Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4
Актуальность проблемы 4
Цель и задачи исследования 6
Основные положения, выносимые на защиту 7
Теоретическая и практическая значимость работы 7
Апробация работы и публикации результатов исследования 7
Глава 1. Обзор литературных данных 9
1.1. Структура фоторецепторов 9
Г.2.Механизм фототрансдукции 11
1.3. Усиление сигнала в каскаде фототрансдукции 15
1 АМеханизмы выключения каскада фототрансдукции 16
Общие представления о световой адаптации фоторецепторов 22
Роль кальция в световой адаптации 23
Обмен кальция между наружным сегментом фоторецепора и окружающей средой в темноте и на свету 24
Мишени, на которые влияет изменение концентрации кальция в наружном сегменте фоторецептора 27
Феномен световой адаптации фоторецепторов 33
1.10. Поиск дополнительных механизмов регуляции фототрансдукции 34
Глава 2. Материалы и методы 37
Экспериментальный материал 39
Экспериментальная установка 40
Изготовление микропипеток 42
2.4.Поиск и фиксация одиночных палочек в микропипетке 43
2.5.Система световой стимуляции : 44
2.6. Программа для управления стимуляцией и записи ответов 44
2.7.Первичная обработка результатов 46
2.8.Система быстрой смены омывающего раствора 46
Методика кальциевого клампа. Состав растворов 49
Метод вычисления временного хода активности ФДЭ из нормированного клампированного ответа 51
2.12. Измерение темновой активности фосфодиэстеразы 53
Глава 3. Результаты 55
3.1. Измерение темновой активности ФДЭ 55
3.2.Проверка качества фиксации внутриклеточной концентрации кальция 58
3.3.Исследование временного хода светоиндуцированной активности ФДЭ 62
3.3.1 Протокол эксперимента 62
Выбор значения кооперативное каналов для расчетов 66
Анализ кривых светоиндуцированной активности ФДЭ в темновых условиях (в отсутствии фоновых засветок) 67
Особенности экспериментальной процедуры и вычислений при извлечении кривых активности ФДЭ в условиях световой адаптации (при фоновых засветках).. 72
Анализ кривых активности ФДЭ в условиях световой адаптации (при фоновых засветках) ' 76
3.4. Измерение критической постоянной времени выключения каскада то 82
Критическая постоянная времени выключения каскада td в темновых условиях ' 82
Анализ кривых Пепперберга и критической постоянной времени то в условиях
фоновых засветок 85
3.5. Независимость коэффициента усиления от световой адаптации 87
Глава 4. Обсуждение 90
Эффективность клампирования внутриклеточной концентрации кальция 90
Ускорение инактивации родопсина и выключения трансдуцина при световой адаптации 90
Критическая постоянная времени то не соответствует ни фосфорилированию родопсина, ни инактивации трансдуцина в палочках лягушки 93
Ускорение инактивации трансдуцина и снижение чувствительности при фоновых засветках 95
Выводы 102
Введение к работе
Актуальность проблемы
Среди сигнальных каскадов сенсорных систем наиболее изученным является каскад зрительной трансдукции, благодаря которому поглощение кванта света приводит к генерации нервного импульса. Считается, что основные компоненты этого каскада и их взаимосвязи уже известны. Поглощение квантов света молекулами родопсина запускает цепь биохимических реакций, вследствие которых происходит гиперполяризация фоторецепторной клетки. Вторичным посредником в этом сигнальном пути является циклический гуаназинмонофосфат (цГМФ). Его концентрация в наружных сегментах фоторецепторных клеток зависит от активности двух ферментов, имеющих противоположные функции: гуанилатциклаза (ГЦ) синтезирует цГМФ, а фосфодиэстераза (ФДЭ) его гидролизует. При воздействии света запускается цепь биохимических превращений, активирующих ФДЭ, вследствие чего уровень цГМФ в наружном сегменте фоторецептора падает, и ионные каналы плазматической мембраны закрываются. Первым звеном каскада является зрительный пигмент родопсин, который возбуждается при поглощении фотона; родопсин активирует G-белок трансдуцин, а он, в свою очередь катализирует гидролитическую активность ФДЭ.
Способность фоторецепторной клетки отвечать на световые стимулы может восстановиться только в том случае, если концентрация цГМФ в наружном сегменте вернется к исходному уровню. Для этого необходимо, чтобы уровень активности ФДЭ пришел к темновому уровню, а для этого должны быть инактивированы родопсин и трансдуцин. Активность родопсина в значительной степени снижается за счет его фосфорилирования и окончательно выключается при связывании родопсина с аррестином. Комплекс трансдуцин-ФДЭ инактивируется, когда трансдуцин гидролизует ГТФ до ГДФ. Инактивация каскада и
восстановление темнового уровня тока регулируется обратными связями, опосредуемыми внутриклеточной концентрацией кальция.
Таким образом, скорости активации и инактивации ФДЭ при световой стимуляции являются ключевыми параметрами, определяющими скорость развития и выключения фотоответа. Однако на сегодняшний день практически величины этих параметров не определены в физиологических условиях (т.е. в интактных фоторецепторных клетках). Определение скоростей активации и выключения ФДЭ в условиях in vitro дает значения, которые плохо согласуются со скоростью развития и выключения фотоответа в интактных клетках. Так, скорость гидролиза ГТФ, измеренная в биохимическом эксперименте на очищенном трансдуцине, оказалась слишком низкой и не соответствует скорости восстановления темнового тока после вспышки в фоторецепторных клетках in vivo. (Arshavsky et al., 1987).
Аналогичные противоречия возникли и в отношении оценки скорости инактивации родопсина. В физиологических условиях выключение родопсина происходит за время меньше секунды, а определение скорости этого процесса in vitro дает результат в минутном диапазоне (Wilden & Kuhn, 1982; Gorodovikova et al., 1994).
В связи с этим для дальнейшего углубления знаний о работе каскада фототрансдукции представляется важным определение параметров инактивации родопсина и трансдуцина в интактных фоторецепторных клетках. Фактором, который затрудняет измерение этих параметров в живой фоторецепторной клетке, является наличие отрицательных обратных кальциевых связей, которые жестко регулируют скорость выключения основных участников каскада. В данной работе была применена методика так называемого «кальциевого клампа» (т.е. фиксации внутриклеточного уровня Са2+), которая в сочетании со специальным алгоритмом вычислений позволила восстановить временной ход активности ФДЭ после световой
вспышки. А кривая светоиндуцированной активности ФДЭ в свою очередь определяется кинетикой выключения родопсина и трансдуцина.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы состояла в исследовании скоростей инактивации основных участников каскада фототрансдукции - родопсина и трансдуцина -в интактных клетках; для этого решались следующие задачи:
При помощи метода кальциевого клампа оценить параметры кривых активности ФДЭ в палочках лягушки при подаче ненасыщающих световых стимулов в отсутствии кальциевых обратных связей.
Выяснить, каким образом влияет световая адаптация и сопряженные с ней изменения внутриклеточного уровня кальция на скорости инактивации родопсина и трансдуцина.
Определить, какой из процессов инактивации каскада является лимитирующим для скорости выключения фотоответа палочек лягушки на насыщающие световые стимулы.
В данной работе нами впервые исследована скорость активации и инактивации светоиндуцированной активности фосфодиэстеразы в интактных палочках лягушки в условиях- темновой и световой адаптации. Показано, что световая адаптация в палочках лягушки ускоряет не только выключение родопсина, но и инактивацию трансдуцина. При интенсивных фоновых засветках такое ускорение каждого из процессов выключения может быть более чем шестикратным. Этот результат заставляет пересмотреть существующие до сих пор представления о том, что выключение трансдуцина не зависит от внутриклеточной концентрации кальция и световой адаптации.
Основные положения, выносимые на защиту
Скорость инактивации трансдуцина, как и скорость фосфорилирования родопсина, находится под контролем световой адаптации. При интенсивных фоновых засветках оба этих процесса могут ускоряться более чем в 6 раз.
Величина ускорения обоих процессов выключения каскада фототрансдукции позволяет полностью объяснить уменьшение чувствительности, наблюдаемое при интенсивных фоновых засветках.
Ни фосфорилирование родопсина, ни инактивация трансдуцина не лимитируют скорость выключения фотоответа на насыщающие стимулы в палочках лягушки. Процесс, лимитирующий скорость выключения насыщенных фотоответов, может быть гипотетически отождествлен со связыванием родопсина с аррестином.
Теоретическая и практическая значимость работы
Подробное исследование кинетики процессов выключения каскада позволило углубить наше понимание молекулярных механизмов фототрансдукции в темновых и светоадаптированных условиях. Выявленные закономерности могут оказаться полезными и для понимания работы других сигнальных каскадов, которые изучены в меньшей степени, чем каскад фототрансдукции.
Апробация работы и публикации результатов исследования
Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на следующих научных конференциях:
VI Международном симпозиуме «Visionarium VI» (Твярмине, Финляндия, 2007)
XX Съезде физиологического общества им. Павлова, (Москва, 2007 г)
Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2007).
VI Европейском Форуме по Нейробиологии FENS (Женева, 2008).
По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях и 1 статья в Journal of General Phisiology.
