. В качестве контроля бралась 5-Ю минутная запись от начала регистрации при потенциале покоя мембраны клетки. Записи с нестабильным поведением потенциала покоя мембраны клетки (то есть сильная изменчивость потенциала клетки в течение записи, обусловленная недостаточно хорошим состоянием среза или клетки) исключались из дальнейшей обработки. После записи контроля производилась аппликация фармакологических веществ, и дальше записывался мембранный потенциал на фоне вещества.
Обычно через 1-2 минуты после переключения протока с контрольным раствором на раствор с исследуемым фармакологическим веществом считали, что раствор с исследуемым веществом полностью заместил контрольный раствор, и с этого момента предполагали начало воздействия исследуемого вещества на клетки среза. После 15-30 минут записи регистрации с веществом начинали отмыв. Для отмыва использовали контрольный раствор.
В тех экспериментах, где наблюдалось блокирование ГДП, считали, что вещество отмылось, если происходило восстановление ГДП. В той части экспериментов, где ставилась задача нефармакологического исследования формы и длительности ҐДП для последующего сравнения с результатами моделирования, регистрация производилась при различных мембранных потенциалах: -60 мВ, -100 мВ. Усиленные и отфильтрованные (1, 3 или 10 кГц) потенциалы оцифровывались с частотой 5-25 кГц и сохранялись на магнитном диске компьютера в виде файлов с разрешением 12 бит для последующего анализа. Использование фармакологических веществ Для исследования использовались: 1) Picrotoxin (Sigma) - аллостерический ингибитор ГАМКа рецепторов (в качестве растворителя использовался диметилсульфоксид). 2) DNQX (Tocris): 6,7-Dinitroquinoxaline-2,3(lH,4H)-dione - блокатор АМПА рецепторов (в качестве растворителя использовался диметилсульфоксид). 3) ТТХ (Latoxan): Tetrodotoxin - блокатор натриевых каналов (в качестве растворителя использовалась дистиллированная вода). 4) DPCPX (Sigma): 8-cyclopentyI-l, 3-dipropyIxanthine - блокатор А1 аденозиновых рецепторов (в качестве растворителя использовался диметилсульфоксид). 5) АТФ (Sigma). В качестве растворителя использовалась дистиллированная вода. 6) UTP (Sigma): Uridine 5riphosphate- агонист P2Y рецепторов. В качестве растворителя использовалась дистиллированная вода. 7) ap-me-ATP (Sigma): ар-methylene ATP - негидролизуемыи аналог АТФ, агонист Р2Х рецепторов. В качестве растворителя использовалась дистиллированная вода. 8) PPADS (Tocris Cookson) pyridoxalphosphate-6-azophenyI-2 , 4 -disulfonic acid -неселективный блокатор ионотропных Р2 рецепторов. В качестве растворителя использовалась дистиллированная вода. Все вещества сначала готовились как 1000-кратно концентрированные исходные растворы и хранились в холодильнике при -20С. Перед регистрацией вещества добавлялись в своих конечных концентрациях в ИЦСЖ. В таблице 1 приведены агонисты и антагонисты пуринорецепторов, которые мы использовали в нашем исследовании.
Действие АТФ на ГДП и на спонтанную постсинаптическую активность
Существование ГДП на раннем этапе развития организма являются важной частью формирования будущих нейронных связей у взрослого организма. Механизмы генерации и распространения ГДП до сих пор недостаточно изучены и описанная нами модель является попыткой поиска необходимых и достаточных условий для генерации ГДП в новорожденном гиппокампе.
На сегодняшний момент остается спорным вопрос об участии пейсмекера (ов) в генерации ГДП. Существующие гипотезы склоняются к тому, что данный феномен может быть обусловлен особой работой сети, где генерации ГДП являются результатом положительной обратной связи между пирамидными нейронами и интернейронами (Ben-Ari et al., 1989; Menendez de la Prida et al., 1998). Однако представленными гипотезами трудно объяснить ряд экспериментальных наблюдений, таких, как исчезновение ГДП при блокаде электрических синапсов октанолом (Strata et al., 1997). Кроме того, с помощью метода регистрации кальциевых ответов была установлена корреляция нейронных кальциевых осцилляции и ГДП (Garaschuk et al., 1998). Кальциевые осцилляции, регистрируемые в пирамидных клетках, полностью исчезают после блокады ПАМКергических входов и остаются после блокады глутаматергических входов. Этот факт указывает на то, что в изолированных от интернейронов пирамидных клетках не существует автономного источника ритма. С другой стороны, тот факт, что при блокаде глутаматергических рецепторов осцилляции в пирамидных клетках все же наблюдались, приводит к выводу, что они являются "наведенными" со стороны пейсмекеров.
До настоящего времени открытым вопросом является природа пейсмекерной активности в центральной нервной системе. Ряд экспериментальных данных наводят на мысль, что существуют клетки, например интернейроны, способные к автономным осцилляциям (Cobb et al., 1995; Buzsaki and Chrobak, 1995; Maccaferri and McBain, 1996). Экспериментальные работы на разных структурах мозга свидетельствуют, что интернейроны способны разряжаться с высокой частотой без аккомодации. Частота подобных разрядов может достигать 200 Гц (Buzsaki and Chrobak, 1995; Kawaguchi and Kubota, 1993). Синхронная работа нескольких интернейронов-пейсмекеров способна вызывать мощную деполяризацию во многих нейронах гиппокампа.
Существующие работы по генной экспрессии HCN изоформ в гиппокампе новорожденных крыс (Bender et al, 2001) обнаружили высокий уровень экспрессии HCN 1, HCN 2 и HCN 4 изоформ, отвечающих за In токи, в интернейронах, расположенных в СА 1 stratum oriens and СА 3 sratum radiatum, что может служить доказательством пейсмекерной активности интернейронов гиппокампа новорожденных крыс. По нашему мнению, электрические контакты, обнаруженные в большом количестве между интернейронами новорожденного гиппокампа (Strata et al.,1997), могут синхронизировать работу клеток, приводя к согласованной работе интернейронов, заставляя работать систему интернейронов как единый ансамбль, иннервирующий одновременно тысячи пирамидных клеток, что и приводит к явлению ГДП.
В отличие от интернейронов, пирамидные клетки склонны к аккомодации и способны разряжаться с низкой частотой. Кроме того, между пирамидными нейронами не обнаружено электрических связей (Galarreta and Hestrin, 2001).Таким образом, эти нейроны гиппокампа не могут являться механизмом, запускающим генерацию ГДП. Поэтому в представленной модели брался интернейрон, как источник лейсмекерного ритма. В модели отдельный интернейрон представлен идеальным пеисмекерным элементом, который можно интерпретировать как отдельный пейсмекерный интернейрон или как сеть интернейронов, способную запустить ГДП.
В настоящей работе исследовано влияние АТФ и ее производного - аденозина на частоту ГДП, которые характерны для гиппокампа новорожденных крыс, и спонтанную синаптическую активность. В экспериментах с добавлением АТФ к срезам было обнаружено уменьшение частоты ГДП, которое было тем больше, чем большую концентрацию АТФ использовали. Однако влияние АТФ на частоту спонтанной синаптической активности было полностью противоположным - в экспериментах наблюдалось увеличение частоты спонтанной синаптической активности, причем этот эффект так же зависел от концентрации АТФ. Увеличение частоты было тем больше, чем большую концентрацию АТФ апплицировали. Таким образом, модулирующие свойства АТФ могут проявлять себя с протиположных сторон.
Способность АТФ влиять на частоту ГДП и частоту спонтанной синаптическои активности говорит о преси на птическом характере феномена. Можно полагать, что в эти два процесса вносят вклад различные классы пуринорецепторов, расположенных на преси на птической мембране.
Известно, что при распаде АТФ могут возникать комплексные эффекты АТФ и аденозина. Аденозин является мощным нейромодулятором (Гиниатуллин и Соколова, 1998; Giniatullin and Sokolova, 1998; Greene and Haas, 1991), ингибируя синаптическую активность в пресинаптической мембране через увеличение К+ проводимости, а также блокирует кальциевые каналы в нервных окончаниях (Greene and Haas, 1985; Leinekugel, 1997; Trussell and Jackson, 1987). Это приводит, в свою очередь, к снижению выброса нейромедиатора (Галкин, 2001; Wu and Saggau, 1994). Тот факт, что освобождение аденозина приводит к блокированию синаптическои передачи, был отмечен в работах на срезах гиппокампа взрослых животных (Zhu and Krnjevic, 1993; Zhu and Krnjevic, 1997).
Нами было обнаружено, что использование DPCPX несколько увеличивает частоту ГДП, что, по всей видимости, связано с устранением ингибирующего воздействия эндогенного аденозина на сетевую активность через А1 рецепторы, однако не меняет частоту спонтанной синаптическои активности. Воздействие АТФ на фоне действия ингибиторов аденозиновых рецепторов DPCPX позволило выявить феномен угнетения ГДП, который не связан с действием аденозина. Этот феномен говорит в пользу того, что уменьшение частоты ГДП во время действия АТФ в присутствии антагонистов аденозиновых рецепторов связан с участием ингибирующих пуринергических рецепторов. Интересен тот факт, что при аппликации АТФ на фоне DPCPX наблюдался эффект ингибирования частоты ГДП со сдвигом в сторону больших концентраций.
Эксперименты с блокаторами глутаматергических и ГАМКергических входов
О распределении пуринорецепторов в гиппокампе как молодых, так и взрослых животных имеется недостаточно сведений. В гиппокампе взрослых животных были обнаружены Р2Х2, Р2Х4, Р2Х6 , Р2Х7 рецепторы (Armet al, 2002; Buell et al, 1996; Collo et al, 1996; Seguela et al, 1996; Soto et a!, 1996 a, b). Какой класс рецепторов вносит основной вклад в этот эффект, остается неясным, так как известны пуринергические рецепторы, обладающие диаметрально противоположными свойствами. Так, например, участие Р2Х2, Р2Х4, and Р2Х6 рецепторов, которые расположены в основном на постсинаптической мембране, вносит вклад в увеличение синаптического возбуждения, что наблюдали в гиппокампе взрослых животных при приложении малых доз АТФ (Wieraszko, Seyfried, 1989). С другой стороны, имеется класс рецепторов Р2Х7, локализованных пресинаптически (Deuchars S.A., Atkinson L, Brooke R.E. et al, 2001; Galkin A.V., Giniatullin R.A., Mukhtarov M.R. et al, 2001), которые участвуют в ингибировании проведения возбуждения и чувствительны к достаточно большим дозам АТФ (Arm, 2002). К сожалению, имеется недостаточно сведений о локализации метаботропных P2Y АТФ - рецепторов у новорожденных животных. Эти рецепторы во многих случаях выполняют ингибирующие функции.
Пытаясь выяснить вклад ионотропных и метаботропных пуринорецепторов в описанных нами эффектах, мы проводили эксперименты с агонисгами ионотропных (ар те-АТР) и метаботропных (UTP) рецепторов. При аппликации ар те-АТР в наших экспериментах мы не увидели изменений ни в частоте ГДП, ни в частоте спонтанной синаптической активности, что говорит об отсутствии или нефункциональности ряда ионотропных пуринорецепторов. Известно, что к ар те-АТР особенно чувствительны подтипы Р2Х1 и Р2ХЗ рецепторов. Для метаботропных - ар те-АТР не активна.
При аппликации UTP мы также не увидели никаких изменений ни для частоты ГДП, ни для частоты спонтанной синаптическои активности. Это означает отсутствие или нефункциональность определенных подклассов метаботропных пури но рецепторов. Как известно, к UTP чувствительны P2Y2/ P2Y3, P2Y4 подклассы метаботропных рецепторов.
Эксперименты с блокатором ионотропных рецепторов PPADS обнаружили, что АТФ, добавленная на фоне PPADS блокирует ГДП и увеличивает частоту спонтанной синаптическои активности. Помимо этого после аппликации PPADS происходило уменьшение частоты ГДП, тогда как частота спонтанной синаптическои активности оставалась практически без изменений. Возможно, какие-то из пуринорецепторов участвуют в распространении ГДП, определенным образом влияя на пресинаптический выброс передатчика. Но тот факт, что при аппликации АТФ на фоне PPADS мы наблюдали феномен учащения ГДП и урежения частоты сПСП, говорит о существовании пуринорецепторов, участвующих в модуляции частот ГДП и сПСП, на которые PPADS не действует. Проявление эффекта уменьшения частоты ГДП при АТФ на фоне используемого блокатора PPADS говорит об участии, скорее всего определенного типа (ов) пуринорецепторов, которые не чувствительны к использованию PPADS. Такими рецепторами скорее всего являются Р2Х4 рецепторы, присутствующие в гиппокампе (Rubio and Soto, 2001).
Одним из этапов нашего исследования было изучение влияния АТФ на состояние синаптическои передачи на пирамидных клетках области СА 3 при блокированных сетевых событиях. С этой целью мы проводили аппликацию АТФ на фоне ТТХ. ГДП при добавлении ТТХ полностью блокировались, аппликация АТФ на фоне ТТХ не снимала блокады ГДП. После апплицирования АТФ на фоне ТТХ вопреки ожиданию мы не наблюдали изменений в частоте сПСП. Этот феномен может объясняться по разному. Во-первых, изучаемое нами явление увеличения частоты спонтанной активности в присутствии АТФ могло быть связано с сетевой активностью гиппокампа новорожденных крыс. При воздействии ТТХ на срез гиппокампа мы наблюдали миниатюрные спонтанные постсинаптические потенциалы, которые зависят только от случайного выброс нейромедиатора из пресинаптической терминали. Еще одно объяснение возможно на основе того, что ТТХ способен блокировать АТФ вызванные токи (Inoue et al., 1992).
Эксперименты с пикротоксином обнаружили, что ГДП блокируются, а частота сПСП сильно снижается во всех регистрируемых нами нейронах. Эти наблюдения согласуются с известными фактами об участии ГАМКергических волокон в распространении ГДП и о слабо развитых глутаматергических входах в этот период развития. Аппликация АТФ на фоне пикротоксина не вызывала никаких изменений по сравнению с наблюдаемой картиной при аппликации только пикротоксина, что говорит об отсутствие влияния АТФ на глутаматергические входы на пирамидные клетки.
Эксперименты с блокатором AM ПА рецепторов DNQX показали, что ГДП при добавлении DNQX полностью блокируются, что указывает на участие в распространении ГДП глутаматергических волокон. При добавлении АТФ на фоне DNQX картина не менялась. Частота сПСП при добавлении DNQX не изменялась по сравнению с контролем; после аппликации АТФ на фоне DNQX частота сПСП по сравнению с частотой в экспериментах с DNQX увеличивалась, но эти изменения не являлись статистически значимыми. Такие данные указывают на отсутствие влияния АТФ на ГАМКергические входы на пирамидные нейроны. Результаты настоящего исследования дали представление о том, что нейрональная сеть гиппокампа новорожденных животных находится под двойным контролем А1 и Р2 рецепторов. При этом, скорее всего, мы имеем дело с эффектом, обусловленным влиянием АТФ на интернейроны.
Во всех экспериментах с АТФ не наблюдалось изменения формы и амплитуды ГДП. Исходя из представленной нами модели ГДП, этот факт позволяет сделать вывод, что АТФ не влияет на параметры связей "и частот/ внутри пачки разрядов пейсмекерного интернейрона, которая определяет такие параметры ГДП, как форма и длительность. Можно предположить, что АТФ через пуринорецепторы влияет на In токи интернейронов, что и определяет изменение ритма ГДП. Наше наблюдение подтверждается экспериментами с цезием (блокатор In токов), описанными в работе Strata, 1989. В этих экспериментах также наблюдалось зависящее от концентрации цезия снижение частоты ГДП и как видно из работы Strata,1989 (рис.8), оно сопровождалось увеличением частоты сПСП.
Таким образом, несмотря на неизученность вопроса механизма воздействия АТФ на активность интернейронов новорожденного гиппокампа, мы можем сделать вывод о взаимосвязанности феноменов уменьшения частоты ГДП и увеличения частоты сПСП под влиянием АТФ и предположить действие АТФ через определенные классы пуринорецепторов на In токи в пеисмекерных интернейронах, что и определяет характер описанных феноменов.
