Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Модели эпилепсии на животных 10
1.1.1. Модели судорожной активности in vivo. Киндлинг 10
1.1.2. Этиология аудиогенных судорог 11
1.1.3. Аудиогенпая эпилепсия человека 12
1.1.4. Модели приобретенной аудиогенной эпилесии на животных 13
1.1.5. Наследственные аудиогенные судороги грызунов 13
1.1.6. Аудиогенный киндлинг 18
1.1.7. Биохимические изменения мозга при аудиогенной эпилепсии 18
1.2. Нейробиологические основы эпилептогенеза развивающегося мозга 20
1.3. Участие систем вторичных посредников в механизмах эпилептогенеза 22
1.3.1. Са2/калъмодулин-зависимое фосфорилирование белков 23
1.3.2. Внутриклеточные пути реализации сигнала, опосредуемого цАМФ. цАМФ-зависимое фосфорилирование белков 27
1.3.3. Серин/треониновые протеинфосфатазы. Кальцинейрин 32
1.3.4. Участие систем вторичных посредников в регуляции пластичности мозга и эпилептогенезе 35
1.3.5. Взаимосвязь Со2' - и цАМФ-зависимых систем вторичных посредников 38
1.4. Современные стретегии применения антиконвульсантов. Мелатонин и вальпроат натрия 41
Глава II. Материалы и методы исследования ...46
2.1. Материалы 46
2.2. Лабораторные животные 46
2.3. Исследование поведения крыс КМ в тесте «Открытое поле» 47
2.4. Оценка аудиогенной судорожной активности крыс линии КМ. Аудиогенный киндлинг 47
2.5. Аудиогенный киндлинг крыс КМ на фоне хронического употребления мелатонина и вальпроата натрия 48
2.6. Однократное введение мелатонина половозрелым крысам линии КМ и КМ после аудиогенного киндлинга 49
2.7. Однократное введение вальпроата натрия половозрелым крысам линии КМ и КМ после аудиогенного киндлинга 49
2.8. Введение мелатонина крысам линии КМ в течение 7 дней с последующим тестированием на аудиогенные судороги 50
2.9. Введение мелатонина крысятам линии КМ в различные сроки раннего постнатального развития (1-7,7-14 и 14-21 постнатальные дни) 50
2.10. Выделение структур мозга , 51
2.11. Приготовление гомогенатов 51
2.12. Определение концентрации белка 51
2.13. In vitro фосфорилирование белков мозга 51
2.13.1. сАМФ- зависимое фосфорилирование 52
2.13.2. Со2*/капьмодулин-зависимое фосфорилирование 52
2.13.3. Электрофорез и идентификация белков 52
2.14. Измерение активностей протеинкиназ 53
2.14.1. Измерение активности сАМФ-зависимой протеинкиназы 53
2.14.2. Измерение активности Со2*/калъмодулин-зависимой протеинкиназы Я...54
2.14.3. Оценка включения фосфата в пептидные субстраты протеинкиназ 55
2.15. Иммунохимические методы оценки содержания а-СаМКН, кальцинейрина и МАР2 с помощью иммунноблотинга 56
2.16. Электронно-микроскопические исследования 62
2.17. Статистическая обработка результатов исследований 58
Глава III. Результаты исследования и их обсуждение 59
3.1. Исследование систем Са ^/кальмодулин- и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ и крыс Вистар 59
3.2. Исследование Са +/кальмодулин - и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ через 2 суток после однократного звукового воздействия и после АК 64
3.3. Исследование действия мелатонина и вальпроата натрия на активность САМКИ и РКА 72
3.4, Влияние вальпроата натрия и мелатонина на аудиогенную судорожную активность крыс линии КМ и системы фосфорилирования 77
3.4.1. Исследование действия мелатонина (50 и 75 мг/кг) и вальпроата натрия (200 мг/кг) на аудиогенные судороги крыс линии КМ 77
3.4.2. Исследование действия мелатонина (50 и 75 мг/кг) и вальпроата натрия (200 мг/кг) на миоклонические судороги крыс линии КМ после аудиогенпого киндлтга 85
3.4.3 Хроническое введение мелатонина крысам КМ в течение 7 дней с последующим тестированием на аудиогенные судороги.. 88
3.5. Влияние хронического потребления вальпроата натрия и мелатонина крысами КМ на аудиогенную судорожную активность во время аудиогенного киндлинга 90
3.6. Исследование отставленного действия раннего постнатального введения мелатонина на аудиогенные судороги половозрелых крыс линии КМ 92
3.6.1. Введение мелатонина в возрасте с 1-го по 7-й Р дни 92
3.6.2. Введение мелатонина в возрасте с 14-го по 21-й Р дни , 98
3.6.3. Введение мелатонина в возрасте с 7-го по 14-й Р дни 103
Заключение 113
Выводы 116
Список литературы 117
- Наследственные аудиогенные судороги грызунов
- Участие систем вторичных посредников в регуляции пластичности мозга и эпилептогенезе
- Иммунохимические методы оценки содержания а-СаМКН, кальцинейрина и МАР2 с помощью иммунноблотинга
- Исследование систем Са ^/кальмодулин- и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ и крыс Вистар
Введение к работе
Актуальность проблемы:
Эпилепсия представляет собой большую группу клинических заболеваний, которым подвержено около 1% взрослого населения, при этом только 40% случаев заболевания эпилепсией поддается медикаментозному лечению, в то время как нейрохирургическое вмешательство (резекция ткани мозга у больных или нейротрансплантации) не всегда дает положительный эффект (Карлов, 1990). В настоящее время считается, что наследственные формы эпилепсии являются заболеванием мозга в целом (Богданов, 1997; Акимова и др., 2000). С этой точки зрения правомерен вопрос о том, в какой степени изменения функциональных или морфологических свойств индивидуальных нейронов, а также нейронов определенных структур головного мозга могут быть ответственны за эпилептогенез. Широкое разнообразие клинических форм эпилепсии свидетельствует о необходимости анализа клеточных и молекулярных механизмов инициации и развития заболевания.
На различных моделях эпилепсии на животных показано, что эпилептогенез сопровождаться многочисленными метаболическими нарушениями в нейронах, включающими в себя изменения экспрессии генов, внутриклеточного гомеостаза Са2+ и энергетики нейронов, изменением кластеризации и свойств различных рецепторных комплексов, в частности, ГАМК- и глутаматных, изменением проводимости ионных каналов, а так же морфологическими перестройками, приводящими к созданию гипервозбудимости нейрональных сетей. Нарушение функционирования нейронов в значительной степени определяется изменениями внутриклеточной системы регуляции различных клеточных процессов - системы вторичных посредников. Конечными эффекторами системы вторичных посредников являются протеинкиназы (протеинфосфотрансферазы) — ферменты, осуществляющие регуляцию большинства рецепторных и канальных белков, а так же белков цитоскелета посредством одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций - фосфорилированием. Са2+/кальмодулин- (СаМКП) и цАМФ- (РКА) зависимые протеинкиназы, а также Са2+/кальмодулин-активируемая протеинфосфатаза 2В (кальцинейрин), локализованные как пре-, так и постеинаптически, являются ключевыми ферментами взаимомоду пирующих путей реализации действия двух важных внутриклеточных вторичных посредников — Са и цАМФ. Начиная с открытия Э.Сазерлендом регуляторного действия цАМФ (Sutherland, 1972), последующие исследования функционирования белков-эффекторов систем цАМФ- и Са2+/зависимого проведения сигнала показали, что различные пути вторичных посредников взаимомодулируют друг друга, образуя разветвленную регуляторную сеть, специфичность ответа которой определяется рецепторньши комплексами, запускающими внутриклеточные каскады фосфорилирования/дефосфорилирования, набором и компартментализацией белков-эффекторов. Большой интерес представляет изучение фосфорилирования ассоциированного с микротрубочками белка 2 (МАР2), который является одним из связующих звеньев между данными регуляторными внутриклеточными системами, а также морфологией и функциональной активностью нейрона. Фосфорилирование этого белка СаМКИ и РКА регулирует динамику сборки/разборки тубул и нового цитоскелета и взаимодействие микротрубочек с другими элементами цитоскелета, что, в свою очередь оказывает влияние на внутриклеточный транспорт, кластеризацию рецепторов, синаптическую передачу и поддержание формы дендритов. Изменения фосфорилирования белков, а также активности или содержания СаМКИ, РКА и кальцинейрина показаны при долговременной потенциации синаптической передачи, процессах, связанных с обучением и некоторыми патологическими состояниями мозга. Кратковременное увеличение уровня внутриклеточного Са и цАМФ вследствие судорожной активности запускает каскад как морфологических (изменением состояния цитоскелета посредством изменения фосфорилирования цитоскелетных белков), так и биохимических изменений, приводящих к долговременной активации генома и образованию так называемых "эндогенных антиконвульсаитов" - адаптационных перестроек, препятствующих развитию гипервозбудимости и являющихся мишенями действия некоторых антиконвульсаитов (Post, 2004). Известно, что такие антиконвульсанты, как вальпроат натрия и мелатонин являются "универсальными" антисудорожными агентами при различных формах эпилепсии. Антиэпилептическое действие данных препаратов в основном объясняется их влиянием на ГАМК-ергическую систему мозга, однако представляется вероятным, что их эффективность может опосредоваться влиянием на систему внутриклеточной регуляции, опосредованную Са2+ и цАМФ. Комплексный анализ изменений в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональньгх белков в мозге животных с наследственной предрасположенностью к судорогам, вызываемым звуком, несомненно, позволит выявить механизмы, ответственные за генерацию и поддержание судорожной активности и дать заключение о взаимосвязи между антисудорожным действием мелатонина и вальпроата натрия и изменениями в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков, что позволит обогатить существующие на сегодняшний день знания о механизмах действия антиконвульсаитов широкого спектра действия и, возможно, дать дополнительное направление для разработки новых актиконвульсантов.
Цель и задачи исследования.
Целью диссертационной работы является изучение участия систем цАМФ- и Са /кальмодулин-зависимого фосфорилирования нсйрональных белков в механизмах развития и поддержания судорожной активности, а также в реализации действия антиконвульсантов широкого спектра действия мелатонина и вальпроата натрия.
Конкретные задачи исследования:
1. Выявление особенностей функционирования систем цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования белков в мозге крыс линии Крушинского-Молодкиной (КМ), обладающих наследственной предрасположенностью к аудиогенным судорогам по сравнению с нечувствительными к звуковому воздействию крысами Вистар;
Сравнительный анализ изменений систем фосфорилирования нейрональных белков в мозге крыс линии КМ после однократных аудиогенных судорог и после хронического звукового воздействия (аудиогенного киндлинга);
Исследование влияния мелатонина и вальпроата натрия на активности протеинкиназ СаМКИ и РКА in vitro;
Анализ влияния однократного введения мелатонина и вальпроата натрия на исследуемые системы фосфорилирования и аудиогенные судороги крыс линии КМ;
Изучение действия хронического потребления мелатонина и вальпроата натрия крысами КМ на параметры судорог и динамику развития миоклонуса при аудиогенном киндлинге;
Исследование отставленного действия введения мелатонина (50 мг/кг) крысятам КМ в критические для развития мозга периоды постнатального развития (1-7Р, 7-14Р и 14-2 IP дни) на реализацию чувствительности к звуку в половозрелом возрасте, а также на системы цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков и состояние синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа.
Научная новизна.
В представленной работе впервые показано, что у животных с наследственной предрасположенностью к судорогам в различных структурах мозга, вовлеченных в реализацию судорожной активности, существует генетически детерминированное изменение содержания Са2+/кальмодулин-регулируемых ферментов - протеинкиназы
СаМКН и протеинфосфатазы кальцинейрина, что может являться одним из механизмов, участвующих в формировании нейрональной гипервозбудимости. Показано, что даже однократное судорожное воздействие вызывает долговременные изменения содержания а-субъединицы CaMKII и калышнейрина в отдельных структурах мозга крыс КМ. Выявлено антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия на различные типы аудиогенных припадков, а также потенциирующее действие мелатонина на антисудорожную активность вальпроата натрия при совместном применении антиконвульсантов. Впервые продемонстрировано, что антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия при однократном введении сопровождается изменениями в системах цАМФ- и Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков. Показано, что применение мелатонина на ранних стадиях постнатального развития может оказывать как анти-, так и просудорожное отставленное действие в зависимости от постнатальных сроков введения, сопровождающееся изменениями исследуемых систем фосфорилирования и морфологическими модификациями синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа, что предполагает более осторожный выбор антисудорожной терапии при лечении ювенильных эпилептических синдромов.
Научно-практическое значение.
Результаты, полученные в данной работе указывают на вовлечение систем фосфорилирования/дефосфорилирования нейрональных белков и белков цитоскелета в механизмы предрасположенности и реализации судорожных состояний и намечают подходы к разработке нового класса антиэпилептических препаратов, мишенью которых является система вторичных посредников.
Наследственные аудиогенные судороги грызунов
Аудиогенные судороги грызунов - наследственная патология, однако они могут быть вызваны и у не чувствительных к звуку животных. У молодых крыс или мышей, чувствительность к АС может развиваться вследствие повреждения чувствительных сенсорных внешних и внутренних волосковьгх клеток улитки вследствие экспозиции звуком в течение определенного периода постнатального развития. Эта процедура, обозначаемая как "прайминг", индуцирует восприимчивость к АС, как впервые было показано К. Генри и Р. Боумэном (Henry and Bowman, 1970). После определенного периода времени, праймированные животные, тестируемые на восприимчивость к звуку, проявляли АС. Оптимальный день праймирования зависит от линии грызунов от 13 постнатального дня у крыс Spraque-Dawley до 21-го дня у мышей линий SJL и BALB/c (см. ссылки Ross and Coleman, 2000). Для генетически предрасположенных к АС животных процедура праймирования не нужна, АС у них вызываются интенсивной звуковой стимуляцией уже на 16 день после рождения для крыс или на 6-7 день для мышей DBA/2J (Jobe, 1981; Seyfried, 1982). Чувствительность к АС может также вызываться созданием неонатально искусственного дефицита тироидного гормона или применением канамицина, обладающего ототоксичным действием (Yasuda et al., 2000; Faingold, 2002). У взрослых животных АС могут индуцироваться созданием дефицита ионов Mg2 или введением агониста NMDA-подтипа глутаматных рецепторов метафита (Stanojlovic and Zivanovic, 2004), а также вследствие синдрома отмены этанола после длительного его введения (Atkins et al., 2000) или отмены веществ, обладающих депрессивным действием, таких как барбитураты и бензодиазепины (Faingold and Randall, 1999; Nath and Gupta, 2001). Локальные микроинъекции в нижние бугры четверохолмия ингибиторов ГАМК-рецепторов или веществ, усиливающих глутаматергические процессы также способны вызвать кратковременную чувствительность к АС, но введение этих же веществ в другие структуры ствола чувствительность к АС не вызывает (Shan et al., 1997; Bagrietal., 1999).
Наследственные аудиогенные судороги грызунов. В настоящее время в лабораторных условиях широко используются животные, имеющие наследственную предрасположенность к судорогам. Наиболее известные крысы линии Крушинского-Молодкиной (КМ), используемые в работах российских и финских исследователей (Valjakka et al., 2000; Yechikhov et al., 2001), GEPR (genetically epilepsy-prone rat), WAR (Wistar audiogenic rat), проявляющие аудиогенные генерализованные судороги (Веретенников и др., 1996; Батуев и др., 1997; Богданов, 1997), крысы линии WAG/Rij (аудиогенные судороги и абсансы), мыши линии DBA/2J (Jobe, 1981; Seyfried, 1982) и др. Животные, подвергнутые звуковому воздействию, проявляют генерализованную клоническую или тонико-клоническую судорожную активность (ранее известную как "grand mal seizures") (Ross and Coleman, 2000). К сожалению, вопрос о биологической роли чувствительности к звуку, точнее о его эволюционном генезе, не только не исследован, но практически никогда не поднимался. В середине 40-х годов Л.В. Крушинский и Л.Н. Молодкина в МГУ путем селекции вывели линию белых лабораторных крыс, которые в ответ на звук интенсивности 80-100 дБ реагировали сначала мощным двигательным возбуждением, а затем клонико-тоническими и тоническими судорогами. Изучение характера наследования повышенной чувствительности к звуку у крыс КМ методом диаллельного скрещивания показало, что данный признак имеет полигенную природу, действие генов аддитивно и гены, детерминирующие нечувствительность к звуку, доминируют. Степень проявления АС в ответ на звуковую стимуляцию специфична для разных инбредных линий грызунов и может быть разделена на несколько универсальных фаз, характерных для всех линий животных, склонных к АС: 1. фаза "манежного бега", или двигательного возбуждения - животные совершают неконтролируемые движения в тест-камере после начала звуковой стимуляции. Эта фаза сама по себе может содержать 1 или 2 фазы возбуждения: унифазический бег (описан в литературе как "ложный старт") или бифазический бег; 2. клонические судороги - характеризуются изгибанием спины, шеи, передних и задних конечностей в сочетании с мышечными спазмами всего тела. Если клонус сопровождается кратковременной ригидностью тела животного, то этот вид судорог будет классифицироваться как тонико-клонические. Являются максимальным уровнем проявления АС для некоторых линий крыс, включая Wistar, GEPR-3, Sprague-Dawley и Long-Evans; 3. тонические судороги - могут наблюдаться вслед за фазой бега или клонусом, характеризуются ригидным вытягиванием всего тела животного в противоположность быстрому тонусу тонико-клонических судорог. АС, достигшие этой фазы, могут приводить к смерти животного, что является наиболее общей чертой у различных линий мышей. Тонические судороги показаны у крыс линий GEPR-9, WAR и КМ, а также мышей линии DBA/2J. После развития клонических, тонических или тонико-клонических судорог для различных линий грызунов также показано существование типичного пост-судорожного периода, характеризующегося неподвижностью, временной нечувствительностью к действию звука и вокализацией. У крыс КМ этот период обычно длиться несколько минут. Для животных с наследственной предрасположенностью к аудиогенным судорогам также свойственно снижение общей исследовательской активности. Так, при помещении в тестовую камеру АС-животные практически не двигаются до начала звукового воздействия, в то время как нормальные животные совершают спонтанные движения по камере перед и в течение звуковой стимуляции {Ross and Coleman, 2000). Известно, что в инициации и распространении АС главную роль играет изменение функционального состояния некоторых структур мозга, входящих в состав слухового анализатора. Критической структурой для инициации АС считается центральное ядро нижних бугров четверохолмия среднего мозга (Faingold et al., 1994; Faingold, 2002). Хотя это ядро не обладает достаточным количеством прямых моторных выходов, оно посылает большинство проекций в периферическое ядро нижних бугров, которое является основным местом конвергенции звуковых входов в сенсомоторную кору. Хроническая звуковая стимуляция приводит к увеличению периода нейрональных разрядов в центральном ядре нижних бугров и распространению судорожной активности в структуры л имби ческой системы (Веретенников и др., 1996; N Gouemo and Faingold, 1997). Однако установлено, что в распространении и поддержании АС также могут участвовать некоторые субкортикальные структуры и структуры переднего мозга (Millan et al., 1988; Garcia-Cairasco and Sabbatini, 1991) (Рис. 1.1). В этом плане особый интерес представляют исследования, показавшие, что после повторяющейся звуковой стимуляции наблюдается распространение Fos-иммунореактивности от слуховых структур ствола мозга к миндалине и периферийной коре, затем на фронто-париетальную кору и заканчивающуюся в гиппокампе и энторинальной коре (Clough et al., 1997; Simler et al., 1999). Некоторые авторы предполагают, что кора головного мозга вовлечена в формирование и распространение судорожной активности, но этого, вероятно, недостаточно для инициации припадка (Крушинекий, 1960). Так, существуют данные, что функциональное выключение коры головного мозга приводило к снижению уровня судорожной готовности у крыс линии КМ, однако у большинства животных не предотвращало возникновение судорог (Батуев и др., 1997; Valjakka et al„ 2000).
Роль гиппокампа в прогрессии аудиогенных судорог до сих пор не ясна, однако в опытах на крысах линии GEPR установлено, что судорожному припадку предшествуют синхронизированные интериктальные вспышки активности нейронов САЗ области гиппокампа (Веретенников и др., 1996).
Участие систем вторичных посредников в регуляции пластичности мозга и эпилептогенезе
Считается, что РКА - протеинкиназа "более быстрого реагирования", чем СаМКП. Показано, что для пластических перестроек, необходимых для долговременного облегчения, требуется постоянно повышенный уровень нейрональной цАМФ (Chain et al., 1999), что приводит к повышению уровня диссоциированных активных С-субъединиц и увеличению активности РКА. В этом случае предложен следующий механизм реализации сигнала цАМФ: активная РКА транслоцируется в ядро и фосфорилирует CREB, в результате чего происходит усиление биосинтеза убиквинтин-карбоксилазы, снижающей уровень RJa, что и приводит к пролонгированию сигнала цАМФ через увеличение диссоциации РКА (ссылки см. Chain et al., 1999). Общее ингибирование активности РКА удалением R(A-B)paHcreHHbix сайтов связывания цАМФ приводит к нарушению формирования долговременной памяти у мышей (Brandon et at,, 1997). Вероятно, РКА также участвует в таких формах нейрональной пластичности, как выработка адаптации к фармакологическим агентам и сенситизация к ноцицепции (Brandon et al., 1997). Существуют работы, в которых показана быстрая кратковременная активация РКА в течение развития гиппокампальной LTP (Roberson and Sweatt, 1996). У мышей, нокаутных по Rip-субъединице, не наблюдалось развитие LTD в поле СА1 гиппокампа в ответ на низкочастотную стимуляцию коллатералей Шаффера или стимуляцию перфорантного пути, мыши, имевшие дефицит Срі-субъединицы, обнаруживали такой же дефект развития LTD, обе эти линии мышей также показывали затруднение развития LTP в поле САЗ гиппокампа и зрительной коре, хотя нарушений реакции научения они не обнаруживали (Qi et а]., 1996; Brandon et al., 1997). В настоящее время превалирующим является мнение, что при повышении внутриклеточного Са +, в первую, очередь происходит активация Са2+/СаМ-зависимых протеинкиназ, в том числе СаМКП. Установлено, что развитие LTP в поле СА1 гиппокампа крыс значительно облегчается в присутствии повышенной концентрации Са2+/СаМ, что сопровождается увеличение токов через каналы АМРА-рецепторов и увеличением активности СаМКП (Ahmed et al., 2000; Andrasfalvy and Ma gee, 2004). Через 12 ч после индукции фенилкетонурии фенилаланином в культуре нейронов из неокортекса крыс показано значительное увеличение экспрессии для СаМКП, сопровождающееся гибелью нейронов (Zhang and Gu, 2004). Важность автофосфорилирования и активации СаМКП хорошо иллюстрируется данными о том, что у мышей, нокаутных по Thr286 в молекуле СаМКП, обнаружен дефицит кратковременной памяти и гиппокампальная LTP у них не развивается (Giesse et al., 1998). С помощью иммунно-электрошюй микроскопии показано, что развитие LTP в нейронах поля СА1 срезов гиппокампа крыс вызывает транслокацию в ядро не только CAMKI, но и цитоплазматической СаМКП (Ahmed et al., 2000), что свидетельствует о возможности прямого действия САМКИ на экспрессию белков.
Уникальная регуляция СаМКП сделали ее предметом пристального внимания при изучении молекулярно-клеточных механизмов эпилепсии. Введение каиновой кислоты в желудочки мозга мышей вызывало значительное увеличение как содержания СаМКП, так и ее автофосфорилированной формы в поле САЗ гиппокампа, при этом предварительная обработка циклогексимидом устраняла увеличение уровня протеинкиназы, но не увеличение автофосфорилирования, напротив, предобработка антагонистами глутаматных рецепторов МК-801 и CNQX блокировало увеличение ее автофосфорилирования, но не увеличение ее экспрессии (Lee et al., 2003). Это еще раз подтверждает, что регуляция активности и содержания СаМКП в нейронах тесно связана с функционированием NMDA- и АМРА-подтипов глутаматных рецепторов. Увеличение активности СаМКП также коррелировало во времени с появлением спонтанной судорожной активности, вызванной введением каината в миндалину (Lee et al., 2001). Ядерная форма СаМКП фосфорилирует фактор транскрипции CREB, участвующий в активации генома при судорожных воздействий или ишемии/гипоксии. Так, показано, что введение глутамата в культуру нейронов вызывает фосфорилирование CREB, которое предотвращается устаранением внеклеточного Са2+ и ингибиторами СаМКП (Mabuchi et al., 2001), что доказывает роль СаМКП в активации генома в ответ на стрессовые воздействия. Это также подтверждается данными о том, что введение ингибиторов СаМКП устраняло гибель в культуре нейронов коры, вызванную введением вератридина (активатор потенциал-зависимых Na+ каналов) (Takano et al., 2003). Существуют также данные, свидетельствующие о том, что генетические изменения в СаМКЦ могут являться причиной предрасположенности к судорогам. У линий мышей, склонных к аудиогенным судорогам, наблюдаются значительные изменения в системе СаМКП-зависимого фосфоршшрования ряда нейрональных белков по сравнению с нормальными линиями (DeLorenzo, 1984), а мыши с нуль-мутацией гена а-СаМКП обладают сниженным судорожным порогом (Butler, 1995). Существуют данные о том, что при развитии судорог может меняться содержание МАР2 в нейронах, возможно за счет изменения экспрессии некоторых его изоформ, как высокомолекулярных, так и низко молекулярных. Так, например, показано, что у людей, с наследственной формой эпилепсии в мозге наблюдается повышенная экспрессия низкомолекулярного МАР2С, синтезирующегося в норме только на ранних постнатальных стадиях развития (Sanchez et al., 2000). Методом in situ гибридизации установлено, что снижение экспрессии высокомолекулярных изоформ МАР2 (МАР2А и МАР2В, 270 и 280 кДа соответственно) может служить индикатором нейродегенеративных процессов при ишемии (Schmiat-Kastner et al., 1998), а также при алкогольной интоксикации (Putzke et al, 1998). Кроме того, при болезни Альцгеймера в некоторых структурах мозга наблюдаются изменения структуры дендритов, а также аномальные скопления МАР2А и МАР2В в аксонах (в норме эти изоформы МАР2 в аксонах отсутствуют), где он находится в агрегированном состоянии с гиперфосфорилированным tau-белком, причем выраженность этих нарушений, по-видимому, коррелирует со степенью слабоумия (Alonso et al., 1997, Anderton et al., 1998). Кроме того, после индукции судорог инъекцией каиновой кислоты в миндалину в нейронах гиппокампа параллельно с увеличением аксонального спроутинга также было обнаружено увеличение экспрессии МАР2 (Pollard et al., 1994). После инициации судорог пентилентетразолом в гиппокампе наблюдалось быстрое и кратковременное дефосфорилирование МАР2 кальци нейрином, которое является следствием гиперактивации NMDA-рецепторов, опосредованной входом ионов Са2+ (Diez-Guerra and Avila, 1993), Наим также ранее было показано, что у мышей линии DBA/2J, обладающих наследственной прерасположенностью к аудиогенным судорогам., в неокортексе и гиппокампе выявлены измнения содержания белка МАР2 по сражению с устойчивыми к действию звука мышами линии C57/BIack (Чуланова и др., 2001).
Иммунохимические методы оценки содержания а-СаМКН, кальцинейрина и МАР2 с помощью иммунноблотинга
Хотя данные литературы по исследованию эпнлептиформной активности на различных моделях эпилептогенеза достаточно многочисленны, однако они не дают в настоящее время полный ответ на вопрос о первоначальной причине возникновения патологического состояния. Полученные нами результаты о различных компонентах систем Са2+7кальмодулин- и цАМФ-зависимых систем фосфорилирования белков (протеинкиназа-МАР2-протеинфосфатаза) свидетельствуют о значительных генетических модификациях в различных структурах мозга крыс линии КМ, предрасположенных к наследственным аудиогенным судорогам по сравнению с крысами Вистар.
Сравнительный анализ особенностей функционирования систем Са /кальмодулин и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков показал значительные модификации их различных компонентов в неокортексе (Нк), гиппокампе (Гк) и нижних буграх четверохолмия (н.б.ч.) крыс линии КМ по сравнению с Вистар. Так, активность РКА в неокортексе и гиппокампе крыс КМ не отличалась от Вистар, но была повышена в нижних буграх четверохолмия (11,10±0,79 и 8,32±0,76 пкмоль 32Р/минмкг белка соответственно, р 0,01) (Табл.1), что может свидетельствовать об увеличении содержания РКА в этой структуре мозга крыс КМ, являющейся критической структурой для инициации судорожного аудиогенного припадка (Ross and Coleman, 2000; Faingold, 2002). В настоящее время доказано участие РКА как в пре-, так и в постсинаптических механизмах долговременной потенциации и депрессии (Kameyama et al., 1998; Huang and Kandel, 1998), однако роль РКА в механизмах эпилептогенеза остается не ясной. Известно, что судороги уже через 50 мс могут вызвать кратковременное повышение уровня цАМФ в нейронах, вызывая активацию протеинкиназ этого типа (Folbergrova, 1977; Onozuka et al., 1989).
Общая активность СаМКП (служит показателем уровня фермента) в исследуемых структурах мозга КМ и Вистар не различалась, однако функциональная активность протеинкиназы в неокортексе и н.б.ч. крыс линии КМ была достоверно выше, чем в соответствующих структурах мозга крыс Вистар.
Как упоминалось в п. 1.3.1, в зависимости от частоты и амплитуды Са2+ сигнала, СаМКП активируется комплексом Са /кальмодулин, который, связываясь с протеинкиназой, устраняет действие автоингибиторного домена фермента, вызывает автофосфорилирование протеинкиназы по Thr (для а/р-субъединиц) и переводит фермент в Са +/кальмодулин-независимую активную форму (Bayer and Shulman, 2001; Hudmori and Shulman, 2002). Автофосфорилирование СаМКП также увеличивает ее сродство к кальмодулину более чем в 1000 раз (Meyer et at., 1992), По данным литературы, увеличение доли функционально активной протеинкиназы от общего пула фермента характерно для структур мозга, предрасположенных к эпилептогенезу (Churn et al., 1991; Blair et al., 1999). Таким образом, повышенная функциональная активность СаМКП в неокортексе и н.б.ч. крыс линии КМ может свидетельствовать, о высокой степени предрасположенности к развитию нейрональной гипервозбудимости в этих структурах мозга. Так как общая активность СаМКП в исследуемых структурах мозга КМ не отличалась от таковой у Вистар, можно предположить, что общее содержание СаМКП в мозге крыс экспериментальных групп не различается. Однако, иммунохимический анализ показал, что в неокортексе, но не в гипппокампе, крыс линии КМ содержание субъединиц а-СаМКП достоверно ниже, чем у Вистар (в н.б.ч. анализ содержания белков не проводился) (Рис.3.1). В совокупности с данными о повышении функциональной активности фермента, можно заключить, что в неокортексе крыс КМ по сравнению с Вистар повышено содержание активной автофосфорилированной формы протеин киназы или существует генетически измененное соотношение нейроспецифических а- и fl-субъединиц CaMKII в сторону преобладания последних, отличающихся по кинетике активации и взаимодействию с некоторыми белками цитоскєлета и постсинатических уплотнений (F-актином, PSD-95), что и находит отражение в повышении функциональной активности протеинкиназы (Bayer and Schulman, 2001). Известно, что содержание а-изоформы CaMKII в переднем мозге составляет около 19-37 мкМ (Hudmon and Schulman, 2002). В настоящее время выявлены небольшие различия в чувствительности к Са +/СаМ между а- и [і-изоформами, а также некоторые различия среди (і-СаМКІІ сплайсинговых вариант, что приводит к различному декодированию частот Са2 -осцилляции (Bayer and Schulman, 2001). Установлено, что в различных структурах мозга состав холоэнзимов различен: если в лобных долях коры соотношение а/р-субъединиц составляет 3:1, то в мозжечке их соотношение 1:4 (Hudmon and Shulman, 2002). При экспериментальной эпилепсии также описано увеличение экспрессии р—СаМКП в гиппокампе (Morimoto et al., 1997).
Известно, что соматодендритный фосфопротеин МАР2 является in vivo субстратом как РКА, так и CaMKII (Fukunaga et al., 1993; Sanchez et al., 2000). Наибольшая экспрессия высокомолекулярной изоформы МАР2А (270 кДа) выявлена во взрослом мозге, в то время как МАР2В (280 кДа) обнаруживается на всех стадиях развития нервной системы,. МАР2С найден преимущественно на ранних стадиях развития, однако он также обнаружен в обонятельных луковицах и ретине у взрослых крыс, которые сохраняют способность к аксональному росту во взрослом состоянии. МАР2, выделенный из мозга крыс, способен к включению до 46 моль РО (/моль белка, однако более высокий уровень фосфорилирования МАР2 приводит к снижению его способности связываться с микротрубочками (Sanchez et al., 2000).
Исследование систем Са ^/кальмодулин- и цАМФ-зависимого фосфорилирования белков в различных структурах мозга крыс линии КМ и крыс Вистар
На следующем этапе выполнения работы было проведено исследование акти судорожного действия мелатонина и вальпроата натрия на аудиогенную судорожную активность крыс линии КМ. Взрослым крысам линии КМ внутрибрюшинно вводили мелатонин (дозы 50 и 75 мг/кг) и вальпроат натрия (200 мг/кг). Контрольным группам вводился соответственно физраствор с 10% этанолом (контроль на введение мелатонина) или физраствор (контроль на вальпроат натрия). Наши предварительные эксперименты показали, что через 1 ч после введения мелатонина его антисудорожное действие практически отсутствует. Известно, что мелатонин имеет очень высокую скорость метаболизма, время его циркуляции в крови после выброса составляет всего 10 минут, время полураспада экзогенного мелатонина - около 40 минут (Vanecek, 1998). Из литературных данных известно, что, в отличие от мелатонина, вальпроаты распределяются в мозге и плазме крови примерно одинаково, период их полураспада колеблется в зависимости от вида животных и составляет 0,8 ч для мышей, 2-5 ч для крыс и 9-18 ч для человека (Losher, 1999). Например, после введения вальпроата мышам, концентрация его в мозге составила 0,5 мМ (Johannessen, 2000). Принимая во внимание приведенные выше данные литературы, тестирование на аудиогенные судороги крыс опытных и соответствующих контрольных групп проводили через 30 мин после введения мелатонина или через 1 ч после введения вальпроата натрия. Параллельно было проведено тестирование на аудиогенные судороги крыс КМ интактной группы без введения антиконвульсантов. Показано, что и мелатонин, и вальпроат натрия значительно облегчали аудиогенные припадки крыс КМ, причем антисудорожное действие мелатонина носило дозозависимый характер и было более выражено в случае введения крысам КМ препарата в дозе 75 мг/кг (Рис.3.14.).
Так, через 30 мин после введения мелатонина в дозе 50 мг/кг у крыс КМ опытной группы увеличивалась латентность стадий "1" (5,80±0,97с, р 0,05) и "2" (12,00±1,52, р 0,05) развития припадка по сравнению с 2,6б±0,23с и б,44±0,22с группы интактных КМ. Тяжесть припадков у крыс группы введения мелатонина достоверно снижалась до 3,80±0,20 баллов по сравнению с интактными КМ (4,59±0,09балла, р 0,01) и контрольной группой (4,80±0,20 балла, р 0,01). Латентный период развития стадии "2" в опытной группе также достоверно был выше соответствующего значения в контроле (7,20±1,24с, р 0,05). Ни в одной из исследуемых групп животных 2-х фазный бег и реакция затяжного возбуждения (бег после судорог с вокализацией) не наблюдались. При введении мелатонина в дозе 75 мг/кг в опытной группе животных наблюдались схожие изменения латентного периода развития судорог, как и в случае введения мелатонина в дозе 50 мг/кг - латентность развития стадии "1" судорог в опыте была достоверно выше, чем в группе интактных КМ (4,67± 1,08с и 2,66±0,23с соответственно, р 0,05), латентность развития стадии "2" припадка в группе с введением мелатонина (12,33±1,78с) также была выше, чем в группах КМ (6,44±0,22с, р 0,05) и контроле (7,50±1,11с, р 0,05). Однако, тяжесть судорог в опытной группе еще более снижалась до 1,20±0,55 балла по сравнению с интактными КМ {4,59±0,09 балла, р 0,01) и контролем (4,20±0,22 балла, р 0,01), при этом у 40% животных опытной группы судороги полностью отсутствовали, у остальных достигали только стадии "2". Реакция затяжного возбуждения и 2-х фазного бега в составе припадков крыс этой экспериментальной группы животных также отсутствовали. В обоих случаях параметры аудиогенньгх припадков крыс контрольных групп и интактных КМ достоверно не различались.
Известно, что введение взрослым крысам мелатонина в дозе 75 мг/кг вызывает увеличение порога генерации эпи лепти формных разрядов и снижает тяжесть судорог при электрическом киндлинге (модель височной эпилепсии), однако при введении в дозе 100 мг/кг мелатонин также вызывает снижение температуры тела крыс на 0,5 градуса (Mevissen and Ebert, 1998). В дозе 50 мг/кг мелатонин значительно увеличивает порог индукции вызванных электрошоком судорог у мышей (Borowicz, 1999), а также предотвращает судороги, вызванные пентилентетразолом у песчанок {Champney, 1996). Как следует из приведенных выше данных, внутрибрюшинное введение мелатонина также значительно ослабляет аудиогенные судороги крыс линии КМ. При введении обеих доз препарата двигательных нарушений у крыс линии КМ в период от введения мелатонина до тестирования на судорожную активность не наблюдалось. В случае введения вальпроата натрия наблюдалось значительное облегчение судорожной реакции, реакции затяжного возбуждения и вокализации не наблюдалось, однако 60% (3/5) крыс опытной группы дополнительно проявляли 2-х фазный бег в составе судорожного припадка, что, по данным литературы, свидетельствует о развитии сильных тормозных процессов (Семиохина и др, 1993; Ross and Coleman, 2000).
