Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 9
1.1. Физиологическая роль калиевых каналов гладких мышц артерий 9
1.2. Типы К+-каналов 12
1.2.1. Ку-каналы 15
1.2.2. Кса-каналы 15
1.2.3. KiR-каналы 15
1.2.4. КАТР-каналы 16
1.3. Потенциал-управляемые К+-каналы семейств Kv 1, Kv2 16
.1.3.1 . Молекулярная организация Kv 1, Kv2 К+-каналов 16
1.3.2. Физиология Kyi, Ку2 К+-каналов 20
1.3.3. Фармакология Kvl, Kv2 К+-каналов 22
1.4. Махі-К+-канальі 26
1.4.1. Молекулярная организация тахі-К+-каналов 26
1.4.2. Физиология тахі-К+-каналов 28
1.4.3 Фармакология тахі-К+-каналов 30
ГЛАВА II Материалы и методы исследований 33
2.1. Объект исследований 33
2.2. Растворы 33
2.3. Методы получения препаратов артерий 34
2.3.1. Получение изолированной хвостовой артерии крысы 34
2.3.2. Метод получения препарата axerebralis posterior 35
2.4. Методы получения изолированных гладкомышечных клеток артерий 35
2.4.1. Метод получения изолированных гладкомышечных клеток большой хвостовой артерии 35
2.4.2. Метод получения изолированных гладкомышечных клеток из axerebralis posterior 37
2.5. Регистрация электрофизиологических свойств свежеизолированных гладкомышечных клеток 37
2.6. Изучение локализации ионных каналов в стенках axerebralis posterior 46
2.7. Метод растяжения гладкомышечных клеток 48
2.8. Реактивы 49
2.9. Анализ данных 51
ГЛАВА III Результаты и обсуждение 52
3.1. Изучение вклада тахі-К+-каналов в механизм механоэлектрической обратной связи в сосудах 52
3.1.1. Изучение механосенситивности изолированных клеток 52
3.1.2. Изучение эффекта ІВТХ на тахі-К+-канальі 5 8
3.2. Результаты изучения локализации ионных каналов в стенках axerebralis posterior 61
3.2.1. Изучение локализации ионных каналов семейств Kvl, Kv2 в стенках axerebralis posterior 61
3.3. Характеристика выходящего К+-тока 64
3.4. Характеристика эффекта 4-аминопиридина на KV-TOK 70
3.5. Характеристика эффекта Correolide на KV1-TOK 72
3.6. Характеристика эффекта Stromatoxin-1 на KV2-TOK 82
3.7. Характеристика эффекта Agitoxine-З и Hongotoxin-1 на потенциал-управляемый К+-ток 89
Заключение 93
Выводы 95
Список литературы 97
- . Молекулярная организация Kv 1, Kv2 К+-каналов
- Фармакология Kvl, Kv2 К+-каналов
- Регистрация электрофизиологических свойств свежеизолированных гладкомышечных клеток
- Изучение механосенситивности изолированных клеток
Введение к работе
В современных условиях, проблемы мозгового кровообращения приобретают все большую значимость в связи с такими заболеваниями как мигрень и инсульт. Ученые ищут возможности создания лекарственных препаратов, дающих быстрый и максимально селективный эффект без побочного влияния. Одним из направлений в этих поисках является изучение потенциал-управляемых К+-каналов, играющих важнейшую роль в регуляции работы мелких артерий, и влияния ингибиторов на функцию этих каналов а, следовательно, на работу сосудов.
Изменение функции К+-каналов в гладких мышцах может явиться
причиной патологий в сосудистой системе: вазоспазм, гипертензия, ишемия,
гипотензия при эндотоксическом шоке, и изменение реактивности сосудов
при диабете [82]. Артерии находятся в частично сокращенном состоянии, в
котором они могут дополнительно сужаться или расслабляться в
зависимости от состояния окружающих тканей. Значительная часть
артериального тонуса определяется трансмуральным давлением и называется
миогенным тонусом, и является важной определяющей периферического
сосудистого сопротивления и кровяного давления. Мембранный потенциал
гладкомышечных клеток артерий, регулируемый калиевыми каналами,
является важным регулятором тонуса артерий и, следовательно, их диаметра
[82]. Активация калиевых каналов в мембране клеток гладких мышц артерий
увеличивает выход К+, являясь причиной гиперполяризации мембраны,
которая инактивирует потенциал-зависимые Са2+-каналы, уменьшает вход
Са2+ и приводит к вазодилятации. Потенциал-управляемая инактивация К -
каналов лежит в основе вазоконстрикции. Из литературных данных известно,
что при стимуляции катионных механосенситивных каналов [24]
осуществляется вход Са2+ в клетку, и это приводит к повышению
концентрации цитозольного Са2+ до микромолярного уровня, вызывая
активацию Са2+-зависимых тахі-К+-каналов. Поскольку
электромеханическое сопряжение связано с поступлением из внешней среды
через потенциал-управляемые ионные каналы ионов Са , изучение maxi-K+-каналов приобретает большое значение для исследование механизмов механоэлектрической обратной связи в сосудах. Все изучаемые гладкомышечные клетки сосудов имеют, по крайней мере, один К+-ток, активируемый деполяризацией мембраны [12, 13, 19,26, 41, 52, 53, 57, 74, 84, 88, 103, 116, 117, 118, 121]. Потенциал-управляемые К+-каналы идентифицированы в одиночных гладкомышечных клетках из коронарного, мозгового, почечного, брыжеечного и легочного сосудистого сплетений [18, 26, 41, 52, 57, 74, 103, 116, 117, 118]. Мозговые артериолы контролируют кровоток в области корковых нейронов и являются значительным компонентом периферического сопротивления сосудов, определяющего кровяное давление. Анализ литературных данных показал, что известно наличие экспрессии отдельных подсемейств потенциал-управляемых К+-каналов в мелких мозговых сосудах [3, 85, 93, 94] и определены селективные ингибиторы для некоторых подсемейств этих К+-каналов. Роль потенциал-управляемых К+-каналов семейства Kyi и Ку2 в работе мелких мозговых артерий изучена недостаточно [3]. В связи с этим необходимо изучить влияние специфических блокаторов на К+-ток, для более полного описания эффекта исследуемых ингибиторов.
Исходя из изложенного, целью настоящей работы явилось изучение 7шш"-К+-каналов и потенциал-управляемых К+-каналов семейств Kyi, Kv2 в К+-ток гладкомышечных клеток мелких артерий. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:
Изучение реакции гладкомышечных клеток на растяжение и исследование механизма этого явления.
Изучение влияния аксиального растяжения клетки на проводимость maxi-K -каналов.
Изучение локализации ионных К+-каналов в мембране гладкомышечных клеток.
Изучение биофизических свойств выходящего К -тока в изолированных гладкомышечных клетках.
Изучение эффекта 4-аминопиридина на выходящий К+-ток в свежеизолированных гладкомышечных клетках.
Изучение влияния Correolide и Correolide Compound на выходящий К+-ток в свежеизолированных гладкомышечных клетках.
Изучение влияния Stromatoxine-1 на выходящий К+-ток в свежеизолированных гладкомышечных клетках.
Изучение влияния Agitoxine-З и Hongotoxin-1 на выходящий К+-ток в свежеизолированных гладкомышечных клетках.
Диссертационная работа построена по стандартному принципу и состоит из разделов: обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, построенные на базе полученного материала. Работу завершает список цитируемой литературы.
В главе «Обзор литературы», в соответствие с поставленной целью, изложено описание К+-каналов, исследуемых в работе. Представлена классификация калиевых каналов, дана их краткая характеристика. Описана молекулярная структура шахі-К+-каналов и потенциал-управляемых К+-каналов. Описана физиологическая роль калиевых каналов в регуляции тонуса мелких артерий. Показан эффект используемых в экспериментальной работе действующих веществ на характеристики К+-тока изолированных гладкомышечных клеток.
В главе, посвященной «Материалам и методам», охарактеризован объект исследований. Описана методика получения препаратов артерий из мозга и хвоста крысы, методика получения препарата изолированных гладкомышечных клеток из фрагментов артерий. Представлено описание метода patch-clamp, необходимого для регистрации токов в мембране изолированных гладкомышечных клеток. Описана методика растяжения
гладкомышечных клеток. Представлены составы физиологических растворов и соединения, используемые для экспериментальной работы.
В главе «Результаты и обсуждение» представлены полученные данные о растяжении изолированных гладкомышечных клеток мелких артерий, наличие тахі-К+-каналов, ингибируемых селективным блокатором ибериотоксином. С помощью иммуногистохимического методы показано наличие прокрашивания мембраны гладкомышечных клеток артерий антителами против Kv1.5, Kv1.6 каналов и отсутствие прокрапшвания антителами против Kyl.l, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4 и Kv2.1 каналов. В изолированных гладкомышечных клетках axerebralis posterior методом patch-clamp в конфигурации whole-cell на фоне блокирования тахі-К+-каналов, выявлено наличие каналов, принадлежащих к семейству Kyi. Проиллюстрирован эффект специфических блокаторов Kv1.5 и Kyl.6 каналов Correolide и Correolide С. Продемонстрирован, впервые исследованный, эффект на К+-ток в специфического блокатора Ку2.1 и Ку2.2 каналов Stromatoxin-1 изолированных гладкомышечных клетках axerebralis posterior. Показано влияние специфических ингибиторов подсемейств Kyi каналов Agitoxine-З и Hongotoxin-І на изменения К+-тока.
Работу завершают выводы, вытекающие из обобщения результатов экспериментов.
Работа выполнена на 232 животных, содержит 45 рисунков, 2 таблицы. В заключении представлен список литературы из 121 источника.
. Молекулярная организация Kv 1, Kv2 К+-каналов
Семейство потенциал-управляемых К+-каналов состоит из 12 членов, которые кодируются различными генами. Каждый из 12 членов семейства калиевых каналов подразделяется на подсемейства. В представленной работе нас интересовали Kyi и Kv2 каналы, кодируемые соответственно генами KCNA и KCNB [28] (рис. 1.3.1.1). Kvl-каналы подразделяются на семь подсемейств каналов Kv 1.1 -Kvl.7. Ку2-каналы имеют два подсемейства калиевых каналов Ку2.1, Kv2.2. Рисунок 1.3.1.1 демонстрирует схожесть структуры субъединиц, формирующих структуру потенциал-управляемых К+-каналов и тахі-К+-каналов. Однако, далее происходит разветвление, поскольку каналы кодируются различными генами. Ген KCNA, у млекопитающих, является эквивалентом гена Shaker у Drosophila, и кодирует Kyal-субъединицу [22, 23]. Каждый из KCNA генов продуцирует пороформирующие субъединицы для ионов К+, которые могут быть функциональными гомотетрамерами или гетеротетрамерами. Тетрамеры могут быть сформированы из любых Kya-субъединиц. Существуют также Р-субъединицы, которые являются вспомогательными и уменьшают время инактивации калиевого тока. Ген KCNB1, у млекопитающих, является эквивалентом гена Shab у Drosophila и кодирует потенциал-управляемые К+-каналы семейства Ку2.
На рисунке 1.3.2.2 отражена мембрана и встроенный в ее структуру потенциал-управляемый калиевый канал (Ку). Каждый канал, представляет собой композицию из 4 субъединиц [59, 89]. Одна а-субъединица состоит из шести трансмембранных а-спиралей, связанных вместе. Каждая субъединица имеет шесть участков гидрофобных аминокислот (S1-S6), которые формируют внутримембранные домены, и эти гидрофобные участки связаны последовательностью гидрофильных аминокислот, которые располагаются во внутриклеточном и внеклеточном пространстве. Каждая субъединица также имеет цитоплазматический амино- и карбокси-терминальный домен. Один внутримембранный домен в каждой субъединице (S4) заряжен, имеет основную аминокислоту (лизин или аргинин) каждый третий остаток, и участок S4 является важным компонентом чувствительности канала к потенциалу. Ионный канал формируется в той части, где находится трансмембранная последовательность участков S5 и S6 и называется Н5 или участок, где находится пора канала [59, 89]. Потенциал-управляемые (к.) Классификация К+-каналов. Верхняя панель - структура К+-канала. S1-S6 - внутримембранные домены, формирующие канал. (IUPHAR Pharm.Rev. 55 (2003) 583).
Четвертая спираль, S4, имеет по всей длине положительный заряд и действует как сенсор напряжения. Между пятой и шестой спиралями, S5 и S6, находится длинная петля, которую называют Н5 или Р-петля, располагающаяся глубоко в мембране. Она соединена с другими субъединицами, формируя пору. Н5 или Р петля не пересекает мембрану полностью и остатки во внутриклеточных концах S5 и S6 спиралей поддерживают структуру поры. Эта пора открывается, чтобы пропустить ионы К+ или закрывается в ответ на изменение мембранного потенциала, следовательно исследуемые К+-каналы являются потенциал-управляемыми, р-субъединица экспрессируется не со всеми потенциал-управляемыми К+-каналами и является дополнительной структурой, которая изменяет биофизические характеристики калиевых каналов. Ку2-каналы экспрессируются с Р-субъединицей. субъединиц состоит из шести трансмембранных доменов (S1-S6). 84-домен представляет собой сенсор напряжения. Канал ассоциирован с р-субъединицей, которая расположена в цитоплазме [69].
Функционально потенциал-управляемые К+-каналы представляют собой тетрамеры из а-субъединиц формирующих гомо- или гетеротетрамерную структуру канала. В семействе потенциал-управляемых К+-каналов Kv2, субъединица Ку2.1 может объединяться с Ку2.2 или с молчащей а 1-субъединицей, Kv8.1, Kv9.1, Kv9.2 и Kv9.3 формируя каналы с гетеромультимерной структурой и новыми биофизическими свойствами [36]. Когда Kyl.l канал экспрессируется как гомотетрамер К+-канал ведет себя как канал задержанного выпрямления, с медленной инактивацией и полумаксимальной активацией приблизительно —30 mV.
Фармакология Kvl, Kv2 К+-каналов
Ку-каналы играют важную роль в фазу реполяризации потенциала действия во многих возбудимых клетках. Однако многие гладкомышечные клетки артерий не генерируют потенциал действия, отвечая на стимуляцию изменением уровня мембранного потенциала и, возможно, Ку-каналы ограничивают деполяризацию мембраны в этих артериях. Пример вольт-амперной характеристики потенциал-управляемого К+-тока изображен на рисунке 1.3.2.1 [82]. Для ингибирования активности тахі-К+-каналов, авторы использовали 1 mM TEA и 1 цМ нимодипина.
Все изучаемые гладкомышечные клетки сосудов имеют, по крайней мере, один К+-ток, активируемый деполяризацией мембраны [12, 13, 19, 26, 41, 52, 53, 57, 74, 84, 88, 103, 116, 117, 118, 121]. Ку-каналы идентифицированы в одиночных гладкомышечных клетках из коронарного, мозгового, почечного, брыжеечного и легочного сосудистого сплетений [18, 26, 41, 52, 57, 74, 103, 116, 117, 118]. Мозговые артериолы контролируют кровоток в области корковых нейронов и являются значительным компонентом периферического сопротивления сосудов, определяющего кровяное давление.
Ку-каналы в гладких мышцах сосудов имеют подклассы на основе их зависимости от потенциала и фармакологии [13, 26, 53, 103, 118]. Несколько доказательств поддерживают идею о том, что один из типов Ку-каналов представлен в гладкомышечных клетках сосудов. Этот тип каналов включает в себя различия активации и инактивации канала в зависимости от потенциала, различия в чувствительности к ингибиторам и различия единичной проводимости канала. Например, быстрый ток, который активируется и инактивируется быстрее, чем большинство Ку-каналов в гладких мышцах сосудов описан для легочной артерии и воротной вены кролика [12, 26]. В обеих тканях этот ток может сосуществовать с Kv-каналом с медленной потенциал-управляемой активацией и инактивацией [12, 26, 84]. Быстрый ток также инактивируется при негативном мембранном потенциале, при котором инактивируется 50 % каналов, -76,8 и -49 мВ в воротной вене и легочной артерии соответственно [12, 26].
Недавно, попытки интенсифицировать идентификацию типов потенциал-управляемых К+-каналов в мозговой микроциркуляции, основывались на заключениях, что гладкомышечные клетки сосудов содержат Ку-каналы, участвующие в вазодилатации. Некоторые исследования демонстрируют, что Ку-каналы участвуют в поддержании потенциала покоя мембраны и изменении диаметра мелких мозговых сосудов. Фармакологическое ингибирование этих каналов деполяризует и ведет к сокращению мелких мозговых артерий и артериол в обоих случаях in vitro и in vivo.
Потенциал-управляемые К+-каналы играют важную роль в регуляции артериального тонуса посредством изменения мембранного потенциала гладкомышечных клеток сосудов. Контроль диаметра артерий и периферического сосудистого сопротивления зависит от тонуса гладкомышечной клетки является главной определяющей развития тонуса. Это контроль уровня входа ионов Са2+ через потенциал-зависимые Са2+-каналы. Уровень мембранного потенциала является результатом динамического равновесия между входящим и выходящим ионным током.
Фармакологические данные существуют для большого количества компонентов Ку-каналов. Ингибиторы неоценимы для изучения свойств и функциональной роли ионных каналов в работе гладкомышечных клеток и, как следствие, в регуляции тонуса гладких мышц сосудов. Многие каналы обнаруживают частичное совпадение свойств единичной проводимости, потенциал-управляемой активации и инактивации, чувствительности к фармакологическим антагонистам. [3]. 4-аминопиридин, является широко известным неспецифическим ингибитором Ку-каналов в мембране гладких мышц сосудов [13, 41, 57, 84, 88, 93, 103, 117]. На этом основании 4-аминопиридин используется для отделения Ку-тока от К+са тока, который также активируется деполяризацией мембраны [13, 41, 57, 82, 95, 103]. 4-аминопиридин ингибирует только часть Ку-тока многих клеток и увеличение концентрации 4-аминопиридина свыше определенного уровня не дает дальнейшего ингибирования; из этого следует, что, может быть, в некоторых гладкомышечных клетках сосудов присутствует 4-аминопиридин-нечувствительный ток [13, 84, 95, 103]. Также, 4-аминопиридин и другие ингибиторы предпочтительно блокируют быстроинактивирующийся компонент тока, указывающий на то, что различная фармакологическая чувствительность каналов лежит в основе существования скоротечного и непрерывного компонентов [88]. Однако, объяснение результатов механизма действия 4-аминопиридина затруднительно [82]. Например, ингибирование Ку-тока больше при более отрицательном потенциале мембраны [84, 95]. 4-аминопиридин может ингибировать открытый и закрытый канал. Физиологическая роль некоторых Ку-каналов, сейчас, лучше известна, благодаря исследованиям животных токсинов, обладающих высоким сродством к различным Kyoil субъединицам. Семейство Kvl-каналов имеет богатую фармакологию токсинов выделенных из ядов змей, скорпионов, морских животных.
Регистрация электрофизиологических свойств свежеизолированных гладкомышечных клеток
Основным методом, использованным для исследования электрофизиологических характеристик изолированных гладкомышечных клеток, является метод фиксации потенциала - patch-clamp. [46] Метод patch-clamp позволяет осуществлять локальную (точечную) фиксацию мембранного потенциала и исследовать ионные токи, протекающие через мембрану, через одиночные ионные каналы, идентифицировать и вычленить их. На данный момент этот метод является наилучшим для исследования ионных каналов в биологических мембранах. Преимущества метода: 1. позволяет регистрировать токи и потенциалы от клеток малых размеров ( 20 мкм); 2. позволяет регистрировать токи одиночных каналов амплитудой порядка пикоампер; 3. возможно исследование действия лекарственных препаратов при быстром подведении их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны, используя различные конфигурации метода patch-clamp. Основой для создания метода послужил факт, что при определённых условиях клеточная мембрана формирует плотный контакт с поверхностью кончика стеклянного микроэлектрода. При небольшом разрежении, создаваемом внутри пипетки, между стеклом и мембранным фрагментом возникает контакт, имеющий гигаомное сопротивление. В результате образуется электрически изолированный участок мембраны, и шум регистрирующего сигнала уменьшается на несколько порядков. Контакт мембраны со стеклом очень прочен, что позволяет образовывать различные конфигурации patch-clamp по отношению к клетке или фрагменту ее мембраны (рис.2.5.1). Конфигурации образуются специфическим образом, изложенным ниже.
Исходно patch-пипетку подводят вплотную к мембране изолированной клетки (рис.2.5.1 А) и создают в ней небольшое отрицательное давление (рис.2.5.1Б), в результате формируется плотный контакт. В этом случае ток, протекающий через мембрану, составляет несколько наноампер, почти полностью идет по пипетке и не шунтируется через контакт пипетки с мембраной. Такой контакт называется cell-attached, а гигаомное сопротивление называется giga seal. После нормализации давления в пипетке конфигурация cell-attached близка к физиологической ситуации, поскольку зона мембраны, захваченная пипеткой, с внутренней стороны контактирует с нормальной интрацеллюлярной жидкостью, а с внешней стороны со стандартным экстрацеллюлярным раствором, заполняющим patch-пипетку. Эта конфигурация с одной стороны позволяет регистрировать одиночные ионные каналы под patch-пипеткой и с другой стороны является промежуточной для других. Cell-attached позволяет сформировать другую конфигурацию, называемую inside-out patch, путем резкого отведения пипетки от поверхности клетки (Рис.2.5.1В), причем giga seal не изменяется. В этом случае на кончике пипетки находится лишь фрагмент мембраны, обращенный внутренней стороной в омывающий раствор перфузионной камеры, а внешней стороной мембрана контактирует с содержимым пипетки. Эта конфигурация используется для изучения вклада соединений цитоплазмы в активность ионных каналов.
Конфигурация cell-attached позволяет двумя путями (в зависимости от задач исследователя) сформировать конфигурацию, называемую whole-cell. В одном случае для ее получения в пипетку необходимо резко и одномоментно подать небольшое отрицательное давление, что разрывает мембрану под пипеткой и образуется низкоомный путь между внутренней средой клетки и раствором в пипетке. При этом в мембране возникает дырка, величина которой позволяет осуществлять обмен ионов и различных соединений между пипеткой и цитоплазмой (рис.2.5.1Г). В другом случае низкоомный путь между внутренней средой клетки и раствором в пипетке формируется за счет влияния соединений, находящихся в пипетке, которые вызывают образование в мембране пор, проницаемых для ионов, но не для молекул. Это, так называемый, перфорированный patch. Два антибиотика nystatin и amphotericin-B используют в пипеточном растворе, чтобы образовать специфические поры на участке мембраны под пипеткой. Они позволяют проходить моновалентным катионам и анионам через мембрану. Еще одно соединение - gramicidin позволяет формировать каналы, проницаемые только для моновалентных катионов. Измерение на целой клетке при разрушении мембраны в кончике микропипетки (whole-cell) позволяет заменять ионный состав цитоплазмы и изучать на диализированных таким образом клетках ионные токи в режиме фиксации напряжения. Конфигурация whole-cell позволяет сформировать другую конфигурацию, называемую outside-out patch (рис.2.5.1Д). Медленное отведение пипетки от клетки заставляет мембрану растягиваться до тех пор, пока она не отделится от клетки и не сомкнётся. Теперь внутренняя часть мембраны будет контактировать с раствором в пипетке, а внешняя часть мембраны с омывающим раствором в перфузионной камере. Эта конфигурация используется для изучения вклада соединений внешней среды клетки в активность одиночных каналов.
Изучение механосенситивности изолированных клеток
Из литературных данных известно, что при стимуляции катионных механосенситивных каналов [24] осуществляется вход Са2+ в клетку, и это приводит к повышению концентрации цитозольного Са2+ до микромолярного уровня, вызывая активацию Са -зависимых maxi-K -каналов. Поскольку электромеханическое сопряжение связано с поступлением из внешней среды через потенциал-управляемые ионные каналы ионов Са , изучение maxi-K -каналов приобретает большое значение для исследование механизмов механоэлектрической обратной связи в сосудах. Задачей проведенных экспериментов явилось доказательство того, что исследуемые токи текут через тахі-К+-канальі. На рис.3.1.1.1 представлена оригинальная вольт-амперная характеристика К+-тока изолированной гладкомышечной клетки, в отсутствие каких-либо ингибиторов тока через тахі-К+-канальі. Серию экспериментов (п=4), выполняли с помощью методики patch-clamp, в конфигурации whole-cell. Величина К+-тока, зарегистрированного через 5 минут после начала эксперимента, равна 1236 рА при величине мембранного потенциала 100 mV (кривая 1), а величина тока, зарегистрированного через 15 минут после начала эксперимента, равна 1236 рА при величине мембранного потенциала 100 mV (кривая 2).
Кривые средних значений К+-тока представлены на рисунке 3.1.1.2, протекающего через мембрану при смещении мембранного потенциала до 100 mV через 5 и 15 минут после получения конфигурации whole-cell. График демонстрирует, в среднем, незначительные изменения величины К тока в течение эксперимента. Величина К+-тока зарегистрированного через 5 минут после эксперимента была равна 1023±231.1 рА (при смещении мембранного потенциала до 100 mV), и достоверно не отличалась от величины К+-тока, зарегистрированного через 15 минут после эксперимента 890.48±118.14 рА при аналогичном смещении потенциала (n=5, P=ns). КрА). Вольт-амперная характеристика контрольного тока через maxi-K -каналы в гладкомышечной клетке зарегистрированного после получения whole-cell. Оригинальная регистрация. По оси абсцисс отложен потенциал мембраны гладкомышечной клетки (mV), по оси ординат - значение тока в мембране гладкомышечной клетки (рА). 1 — ток, зарегистрированный через 5 минут после получения whole-cell. 2 - ток, зарегистрированный через 15 минут после получения whole-cell. Holding potential -40 mV.
Таким образом, изолированные гладкомышечные клетки обладали жизнеспособностью и имели типичную для шахі-К+-каналов вольт-амперную характеристику. В течение всего периода регистрации выходящего К -тока значения вольт-амперной характеристики достоверно не отличались вначале и в конце эксперимента. ИРА. Типичная вольт-амперная характеристика контрольного тока через тах1-К+-каналы в гладкомьппечных клетках, выделенных из участка большой хвостовой артерии крысы. По оси абсцисс отложено значение потенциала мембраны гладкомышечной клетки (mV), по оси ординат - значение тока в гладкомышечной клетке (рА). Кривая (1) - ток, зарегистрированный через 5 минут после получения whole-cell. Slope - 0.045. Кривая (2) - ток, зарегистрированный через 15 минут после получения whole-cell. Slope - 0.041.
На рисунке 3.1.1.3 представлена оригинальная регистрация тока через тахі-К+-канальі, зарегистрированного в мембране гладкомышечной клетки при ступенчатом смещении потенциала от -90 mV до -45 mV в течение 140 ms. Рисунок демонстрирует ток до растяжения клетки (рис. 3.1.1.3 — цифра 1) и после растяжения клетки (рис. 3.1.1.3 — цифра 2). Из рисунка 3.1.1.3, взятого в качестве примера изменения тока в ответ на смещение мембранного потенциала от -90 mV до -45 mV, следует, что при растяжении клетки на 2 цт ток, регистрируемый на фоне поддерживаемого потенциала, смещается в негативную область на величину, примерно равную 200 рА. На фоне ступеньки смещаемого потенциала ток смещается также в более негативную область и оба этих смещения свидетельствуют о возникновении, на фоне растяжения, входящего тока (ступенчатое смещение мембранного
