Введение к работе
Актуальность проблемы. Открытие и получение рекомбинантных форм цитокинов позволило значительно продвинуться в терапии лейкопений и анемий различного генеза. На смену неспецифическим гемостимуляторам (зимозан, спленин, витамины С, В1, В6, экстракт элеутерококка, гормоны, соли лития), которые оказались мало эффективными при нарушениях кроветворения, в том числе цитостатических миелосупрессиях, пришли препараты на основе эндогенных регуляторов гемопоэза (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцито-макрофагальный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин, тромбопоэтин и др.) [Переводчикова Н.И., 2005; Гольдберг Е.Д., 2007]. Связываясь с высокоаффинными специфическими рецепторами (а при увеличении уровня цитокина в крови и тканях и с рецепторами умеренной аффинности), цитокины стимулируют пролиферацию и индуцируют дифференцировку коммитированных кроветворных предшественников [Воробьев А.И., 2002; Скурихин Е.Г., 2005; Гольдберг Е.Д., 2007]. Преимущество таких лекарственных средств заключается в их исключительно высокой активности и возможности избирательного воздействия на определенные ростки кроветворения [Wang S.Y., 1991; Trillet-Lenoir V., 1993; Воробьев А.И., 200].
Однако зачастую терапевтическим эффектам препаратов ростовых факторов, в частности гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) и эритропоэтина, сопутствуют нежелательные побочные реакции (костно-мышечные боли, артралгия, аллергические реакции и др.) [Vial T., 1995; Белогурова М.Б., 2003; Glaspy J.A., 2003; Нифонтова И.Н., 2008]. Возможность применения указанных лекарственных средств ограничивается также достаточно высокой скоростью элиминации [Piedmonte D.M., 2008]. К тому же недостатками применения препаратов рекомбинантных цитокинов являются малая эффективность при краткосрочном применении.
Активно развивающееся в экспериментальной медицине направление по изучению нейромедиаторных механизмов регуляции гемопоэза в норме и при патологии позволило сформулировать новые принципы поиска и создания лекарственных средств, стимулирующих гемопоэз [Гольдберг Е.Д. и др., 1997; Гольдберг Е.Д. и др., 2004; Гольдберг Е.Д. и др., 2007, 2008; Гольдберг Е.Д., 2009; Дыгай А.М. и др. 2011]. Так, на основании собственных результатов и данных литературы Е.Д. Гольдберг и А.М. Дыгай с соавт. (1997, 2004, 2007, 2008, 2011) предположили, что целесообразным подходом к ускорению регенерации подавленного цитостатиками гемопоэза может выступать воздействие на локальные и дистантные нейромедиаторные структуры, задействованные в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток крови. Авторами был предложен метод терапии цитостатических миелосупрессий с помощью лекарственных средств, модулирующих активность симпатического отдела вегетативной нервной системы (ВНС) [Гольдберг Е.Д. и др., 1996]. В дальнейшем было обнаружено, что эффективным средством для защиты эритрона от токсического действия цитостатиков из группы антиметаболитов выступает антисеротониновый препарат ципрогептадин [Минакова М.Ю. и др., 2007], симпатолитик резерпин существенно ускоряет процессы регенерации гранулоцитарного ростка при назначении алкилирующего агента циклофосфана [Дыгай А.М. и др., 2008].
Безусловно, существует определённая перспектива использования в клинической гематологии нейрофармакологических агентов в качестве стимуляторов и/или протекторов. Однако большинство исследований по данной проблеме проводились на уровне коммитированных кроветворных предшественников и зрелых клеток крови. На сегодняшний день представления о моноаминергических основах жизнедеятельности стволовых кроветворных клеток различных классов (самоподдержание, мобилизация, дифференцировка) и клеток кроветворного микроокружения (гемопоэтическая активность) в условиях регенерации тканей, поврежденных цитостатическими агентами, отсутствуют, что затрудняет формирование конкретных предложений по применению в практике лекарственных средств, модулирующих активность моноаминергических систем.
Повышенным интересом в клинической практике пользуется комплексная терапия нарушений, возникающих в системе крови при использовании антибластомных средств (назначение нескольких препаратов гемостимуляторов на основе рекомбинантных форм цитокинов). Вместе с тем этот метод представляет большую опасность, чем моноцитокинтерапия, в силу возможной суммации сопутствующих введению цитокинов негативных явлений. Альтернативным, наиболее безопасным и эффективным способом в борьбе с миелодепрессиями и анемиями может выступить совместное использование нейрофармакологических агентов и миелоидных колониестимулирующих факторов (гранулоцитарный и гранулоцито-макрофагальный) или эритроидного фактора роста (эритропоэтин). К примеру, антисеротониновый препарат ципрогептадин существенно усиливает стимулирующее действие эритропоэтина в условиях введения 5-фторурацила [Гольдберг Е.Д. и др., 2009].
Принимая во внимание вышеизложенное, представляет несомненный интерес изучение адренергического, дофаминергического и серотонинергического контроля стволовых кроветворных клеток, а также моноаминергических механизмов восполнения потерь коммитированных предшественников различных классов после цитостатических воздействий. Исследование в данном контексте представляет не только теоретический, но и практический интерес, так как полученные результаты позволят дать патогенетическое обоснование целесообразности совместного применения нейрофармакологических агентов и ростовых факторов при заболеваниях системы крови.
Цель исследования. На модели циклофосфановой миелосупрессии изучить особенности моноаминергического контроля функциональной активности кроветворных предшественников различных классов. Дать патогенетическую оценку целесообразности совместного применения резерпина и гранулоцитарного КСФ в коррекции цитостатических лейкопений.
Задачи исследования:
-
Изучить прямое действие адреномиметиков, дофамина и серотонина на кроветворные предшественники различных классов и стромальные предшественники в условиях введения циклофосфана.
-
Оценить влияние моноаминергических лигандов in vitro на клетки кроветворного микроокружения (фибробласты, Thy 1,2+–клетки) при цитостатическом воздействии.
-
Исследовать возможность модуляции резерпином и Г-КСФ активности адреномиметиков, дофамина и серотонина in vitro в отношении стромальных и кроветворных предшественников, а также клеток кроветворного микроокружения при цитостатической миелосупрессии.
-
Изучить механизмы гранулоцитопоэзстимулирующей активности резерпина в условиях введения алкилирующего агента.
-
Выявить основы усиления резерпином гранулоцитопоэзстимулирующей активности гранулоцитарного КСФ.
Научная новизна работы. В работе в сравнительном аспекте изучено действие - и -адреномиметиков, дофамина и серотонина in vitro на костномозговые стволовые кроветворные клетки (КОЕ-Н, КОЕ-ГЭММ), коммитированные кроветворные (КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-Э) и стромальные (КОЕ-Ф) клетки-предшественники, а также клетки кроветворного микроокружения у мышей линии CBA/Calac в условиях введения циклофосфана. Продемонстрировано, что лиганды моноаминергической природы (более - и -адреномиметики) ускоряют инициированную гранулоцитарным КСФ in vitro дифференцировку полипотентных кроветворных клеток в направлении предшественников грануломоноцитопоэза и увеличивают темпы деления вновь образованных КОЕ-ГМ. Изучаемые соединения (более серотонин) повышают фидерную активность фибробластных клеток в отношении КОЕ-Г.
Выявлены особенности действия лигандов моноаминергической природы, заключающиеся, во-первых, в дополнительной стимуляции адреномиметиками дифференцировки полипотентных кроветворных клеток в направление КОЕ-Г и КОЕ-М, и понижении активности указанных процессов дофамином. Во-вторых, в стимуляции роста КОЕ из клеток стромального происхождения под влиянием серотонина. В-третьих, в ингибиции isoprenaline и phenylephrine колониеобразующей активности эритроидных, гранулоцитарных и фибробластных предшественников.
Показано, что на фоне развития миелосупрессии однократное введение резерпина in vivo (в противоположность стимулирующему действию Г-КСФ при курсовом назначении in vivo) угнетает инициированную лигандами моноаминергической природы in vitro дифференцировку полипотентных кроветворных клеток в направлении гранулоцитарных предшественников и функциональную активность КОЕ-Э, подобно цитокину повышает опосредованную адреномиметиками гемопоэтическую активность Thy 1, 2+–клеток и стромальных клеток кроветворного микроокружения преимущественно в отношении КОЕ-Г.
Феномен потенцирования резерпином гранулоцитопоэзстимулирующей активности Г-КСФ в условиях введения циклофосфана связан с увеличением количества костномозговых полипотентных кроветворных клеток и скорости их дифференцировки в направлении предшественников грануломоноцитопоэза, а также со стимулирующим влиянием стромальных клеток и Thy 1,2+–клеток на кроветворные предшественники (преимущественно КОЕ-ГЭММ).
Практическая значимость работы. Продемонстрированы особенности регуляторного влияния лигандов моноаминергической природы in vitro на примитивные и коммитированные кроветворные клетки-предшественники, стромальные предшественники, а также клетки кроветворного микроокружения (фибробласты, Thy 1,2+–клетки) в условиях цитостатической миелосупрессии. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание локальных моноаминергических механизмов контроля процессов регенерации подавленного циклофосфаном гемопоэза.
Результаты экспериментального исследования могут явиться основой для разработки методов фармакологической коррекции гипопластических состояний кроветворной ткани с помощью лекарственных средств, избирательно модулирующих активность периферических моноаминергических структур, экспрессирующихся на СКК и коммитированных кроветворных предшественниках, а также на клетках кроветворного микроокружения.
Материалы исследования эффектов, возникающих при последовательном назначении резерпина и Г-КСФ in vivo, модуляции цитокином эффектов лигандов моноаминергической природы in vitro позволили обосновать целесообразность применения нейрофармакологических агентов центрального и периферического действия в коррекции цитостатических лейкопений совместно с препаратами на основе рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Екатеринбург, 2009), IV региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2009), II международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009), V Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), VI региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 9 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Получено положительное решение по патенту (RU) на изобретение: "Способ определения эффективности гемостимуляторов при цитостатической миелосупрессии", № 2009125095.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 218 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 29 таблицами. Библиографический указатель включает 442 источника литературы, в том числе 302 иностранных.
