Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Биологическая роль и медицинское значение полиаминов 11
1.1. Химическое строение и распространение полиаминов 11
1.2. Метаболизм полиаминов и факторы его регуляции 13
1.3. Необходимость полиаминов для роста и развития 15
1 .4. Связывание, транспорт и выведение полиаминов из организма 21
1.5. Роль полиаминов в репродуктивной системе 40
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 43
2.1. Материалы исследования 43
2.2. Морфологические, функциональные и физико-химические методы исследования спермы 45
2.3. Экстракция полиаминов 47
2.4. Хроматографические методы исследования полиаминов 48
2.4.1. Адсорбционная хроматография 48
2.4.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография 49
2.5. Электрофоретические методы исследования полиаминов 50
2.5.1. Электрофорез на бумаге 51
2.5.2. Электрофорез в агаровом геле 51
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований 53
3.1. Способ количественного определения полиаминов в спермоплазме .. 53
3.1.1. Расчёт содержания полиаминов (спермина и спермидина) в спермоплазме 63
3.1.2. Калибровочный график 64
3.2. Содержание полиаминов (спермина и спермидина) в спермоплазме фертильных мужчин и мужчин с разными формами субфертильности 68
3.2.1. Связь уровня полиаминов спермоплазмы с различными физико- химическими характеристиками эякулятов субфертильных мужчин 71
3.2.2. Связь уровня полиаминов спермоплазмы с концентрацией сперматозоидов в эякулятах субфертильных мужчин 73
3.2.3. Связь уровня полиаминов спермоплазмы с различными двигательными характеристиками сперматозоидов в эякулятах субфертильных мужчин 75
3.2.4. Связь уровня полиаминов спермоплазмы с содержанием мёртвых сперматозоидов в эякулятах субфертильных мужчин 80
3.2.5. Связь уровня полиаминов спермоплазмы с различными показателями воспаления в спермограмме субфертильных мужчин 82
3.2.6. Связь уровня полиаминов спермоплазмы с различными морфологическими характеристиками сперматозоидов в эякулятах субфертильных мужчин 86
3.2.7. Содержание полиаминов (спермина и спермидина) в спермоплазме мужчин с разными формами субфертильности 88
Заключение 111
Выводы 113
Практические рекомендации 114
Литература 115
- Химическое строение и распространение полиаминов
- Необходимость полиаминов для роста и развития
- Морфологические, функциональные и физико-химические методы исследования спермы
- Способ количественного определения полиаминов в спермоплазме
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бесплодие является насущной медико-социальной проблемой. [Пшеничникова Т.Я и др., 1994, Овсянникова Т.В. и др., 1998, Евдокимов В.В., 1999]. В настоящее время, согласно данным ВОЗ, бесплодием страдают около 15 - 18 % супружеских пар. Причём более чем в половине случаев это связано с нарушением репродуктивной функции мужчины [Евдокимов В.В., 1999].
Наиболее распространённой патологией мужской репродуктивной функции является состояние субфертильности [Николаев АА, 1994]. Показатели спермограммы таких мужчин занимают промежуточные между нормой и патологией значения.
В обеспечении становления функциональной зрелости сперматозоидов определённую роль играют компоненты семенной плазмы, которые оказывают влияние на сперматогенез и созревание сперматозоидов [Устинкина Т.П. и др., 1987, Николаев АА, Аншакова Н.И., 1991, Евдокимов В.В. и др., 1995, Липатова Н.А, 1998, Неймарк А.И. и др., 1998, Николаев А.А. и др., 1998, Луцкий Д.Л., Николаев АА, 1999, Луцкий Д.Л., Николаев АА, 2000, Терентьев АА, Таги-роваА.К., 2000]. До настоящего времени не выяснена роль полиаминов в семенной жидкости, в которой их содержание у различных видов животных и у человека достаточно высокое [Полунин А.И. и др., 2001, Lynch MJ. et. al., 1997].
В литературе встречаются отдельные работы, посвященные содержанию полиаминов в спермоплазме, но связи между их уровнем и такими характеристиками эякулята как объём, подвижность, жизнеспособность и морфология сперматозоидов остаётся, не выяснена.
Учитывая важную роль, которую играют полиамины в обмене нуклеиновых кислот и, в частности ДНК, нормальный метаболизм этих соединений необходим для формирования оплодотворяющих свойств спермы.
Возможно, именно исследование спермоплазмы и определение содержания в ней полиаминов в норме и при различных патологических состояниях позволило бы не только расширить наши представления о молекулярных механизмах становления функциональной зрелости сперматозоидов и истинных причинах нарушения репродуктивной функции у мужчин, но и обеспечить своевременную диагностику, определить тактику терапии, возможно, наметить новые пути лечения, осуществить контроль над зффективностиопроііод»мдіх^іцсщедур.
Цель исследования: Провести определение уровня полиаминов спермоплазмы в норме, оценить функциональную роль полиаминов спермоплазмы в процессе фертилизацин и при различных нарушениях фертилыюсти.
Основные задачи исследования:
Разработать простой, доступный и чувствительный способ количественного определения полиаминов в спермоплазме.
Изучить качественный и количественный полиаминный состав спермоплазмы здоровых мужчин.
Изучить изменение уровня и соотношения полиаминов спермоплазмы при различных нарушениях фертильности.
Исследовать изменение спектра полиаминов спермоплазмы при различных нарушениях фертильности.
Выявить взаимосвязь физико-химических, морфологических и функциональных показателей оплодотворяющей способности эякулятов мужчин с уровнем и соотношением полиаминов спермоплазмы.
Научная новизна.исследования: Впервые выявлена взаимосвязь основных показателей оплодотворяющей способности эякулятов мужчин с уровнем и соотношением полиаминов спермоплазмы. Изучено участие полиаминов спермоплазмы в формировании оплодотворяющей способности эякулята. Впервые изучено изменение уровня, спектра и соотношения полиаминов спермоплазмы при различных нарушениях репродуктивной функции мужчин.
Научно-практическая значимость работы: Предложен и применён простой, доступный и чувствительный способ количественного определения полиаминов, который может быть использован для прямой оценки уровня полиаминов в спермоплазме в норме и при патологии.
Установлен уровень и соотношение спермина и спермидина в спермоплазме в норме и при различных нарушениях репродуктивной функции у мужчин.
Выявлена связь между уровнем полиаминов спермоплазмы и различными физиологическими характеристиками эякулята.
Изучено влияние спермина и спермидина спермоплазмы на процесс становления функциональной зрелости сперматозоидов.
Апробация работы: Результаты работы представлены и доложены на: Ш конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, СГМУ, 2002 г.); V Всероссийской научной конференции «Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия» (Астрахань, 2002 г.); VI Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы Бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2003 г.); Итоговых научно-практических конференциях Астраханской государственной медицинской академии (Астрахань, 2002, 2003 г.); Международном форуме «Аналитики и Аналитика» (Воронеж, 2003 г.); V Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Кисловодск, 2004 г.).
Публикации и изобретения: По теме диссертации опубликованы 12 научных работ; получен 1 патент на изобретение и 1 свидетельство об официальной регистрации программы для ПЭВМ; поданы 2 заявки на изобретения.
Положения, выносимые на защиту.
1. Разработанный достоверный и доступный в применении
способ количественного определения полиаминов в спермоплазме,
может быть использован для исследования функции оплодотворения и
для диагностики её нарушений.
Определено содержание спермина и спермидина и соотношение между ними в спермоплазме фертильных мужчин.
Выявлена тесная связь уровня полиаминов спермоплазмы с концентрацией сперматозоидов в эякуляте и положительная корреляция уровня спермидина со скоростью сперматозоидов и числом их активно подвижных форм, установлено, что спермин в физиологических концентрациях препятствует агглютинации и агрегации сперматозоидов, а превышение физиологического уровня спермина вызывает снижение подвижности и увеличение числа мёртвых сперматозоидов.
Обнаружено изменение уровня полиаминов спермоплазмы и соотношения между ними при различных нарушениях фертильно-сти.
Объём н структура диссертации: Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 19 таблиц и 32 рисунка. Она состоит из введения; четырёх глав, включающих обзор литературы, описание методов исследования, изложения фактического материала и обсуждения полученных результатов; заключения; выводов, практических реко-
мендаций; указателя использованной литературы. Библиографический указатель содержит 238 источников, из них 145 на иностранных языках.
Химическое строение и распространение полиаминов
К основным полиаминам животных тканей относятся спермин и сперми-дин. Предшественник полиаминов - диамин путресцин - также причисляют к полиаминам. Ниже представлена структура основных полиаминов: H2N-CH2-CH2-CH2-NH- СН2-СН2-СН2- CH2-NH- СН2- СН2- CH2-NH2 Спермин (N, N - бис (3 амино-пропил) - 1,4диаминобутан; 1,12-диамино-4,9диазадодекан) М = 202,3 H2N-CH2-CH2-CH2-NH- CH2-CHrCH2- CH2-NH2 Спермидин (N - (3-аминопропил) - 1,4диаминобутан; 1,8-диамино 4аза-октан) М = 145,2 H2N-CH2-CH2-CHr CH2-NH2 Путресцин (1,4-бутандиамин; 1,4диаминобутан; тетраметилендиамин) М = 88,2
Как видно, полиамины спермин и спермидин являются низкомолекулярными органическими эвдогенными поликатионами и имеют соответственно 4 и 3 основные группы. Путресцин содержит две аминогруппы. Полиамины обнаружены во всех живых организмах (у животных и растений, в водорослях и грибах, бактериях и даже вирусах). В тканях и биологических жидкостях животных присутствуют спермин, спермидин, а путресцин содержится в них лишь в незначительном количестве. Ткани эукариотов содержат спермин и спермидин в миллимолярных концентрациях, а также в значительно меньших количествах путресцин (наномоли). У прокариотов содержание путрес-цина более высокое, чем спермидина, а у большинства бактерий, за исключением лишь некоторых видов, отсутствует спермин [8, 29, 77, 92].
Ранее ошибочно полагали, что спермин встречается только в предстательной железе и это вещество свойственно лишь мужскому организму [8, 191]. Однако А.В. Пель обнаружил, что спермин не является исключительной составной частью лишь мужских репродуктивных органов, он установил наличие спермина не только в предстательной железе, но и в яичках, яичниках, поджелудочной железе, селезенке, щитовидной железе, а также в крови [8, 191].
В клетке полиамины распределены неравномерно - имеются определенные градиенты их концентрации, кроме того, содержание полиаминов в тканях зависит от скорости роста и типа ткани, возраста и других условий. Показано, что содержание спермидина наиболее высокое у новорожденных крысят и снижается с возрастом [8].
По данным Бердинских Н.К., Залеток СП. [8] общее содержание полиаминов в ткани печени крысят выше, чем у взрослых животных. Причем в ткани печени крысят преобладает спермидин, на долю которого приходится более 60% общего количества полиаминов; в ткани печени взрослых животных преобладает спермин; а величина отношения спермидин / спермин также с возрастом уменьшается. Общее же содержание полиаминов в ткани почек ниже, чем в ткани печени, особенно у крысят, и во все возрастные периоды преобладает спермин. В противоположность данным, полученным для ткани печени, возрастных особенностей в содержании полиаминов в ткани почек не выявлено.
Наличие возрастных особенностей в содержании полиаминов в печени крыс и отсутствие их в почках связано, по-видимому, с белоксинтезирующей функцией печени, с синтезом белков сыворотки крови и других белков, необходимых всему организму.
Высокое содержание спермидина в клетках с высокой скоростью синтеза белка и накопление спермина в стареющих клетках свидетельствуют о различиях в биологических функциях этих полиаминов.
Наиболее высокое содержание полиаминов обнаружено в поджелудочной железе, тимусе и других железах, а также в печени крыс, т.е. в органах, где происходит интенсивный синтез белков [8]. Ткани с высокой скоростью синтеза белка имеют высокое молекулярное отношение спермидин / спермин. В высокодифференцированных тканях наивысшая концентрация спермина и самое низкое соотношение спермидин / спермин (0,3 - 0,5) [5].
Было исследовано внутриклеточное распределение полиаминов. Наибольшее количество полиаминов содержится в микросомах (55-60%), где происходит биосинтез белка. Однако есть наблюдения, что рибосомы могут включать полиамины из цитоплазмы после разрушения клеток [8]. Такая ситуация может иметь место, если учесть, что во время выделения клеточных субчастиц полиамины могут элиминироваться из них и, вследствие своей по-ликатионной природы, связываться с другими полианионами [118]. Например, известно, что количество спермина и спермидина в рибосомах зависит от условий выделения последних (от ионной силы, температуры, рН среды и т.п.). Показано, что в присутствии ОДМ КО в среде большая часть внутриклеточного спермина связана с рибосомами, тогда как при концентрации KCI 0,ЗМ количество связанного с рибосомами спермина существенно меньше. Концентрация полиаминов в субклеточных частицах печени крыс коррелирует с содержанием в них нуклеиновых кислот [8].
Полиамины образуются в результате декарбоксилирования аминокислот — орнитина, аргинина, лизина и их синтез находится под контролем гормональной системы [153, 187,188, 219].
Путресцин является исходным материалом для биосинтеза спермидина и спермина, для которых необходимы также метионин и АТФ. Ферментативный биосинтез полиаминов осуществляется двумя синтазами: спермидинсин-таза катализирует образование спермидина путем присоединения к путрес-цину одной аминопропиловой группы; сперминсинтаза добавляет другую такую же группу к спермидину, в результате чего образуется спермин [8, 219]. Возможно, существует и другой механизм образования спермина, не связанный с присоединением аминопропильной группы к имеющемуся сперми-дину [91].
Регуляция содержания полиаминов в клетке осуществляется двумя путями: с помощью фермента, участвующего в синтезе этих соединений, и фермента, катализирующего их распад. Сложилось мнение, что основная роль в регуляции уровней полиаминов в клетке принадлежит орнитиндекарбоксила-зе (ОДК), катализирующей синтез путресцина, который служит предшественником спермидина и спермина [6, И, 12, 14, 40, 57, 60, 61, 79, 81, 100, 105, 106, 132,153,160,169, 174,187,188, 201, 208, 209, 219].
Содержание ОДК в не стимулированных тканях животных очень низкое (исключение составляет предстательная железа).
Изучению регуляции активности ОДК полиаминами в тканях животных посвящено большое число работ [112, 135, 136, 169, 219].
В опытах in vitro путресцин, спермидин и спермин оказывают очень слабое ингибирующее действие на ферментативную активность ОДК, а в опытах in vivo - сильное. Механизмы подавления ОДК полиаминами не ясны. Предполагается, что активность ОДК может регулироваться состоянием чувствительных к полиаминам участков клеточной мембраны.
Высказывается предположение, что цАМФ может быть важным фактором в синтезе полиаминов [202, 223,224].
Необходимость полиаминов для роста и развития
Полиамины спермин, спермидин и их предшественник путресцин играют существенную роль в жизнедеятельности. Биологические свойства этих соединений уникальны. Они осуществляют сложные молекулярно - биологические функции, принимая непосредственное участие в регуляции клеточного метаболизма [13,100, 203, 219].
Полиамины в оптимальных физиологических концентрациях выполняют роль эссенциальных факторов роста, активируя ряд ферментов синтеза нуклеиновых кислот и белков, тем самым, вероятно, определяя нормальное течение процесса обновления этих полимерных молекул [5, 8, 15, 34, 55, 57, 61, 93,98,108,113,187,233].
В настоящее время не известен ни один вид роста, которому не предшествовали бы стимуляция биосинтеза полиаминов и накопление их в клетках. Полиамины необходимы для роста всех клеток, а для многих клеток эта необходимость является абсолютной (например, для микроорганизмов S.cerevisiae,N.crassa, A.nidulans и другие) [8, 81, 101, 150,170, 199].
Роль полиаминов как стимуляторов роста особенно ярко проявляется в процессе эмбриогенеза, регенерации тканей, гипертрофии, а также при воздействии гормонов роста.
Для эмбрионов птиц, амфибий и млекопитающих продемонстрировано резкое увеличение содержания полиаминов перед быстрыми фазами роста. Повышение концентрации отдельных полиаминов и активности ОДК при этом коррелирует с синтезом РНК, ДНК и белка [5, 8, 56, 60, 61, 81, 91, 108, 111,208,209,219].
Содержание полиаминов увеличивается в тканях матки женщин при беременности. В молочных железах во время беременности и лактации также происходит интенсивный синтез и накопление полиаминов [8, 111, 113, 127, 129, 133, 164,189].
Можно также отметить, что действие полиаминов подобно действию некоторых гормонов: в жировых клетках они оказывают инсулиноподобное действие налипиды.
Яркой демонстрацией необходимости полиаминов для роста и развития являются результаты исследований последних лет с использованием специфических ингибиторов биосинтеза полиаминов (ДФМО и другие), которые вызывают истощение полиаминов в клетках и полную остановку роста [8, 56, 70, 82, 87, 88, 99, 113, 121, 151, 152, 232, 233, 237]. Например, а-дифторметилорнитин (ДФМО) необратимо связывается с ферментом ОДК-алкилирует нуклеофильные группы фермента. При введении в организм ДФМО ингибирует активность ОДК, что приводит к падению внутриклеточного содержания полиаминов и ингибированию роста.
Метилглиоксаль-бис (гуанилгидразон) - МГБГ оказывает сильное ингиби-рование S-аденозил-метиониндекарбоксилазы [8, 144].
При добавлении ингибиторов биосинтеза полиаминов в культуру злокачественных клеток или введение их животным с опухолями наблюдается резкое снижение внутриклеточного содержания путресцина и спермидина («истощение» полиаминов), ингибируется на 85-95% синтез ДНК и белка, прекращается рост и деление клеток. При этом такие важные процессы внутриклеточного метаболизма, как гликолиз и окисление глюкозы, не изменяются. Синтез ДНК и белка восстанавливается при добавлении физиологических концентраций полиаминов, что подтверждает специфичность действия ингибиторов синтеза полиаминов на эти процессы [8, 144, 198, 216].
Исследовав влияние ингибиторов (ДФМО и МГБГ) полиаминсинтези-рующих ферментов на скорость роста трансформированных фибробластов мышей линии СзН и на содержание в этих клетках полиаминов обнаружили, что добавление ингибиторов в культуральную среду существенно тормозило скорость роста L-клеток на 4-е сутки: ДФМО и ДФМО совместно с МГБГ соответственно в 4 и 6 раз. При этом изменения в концентрации поликатионов при действии ДФМО опережали 2 сут. сдвиги в количестве клеток в культуре. Таким образом, изменения концентрации поликатионов в L-клетках и скорость роста этих клеток в культуре ткани можно рассматривать как два тесно связанных между собой процесса. Более того, изменения в концентрации полиаминов первичны по отношению к изменениям скорости роста L-клеток, поскольку они опережают их во времени [82]. Установлена связь между содержанием полиаминов и скоростью клеточной пролиферации in vitro и in vivo [81]. Предполагается, что уровень ПА может быть одним из факторов регуляции клеточного роста, пролиферации, тканевой регенерации и малигнизации [56,164,187,188,219]. Поэтому полиамины рассматриваются как внутриклеточные «маркеры роста» и маркеры активности пролиферативных процессов [22, 79, 200]. Причем известно, что спермин преимущественно служит маркером диф-ференцировки, а спермидин маркером пролиферации [203]. В быстро пролиферирующих нормальных эукариотических клетках скор-релировано во времени повышение содержания спермидина и РНК, спермина и ДНК [15, 91,141, 142]. Полиамины воздействуют на вторичную и третичную структуру всех видов полинуклеотидов. Молекулы тРНК могут превращаться из неактивной формы в более компактную - активную при добавлении моновалентных катионов, Mg2+ или полиаминов [219]. Показано, что вторичная и третичная структура РНК стабилизируются спермидином и Mg2+ [183, 219]. В экспериментах in vitro показана способность полиаминов стабилизировать молекулу ДНК и тем самым предотвращать ее денатурацию. Стабилизирующее влияние полиаминов на ДНК, вероятно, происходит прежде всего за счет нейтрализации отрицательных зарядов фосфатных групп [6, 8, 183, 208, 209,219]. Ряд работ посвящен исследованиям взаимодействия полиаминов и ДНК in vivo. В основном они касаются обнаружения полиаминов, ковалентно связанных с ДНК [219]. Полиамины как компоненты белоксинтезирующего аппарата вовлекаются во все звенья биосинтеза белка и проявляют свое воздействие как на уровне трансляции, так и на уровне транскрипции, а также стабилизируют структуру рибосом и полисом, способствуют прикреплению свободных рибосом к мембранам эндоплазматического ретикулума [1,5, 15, 118, 149, 209, 219].
Имеются экспериментальные данные, свидетельствующие, что функций отдельных полиаминов в рибосомах различны: спермидин вызывает реассо-циацию субъединиц рибосом, стабилизирует их структуру, а путресцин, напротив, способствует диссоциации мономеров рибосом на субъединицы [5, 43]. Спермин может влиять на элонгацию, а спермидин предотвращает также ошибки в транскрибировании [5,219].
Одним из примечательных свойств полиаминов является их влияние на мембранные структуры клетки. Была описана преципитация фосфолипидов спермином и другими полиаминами и выдвинуто предположение, что эта реакция может объяснять связывание полиаминов с мембранами. Полиамины вызывают существенную стабилизацию мембранных структур различных микроорганизмов и млекопитающих, препятствуя их лизису и набуханию, механизм которой, по-видимому, объясняется поликатионной природой полиаминов (мембраны обычно отрицательно заряжены), а также защищают митохондриальные мембраны от дестабилизирующего действия экзогенной фосфолипазы [8].
Schuber и соавт. [210], изучая влияние полиаминов на содержащие кислые фосфолипиды мембраны липосом, показали, что спермидин и спермин в физиологических концентрациях индуцируют агрегацию липосом. Кроме того, полиамины уменьшают пороговый уровень дивалентных катионов (в частности ионов Са2+), необходимый для расплавления мембран, а также промоти-руют плавление некоторых типов липосом даже в отсутствие дивалентных катионов. Авторы считают, что полиамины спермидин и спермин являются модуляторами мембранной текучести.
Морфологические, функциональные и физико-химические методы исследования спермы
Измерение показателей стандартной спермограммы проводили по общепринятым методикам [33, 50, 51, 185], используемым как в нашей стране, так и в других странах.
Оценивались физико-химические, морфологические и функциональные показатели оплодотворяющей способности эякулята: его объём, время разжижения, вязкость, рН, концентрация и скорость сперматозоидов, процентное содержание активно подвижных и неподвижных сперматозоидов, процентное содержание патологических форм сперматозоидов, наличие агглю-тинатов и агрегатов, лейкоцитов, мёртвых сперматозоидов, сперматозоидов с цитоплазматической каплей и клеток сперматогенеза. Проводилось так же расширенное цитологическое исследование сперматозоидов: исследовалась патология головки (макро, микро, вытянутая, круглая, гиперхромная, аморфная, 2-х головые и другие), патология шейки (вытянутая и под углом), патология хвоста (2-хвостые, бесхвостые, другая патология хвоста).
После полного завершения процесса разжижения, сперму перемешивали стеклянной палочкой и начинали медленно удалять стеклянную палочку от поверхности эякулята, по максимальной длине тянущейся за стеклянной палочкой нити судили о степени вязкости спермы.
Для измерения рН спермы использовали прибор pH-Meter «Hanna Piccolo Plus» с разрешающей способностью 1-13+0,01 рН и автоматической температурной компенсацией в интервале от 0 до 70С (точность определения температуры интегральным сенсором прибора 0-70±0,1С). Микроскопические исследования спермы проводили на микроскопе «Axioskop» фирмы «Karl Zeiss Jena GmbX» [51, 53, 185, 234]. Для подсчета сперматозоидов использовали счетную камеру Ґоряева. Для определения живых сперматозоидов среди неподвижных использовали витальную окраску препарата по Bloom: 5% водным раствором эозина и 10% водным раствором нигрозина (живые сперматозоиды не окрашиваются) [51,52]. Скорость сперматозоидов определяли, засекая с помощью секундомера время прохождения сперматозоидом большого квадрата счетной камеры Го-ряева. Делали 10 замеров - по 2 замера для 5 разных сперматозоидов, затем вычисляли среднюю скорость.
Извлечение вещества одним растворителем из другого называется экстракцией. Экстракция основана на распределении растворённого вещества между двумя несмешивающимися фазами [2],
Определяемое вещество извлекают из анализируемого раствора с помощью того или иного экстрагента и получают экстракт, который используют для дальнейшего анализа.
Метод применяют при определении компонента сложной смеси, когда другие присутствующие в смеси вещества мешают проведению анализа. Подбирают такой экстрагент, содержащий или не содержащий экстракционный реагент, который селективно извлекает из анализируемого раствора только определяемый компонент. Так же метод применяется при определении веществ, содержащихся в анализируемом растворе в малых концентрациях, недостаточных для их определения. В таких случаях проводят концентрирование, экстрагируя определяемое вещество из сравнительно большого объёма исходного анализируемого раствора в малый объём экстрагента. При этом концентрация определяемого вещества в экстракте повышается.
При использовании экстракционного метода необходимо, чтобы степень извлечения определяемого вещества из исходного анализируемого раствора экстрагентом была бы количественной, т.е. чтобы в экстракт переходило не менее 99,9 % определяемого вещества. Это достигается путём выбора подходящих органических экстрагентов, экстракционных реагентов, создания оптимального значения рН в исходном анализируемом растворе [89].
В своей работе экстракцию полиаминов для последующего электрофо-ретического фракционирования мы проводили при рН 9,5-10,0 н-бутанолом (равным объёмом по отношению к исходному количеству анализируемого раствора) в течение 1 ч. при постоянном встряхивании [14, 15, 17, 23, 44, 91, 140].
Адсорбционная хроматография - старейший хроматографический метод, берёт свое начало от классических исследований М.С.Цвета. В настоящее время широко используется в препаративных и аналитических вариантах в биохимии и химии природных соединений [2, 31, 71].
В основе разделения полиаминов методом адсорбционной хроматографии лежит тот факт, что определяемые вещества разделяются за счёт селективной адсорбции на неподвижной фазе (НФ).
В работе мы применяли тонкослойную хроматографию дансильных производных полиаминов [13, 39, 80, 88, 92, 211], где стационарная фаза находилась в виде тонкого слоя адсорбента силикагеля. Полиамины экстрагировали равным объёмом 0,2М НСЮ . Пробы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин. К 0,1 мл надосадочной жидкости добавляли 0,3 мл раствора дансилхлорида в ацетоне (4 мг/мл) и 6 мг Na2C03 10Н2О. Пробы инкубировали 18 - 20 ч, в темноте при комнатной температуре. Продукты реакции экстрагировали 0,5 мл бензола. Органический слой переносили в коническую центрифужную пробирку и оставляли выпариваться в течение ночи при комнатной температуре в темноте. Осадок растворяли в 20 мкл бензола и наносили на пластинки Силуфол UV-254 (фирма «Kavalier»). Одномерную тонкослойную хроматографию проводили двукратно в системе бензол - три-этиламин в соотношении 5:1 в течение 45 мин.
Способ количественного определения полиаминов в спермоплазме
Применённые нами в работе для определения полиаминов в спермоплазме хроматографические методы, несмотря на высокую воспроизводимость результатов, высокое разрешение и чувствительность обладали существенными недостатками: были сложны и трудоёмки, требовали использования специального дорогостоящего оборудования, приборов (хроматографов, флюоресцентных денситометров и др.) и дорогих особо химически чистых реактивов, предварительное дансилирование полиаминов усложняло процедуру определения и увеличивало время проведения анализа, хранение образцов хромато-грамм было ограничено по времени, что исключало возможность сравнивать образцы между собой и количественно оценивать, так как изменялась интенсивность флюоресценции с течением времени, а это в свою очередь отражалось на воспроизводимости метода.
Использованный нами для определения полиаминов спермоплазмы метод бумажного электрофореза, в отличие от хроматографических методов, был доступен и прост в применении, не требовал использования специального дорогостоящего оборудования и реактивов, позволял определять непосредственно полиамины, а не их производные, однако так же не был лишён недостатков: требовал относительно длительного проведения анализа, имел низкое качество результатов разделения фракций, так как поддерживающей средой для электрофореза являлась бумага, метод не являлся достаточно точным и имел низкую чувствительность, так как при элюировании окрашенных фракций с бумаги создавался высокий фоновый уровень оптической плотности проб.
Таким образом, перечисленные недостатки позволили нам отказаться от определения полиаминов в спермоплазме вышеуказанными методами.
Поэтому содержание полиаминов (спермин, спермидин) в спермоплазме мы определяли по разработанному нами простому, доступному и достаточно чувствительному способу (Патент на изобретение № 2002105459/15 (005605) приоритет от 28.02.02 г.). Взяв за основу (в качестве базового) метод элек-трофоретического фракционирования полиаминов на бумаге [14, 15, 17 - 20, 23, 43, 44, 54, 91], предлагаем электрофоретическое разделение полиаминов проводить в 1,5 % агаровом геле в 0,1 М лимоннокислом буфере с рН=3,4 при напряжении 200 В и силе тока 40 мА в течение 1 часа, а количественное определение индивидуальных фракций полиаминов предлагаем проводить после прямого сканирования электрофореграмм на сканере путем конвертации полученного материала в цифровой формат на ПЭВМ (положительное решение по заявке на изобретение № 2002132956 (034842) приоритет от 6.12.02. г.) с последующей математической обработкой данных, используя разработанную нами специализированную программу «ПН 5108» (свидетельство № 2003612170 от 17.09.03 г.).
Преимуществом данного способа определения полиаминов является высокая воспроизводимость, чувствительность и точность, сокращение времени проведения анализа, при одновременной простоте и доступности для широкого практического использования благодаря относительно низкой себестоимости и применению не дефицитных реактивов и аппаратуры. Предел обнаружения для полиаминов спермоплазмы составляет 0,013 мг/мл.
Особенность электрофоретического разделения полиаминов заключается в необходимости проведения электрофореза в кислой среде (рН=3,4), так как в этих условиях полиамины заряжаются «положительно» и движутся к катоду. Известно [31], что гелеобразование в растворах агара наступает только в нейтральной или щелочной среде (рН=7 - 9). Это обстоятельство, видимо, удерживало большинство исследователей от использования агарового геля. Нам удалось избежать этого противоречия.
Электрофоретическое разделение полиаминов проводят в 1,5 % агаровом геле, потому что при такой концентрации геля происходит более значитель ная задержка низкомолекулярных полиаминов и наблюдается более четкое разделение фракций вследствие повышения плотности и упругости геля. Более низкая и более высокая концентрация агарового геля (больше или меньше 1,5 %) приводит к ухудшению результатов разделения полиаминов и увеличению времени проведения электрофореза. Электрофоретическое разделение полиаминов проводят при напряжении 200 В и силе тока 40 мА, т, к. это стандартные условия для проведения электрофореза в геле. Увеличение напряжения и силы тока может привести к чрезмерному нагреванию, значительному увеличению испарения и в конечном итоге - высыханию агара. Более низкое же напряжение и сила тока уменьшают скорость электрофореза и происходит увеличение диффузионных процессов, что приводит к снижению точности и чувствительности способа. Время проведения электрофореза (1час) является в этих условиях достаточным, т. к. при меньшем времени происходит не полное и не четкое разделение фракций полиаминов. Применение 1,5 % агарового геля с толщиной слоя 1 мм , напряжения 200 В и силы тока 40 мА дает лучшее разрешение при меньшей продолжительности эксперимента. При дальнейшей обработке быстрее также происходят окрашивание и последующее высушивание агаровых пластинок. В достигаемом при этом хорошем разделении компонентов играет роль снижение диффузионных процессов, поскольку имеет место хорошее соотношение между массой то-копроводящей среды и поверхностью, через которую отводится тепло. Именно это и позволяет достичь при проведении электрофореза в агаровом геле четких результатов разделения фракций полиаминов. Реактивы 1. Соляная кислота (концентрированная, 6 н, 0,1 н растворы). 2. Едкий натр (2 н раствор). 3. Лимоннокислый буфер(0,1 М; рН 3,4-3,6). 4. н-Бутиловый спирт 5. Агаровый гель (1,5 % водный, т. е. гель готовят на дистиллированной воде). 6. Нингидриновый краситель: 100 мг ацетата кадмия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, добавляют 100 мл ацетона, 1 г нингидрина, 5 мл концентрированной уксусной кислоты, встряхивают до полного растворения нингидрина. 7. Растворы стандартов аминокислот (лизин, аргинин) и стандартов полиаминов (сперминтетрагидрохлорид, спермидинтригидрохлорид ) («Fluka», Швейцария)) 4 мг/мл в 0,1 н HCI. Ход определения
Для исследования образец эякулята (свежего или после размораживания) центрифугировали 15 мин при 12000 об/мин, чтобы осадить сперматозоиды. Подкислённую 2 каплями 6 н НС1 надосадочную жидкость нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин для осаждения белков и центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Надосадочную жидкость подщелачивали 2 н NaOH до рН 10,0. Далее экстрагировали полиамины равным объемом н-бутанола в течение 1 часа при постоянном встряхивании, после чего центрифугировали 15 мин при 12000 об/мин. Бутанольную фазу отбирали с помощью шприца, переносили в фарфоровую чашку, добавляли 3 капли 6 н НС1 и содержимое выпаривали в сушильном шкафу при 80-100 С до сухого остатка. Сухой остаток растворяли в 0,2 мл 0,1 н НС1. Стеклянные пластинки (9x12 см) залитые 1,5 % агаровым гелем с толщиной слоя 1 мм предварительно обрабатывали 0,1 М лимоннокислым буферным раствором с рН 3,4 - 3,6.
![Физиологическое обоснование стабилометрии в оценке статического равновесия у детей младшего школьного возраста в норме и при нарушениях двигательной функции [Электронный ресурс]](/i/i/4601/182665.png "Физиологическое обоснование стабилометрии в оценке статического равновесия у детей младшего школьного возраста в норме и при нарушениях двигательной функции [Электронный ресурс] Савельев Михаил Юрьевич")
