Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 1
ВВЕДЕНИЕ 2
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Нейрогуморальная регуляция желудка 9
Центральная нервная система 9
Вегетативная нервная система 12
Энтеральная нервная система .. 14
Гуморальная и паракринная регуляция 15
Гомеостаз слизистой оболочки желудка 31
Агрессивные факторы желудочного сока 31
Защитные факторы желудочного сока 36
Патогенез и фармакологическая коррекция язвенной болезни 52
Патогенез язвенной болезни , 52
Патогенетические факторы, лежащие в основе различных
экспериментальных моделей язвообразования..., 54
Фармакотерапия язвенной болезни 62
Глипролины 66
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 86
Исследование защитных свойств глипролинов в отношении СОЖ
при воздействии различных повреждающих факторов 89
Исследование влияний PGP и его возможных метаболитов -пептидов PG и GP на повреждения СОЖ, вызванные
этанолом, стрессом и веществом 48/80 89
Исследование зависимости защитных свойств PGP и его
возможных метаболитов -
PG и GP - от дозы вводимых препаратов 89
Исследование временного периода развития максимальных
ацетатных язв и периода их заживления 89
Исследование влияния пептидов на развитие и заживление
ацетатных язв 89
Определение оптимального временного интервала для проявления противоязвенных свойств PGP в отношении
этаноловых повреждений 90
Исследование и сравнение защитных свойств PGP при
внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении на
этаноловой и ацетатной моделях язвообразования 90
Исследование возможных механизмов противоязвенного действия
PGP, PG и GP 90
Изучение влияний PGP, PG и GP на секрецию кислоты и
бикарбонатов в желудке 90
Изучение влияний PGP на желудочный кровоток 95
Изучение влияний PGP, PG и GP на норадренолиновый
тонус кольцевого препарата аорты крысы 97
Изучение метаболизма PGP в организме крыс и особенностей его
выведения 100
Исследование поступления PGP в некоторые органы и ткани
крыс после внутрижелудочного введения [3H]PGP 100
Изучение особенностей выведения PGP из организма крыс
после внутрижелудочного введения [3H]PGP 101
Статистическая обработка 102
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 103
Исследование защитных свойств глипролинов в отношении СОЖ
при воздействии различных повреждающих факторов 103
Исследование влияний PGP и его возможных метаболитов -пептидов PG и GP на повреждения СОЖ, вызванные
этанолом, стрессом и веществом 48/80 103
Исследование зависимости защитных свойств PGP и его
возможных метаболитов -
PG и GP-от дозы вводимых препаратов 106
Определение оптимального временного интервала для проявления противоязвенных свойств PGP в отношении
этаноловых повреждений 108
Исследование временного периода развития максимальных
ацетатных язв и периода их заживления 111
Исследование влияния пептидов на развитие и заживление
ацетатных язв 112
Исследование и сравнение защитных свойств PGP при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении на
этаноловой и ацетатной моделях язвообразования 115
Исследование возможных механизмов противоязвенного действия
PGP,PGhGP 119
Изучение влияний PGP, PG и GP на секрецию кислоты и
бикарбонатов в желудке 119
Изучение влияний PGP на желудочный кровоток 126
Изучение влияний PGP, PG и GP на норадренолиновый
тонус кольцевого препарата аорты крысы 128
Изучение метаболизма PGP в организме крыс и особенностей его
выведения 133
Исследование поступления PGP в некоторые органы и ткани
крыс после внутрижелудочного введения [ HJPGP 133
Изучение особенностей выведения PGP из организма крыс
после внутрижелудочного введения [3H]PGP 138
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 140
ВЫВОДЫ 158
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 160
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Выяснение механизмов поддержания гомеостаза слизистой оболочки
желудка (СОЖ) и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в целом представляет собой одну из центральных проблем современной физиологии и медицины. Особое внимание уделяется роли регуляторных пептидов в сложном процессе, каковым является гомеостаз слизистой оболочки желудка. Эта проблема имеет два основных аспекта - функциональный и морфологический. Первый включает в себя круг вопросов, касающихся всего разнообразия влияния РП на физиологические реакции организма, обеспечивающих постоянство гомеостаза СОЖ, механизмов этих реакций и принципов их взаимодействия. Задачей второго является выяснение структурных изменений, которыми сопровождаются эти реакции. Для выяснения последнего аспекта хорошо подходят экспериментальные модели язвооб-разования, тем более, что при многих внутренних болезнях этиологические и патогенетические факторы, иногда тесно взаимодействующие, крайне трудно разграничить. Разные модели язвообразования затрагивают различные механизмы нарушения гомеостаза СОЖ и достаточно хорошо могут охарактеризовать биологическую и фармакологическую активность исследуемых веществ.
Диссертационное исследование посвящено изучению семейства гли-пролинов, представленного короткими пролин- и глицинсодержащими пептидами - PGP, PG, GP и др. (Ашмарин и др., 2002). Наш интерес к гли-пролинам обоснован уникальным спектром их физиологической активности. Они тормозят кровесвертывание и тромбообразование (Ашмарин, Ля-пина и др., 1996; Ашмарин, Пасторова и др., 1998), усиливают лимфоток брыжейки крыс (Ашмарин, Каразеева, Лелекова, 1999), регулируют активность лейкоцитов (Haddox et al., 1999), стабилизируют тучные клетки (Умарова и др., 2003), принимают участие в регуляции гомеостаза слизистой оболочки желудка (Абрамова и др., 1996; Ашмарин, Каразеева и др.,
1998) и предотвращают стрессогенные нарушения поведения (Бадмаева и др., 2004) и микроциркуляции брыжейки крыс (Копылова и др., 2003). Глипролины также входят в состав ряда пептидов, относящихся к другим семействам регуляторных пептидов, например, энтеростатинов, |3-казоморфинов и др. (Ашмарин и др., 2002).
Гипотеза, выдвигнутая И.П. Ашмариным в 1968 году предполагает существование в организме функционально непрерывной совокупности РП - континуума, способного обеспечить стимуляцию или подавление любых проявлений жизнедеятельности и, более того, любых «оттенков» жизнедеятельности (Ашмарин, Обухова, 1986). На основании детального анализа соматических и поведенческих эффектов РП авторы сделали вывод о возможных отдаленных следствиях изменений концентрации того или иного РП в средах организма. Вслед за прямыми эффектами РП может следовать целый каскад реакций выброса других РП, которые, в свою очередь, будут проявлять ряд влияний на функции организма и, одновременно, индуцировать выброс следующей группы РП, которые снова модулируют ряд функций и т.д. Такие цепные реакции были названы каскадными эффектами (Ашмарин, Обухова, 1986). Таким образом, активация одного РП может изменить состояние всего пептидного континиума, причем на время гораздо более длительное, чем период первичных, прямых эффектов данного РП. На этом основании становится понятной актуальность расширенных исследований биологической активности РП, их распределения в органах и тканях, а так же эффективных концентраций, не говоря уже о структурах рецепторов РП.
Следует отметить, что актуальным является не только комплексное изучение глипролинов как нового класса регуляторных пептидов, но и сама проблема сохранения целостности слизистой оболочки желудка при воздействии на нее различных повреждающих факторов. Это связано с тем, что у людей язвенная болезнь относится к числу наиболее часто встречающихся заболеваний внутренних органов (Рысс, Звартау, 1998).
Хроническая форма болезни, рецидивы и осложнения, сопровождающие ее, требуют поиска новых лекарственных средств для предупреждения и лечения данной болезни.
Ранее было показано, что трипептид Pro-Gly-Pro обладает стабильными протекторными противоязвенными эффектами в дозе 1мг/кг на этано-ловой, индометациновой и стрессорной моделях язвообразования у крыс (Абрамова и др., 1996). Стабильные противоязвенные эффекты PGP, выявленные на разных экспериментальных моделях язвообразования характеризует его как регуляторныи пептид, действующий и на центральные, и на периферические механизмы поддержания гомеостаза СОЖ. Однако, вплоть до настоящего времени, не до конца изучены механизмы противоязвенного свойства PGP: уменьшает ли он агрессивные факторы желудочного сока или увеличивает эффективность защитных механизмов; также не выясненны возможности его лечебного противоязвенного действия.
Особое внимание, по-нашему мнению, стоит уделить влиянию гли-пролинов на кровоток в СОЖ и путям реализации этого влияния, так как по последним сведениям (Самонина, Жуйкова, 2002), вещества, обладающие влиянием на желудочный кровоток, способны корректировать функциональное состояние слизистой оболочки желудка, защищая ее от повреждающего воздействия ульцерогенных факторов. В связи с открывающейся перспективой использования глипролинов и/или их предшественников в качестве антитромботических и фибринолитических агентов, такие сведения могут быть полезными.
Гидролиз Pro-Gly-Pro под действием пролилпептидаз может приводить к образованию дипептидных дериватов, которые могут обладать собственной биологической и фармакологической активностью. Предварительные исследования показали, что его дипептидные метаболиты в дозе 1мг/кг неоднозначно повышают устойчивость слизистой желудка к воздействию повреждающих агентов: Pro-Gly уменьшает этаноловые повреждения, Gly-Pro, наоборот, эффективен только на стрессорной модели (Аб-
рамова и др., 1996). Поэтому, необходимо изучить влияния дериватов Рго-Gly-Pro на основные параметры гомеостаза СОЖ и исследовать возможные механизмы такого действия. Количественный и качественный состав ферментов может меняться в зависимости от изменений внутренних и внешних факторов, что, вероятно, может приводить к преимущественному образованию одного или другого деривата. В связи с этим, целесообразно выявить активные концентрации как самого трипептида, так и его дипеп-тидных метаболитов.
Явными преимуществами глипролинов перед другими противоязвенными средствами являются эндогенное происхождение этих пептидов, комплексность их воздействия на слизистую оболочку желудка (СОЖ) и организм в целом, отсутствие токсичности, привыкания и побочных эффектов. Единственным препятствием к применению глипролинов в качестве современных лекарственных средств является полное отсутствие информации о содержании и преимущественной локализации эндогенных глипролиновых пептидов, за исключением цикло-Pro-GIy (эндогенного ноотропа и анксиолитика), обнаруженного в мозге крыс и мышей (Гудаше-ва и др., 1996). Динамика концентраций глипролинов в тканях и жидкостях организма после их перорального (основного способа приема лекарств человеком) введения также неизвестна. Кроме того, для решения вопроса применения PGP в качестве противоязвенного средства важно выяснить: сохраняется ли противоязвенная активность при пероральном введении трипептида и какова эффективность этого действия.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучить участие PGP в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка и определить роль его основных метаболитов - PG и GP в осуществлении эффектов самого трипептида.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать влияние PGP и его дипептидных метаболитов - PG и GP в широком диапазоне концентраций на повреждения СОЖ, вызванные эта-
нолом, стрессом, веществом 48/80 и ледяной уксусной кислотой; изучить влияние трехдневного применения глипролинов на заживление экспериментальной ацетатной язвы.
2. На этаноловоЙ и ацетатной моделях язвообразования сопоставить эф
фективность противоязвенных свойств PGP при пероральном и паренте
ральном его введении.
На этаноловой экспериментальной модели определить оптимальное время парентерального введения трипептида для проявления максимального гастропротекторного действия.
Для определения основных механизмов защитного и лечебного противоязвенного действия глипролинов исследовать влияние PGP, PG и GP на основные параметры гомеостаза СОЖ:
Базальную и стимулированную секрецию кислоты Базальную и стимулированную секрецию бикарбонатов Базальный и уменьшенный этанолом кровоток в СОЖ
Для выявления механизмов сосудорасширительных влияний PGP, PG и GP исследовать вазоактивные свойства пептидов на норадреналино-вом тонусе интактного и деэндотелизированного кольцевого препарата аорты крысы
Определить возможность проникновения PGP и его метаболитов из желудочно-кишечного тракта в кровь и через гематоэнцефалический барь-ер после перорального введения [ H]PGP, а также время жизни пептидов в крови и интенсивность их накопления в тканях некоторых органов крыс со временем.
Научная новизна.
В экспериментах на животных показаны гастропротекторные свойства PGP и его дериватов - PG и GP в широком диапазоне концентраций при воздействии различных повреждающих факторов (этанол, вещество 48/80, стресс и уксусная кислота). Установлено оптимальное время парентераль-
ного введения PGP в организм для проявления его максимального гастро-протекторного действия (30 мин).
Впервые доказано, что противоязвенные свойства PGP проявляются при пероральном его введении в организм и по своей эффективности не уступают противоязвенным свойствам этого пептида при парентеральном способе введения.
На экспериментальной модели ацетатного язвообразования у крыс выявлены не только протекторные, но и лечебные противоязвенные эффекты PGP, PG и GP.
Впервые проведен длительный анализ влияний PGP, PG и GP на кислую и бикарбонатную секрецию желудка. Установлено, что PGP восстанавливает уменьшающуюся со временем в контроле базальную и уменьшает стимулированную кислую секрецию у крыс; увеличивает базальную и поддерживает на постояннном уровне увеличенную стимулированную бикарбонатную секрецию. GP увеличивает и базальную, и стимулированную кислую и бикарбонатную секрецию по сравнению с контролем. PG не оказывает существенных изменений желудочной секреции.
Для PGP обнаружена не только способность нормализовать кровоток СОЖ, нарушенный индометацином, но и предотвращать его падение, вызванное этанолом. Впервые было показано, что глипролины могут уменьшать норадреналиновый тонус кольцевого сегмента аорты крысы, реализуя свои эффекты через эндотелий зависимые механизмы, в которые задействован оксид азота. GP, кроме того, непосредственно влияет на гладкомы-шечные клетки.
С помощью меченого тритием PGP установлено относительно высокая устойчивость трипептида к протеолизу к пептидазам желудочно-кишечного тракта и крови. Впервые получены доказательства проникновения PGP, частично в неизменном виде, из ЖКТ в кровь. Показано проникновение радиоактивной метки в мозг и накопление ее в органах желудоч-но-кишечного тракта после внутригастрального введения [ H]PGP.
Практическое значение.
Показанное в экспериментах на животных гастропротекторное и терапевтическое действие PGP и его возможных метаболитов PG и GP дает обоснование необходимости предклинических исследований PGP в качестве противоязвенного препарата. Способность проникать, частично в неизменном виде, из желудочно-кишечного тракта в кровь после перораль-ного введения и относительно высокая устойчивость трипептида в крови делает возможным применение препарата в виде удобных для приема человеком таблетированных форм или продуктов богатых такими последовательностями. Доказано, что противоязвенные свойства PGP при перораль-ном введении в организм не уступают таковым при его парентеральном введении. Установлено оптимальное время введения PGP в организм для проявления его максимального гастропротекторного действия.
Накопление глипролинов в органах ЖКТ и в мозге предполагает одновременное корректирующее влияние пептидов как на периферические, так и на центральные механизмы повышения устойчивости СОЖ к действию ульцерогенных факторов.
Положительное влияние PGP и его дипептидных метаболитов на широкий спектр механизмов, принимающих участие в поддержании гомео-стаза слизистой оболочки желудка (кровоток, секрецию кислоты и бикарбонатов) и литературные сведения о снятии им стрессогенных нарушений, делает его применение независимым от этиологии и типа патогенетических факторов язвенной болезни.
В связи с открывающейся перспективой использования глипролинов в качестве антитромботических и фибринолитических агентов, выявленный нами механизм вазодилятаторного свойства глипролинов на норадренали-новый тонус сосудов, а именно активация синтеза N0, может быть полезным при создания нового современного препарата, улучшающего как реологические свойства крови, так и гемодинамику (при условии дальнейших исследований этих механизмов).
