Введение к работе
Актуальность проблемы: Вопрос участия иммунной системы в патогенезе злокачественных новообразований стоит перед исследователями с момента открытия феномена иммунного ответа. Несмотря на богатый феноменологический материал [Барышников А.Ю., 2007, Бережная Н.М., Чехун В.М., 2005, Кадагидзе З.Г., 2005, Schirrmacher V. et al., 2002, Ben-Baruch A., 2003, Kurtenkov O. et al., 2005, DeNardo D.G., Coussens L.M., 2007, Curiel T.J., 2007 T.J., 2007, Swann J.B., Smyth M.J., 2007, . et al. 2008, . et al., 2008, Standish L. et al. 2008, ., 2009, Nicolini A., Carpi A., 2009, Zitvogel L. et al., 2008, Bacacs T., Mehrishi J., 2010 и пр.] до настоящего времени суждения о роли иммунной системы в патогенезе большинства солидных злокачественных новообразований носят противоречивый характер [Swann J.B., Smyth M.J., 2007 Curiel T.J., 2007 T.J., 2007, Nicolini A., Carpi A., 2009]. С чем связана такая неоднозначная позиция в оценке влияния иммунной системы на опухолевый рост?
Во-первых, эволюционно взаимоотношения иммунной системы и опухоли складываются как амбивалентные [Бережная Н.М., Чехун В.М., 2005]. Активность иммунной системы в отношении злокачественных клеток находит выражение в реализации, как минимум, двух вариантов развития событий – элиминации опухоли или содействии ее росту и прогрессии [Ben-Baruch A., 2003, Nicolini A., Carpi A., 2009, Curiel T.J., 2007 T.J., 2007, Swann J.B., Smyth M.J., 2007]. Наличие противоопухолевой активности у иммунной системы при раке молочной железы (РМЖ) подтверждается тем, что снижение количества или функциональности специализированных эффекторов связано с более тяжелым клиническим течением заболевания, низкой эффективностью лечения и худшими показателями выживаемости. Подобная взаимосвязь показана как в отношении механизмов врожденного (NK-клетки, естественные антитела, полиморфизм генов TLR4) [Kurtenkov O. еt al., 2005, Zitvogel L. еt al., 2008], так и адаптивного иммунного ответа [.et al., 2008, Schirrmacher V.et al., 2002].
Однако противоопухолевая активность иммунной системы во многих случаях неэффективна в результате ускользания опухоли из-под иммунологического контроля [Антонов В.Г., Козлов В.К., 2004, Curiel T.J., 2007 T.J., 2007, Swann J.B., Smyth M.J., 2007, Nicolini A., Carpi A., 2009]. При этом важное значение имеют механизмы толерантности, осуществляемые иммунной системой в отношении новообразования, возникающего, как известно, из клеток организма-хозяина. Среди наиболее важных супрессорных эффекторов следует отметить T-регуляторные клетки и цитокины IL-10 и TGF- [Кадагидзе З.Г., 2005, Curiel T.J., 2007 T.J., 2007, ., 2009].
Способствующую опухолевой прогрессии активность иммунной системы у больных РМЖ, в основном, связывают с механизмами хронического воспаления, реализация которого обеспечивается продукцией широкого спектра факторов, содействующих инвазии, неоангиогенезу и метастазированию опухоли. Эти процессы обусловлены функционированием макрофагов 2 типа, формированием Th2-зависимого иммунного ответа, нарушением баланса про- и противовоспалительных цитокинов, хемокинов [Ben-Baruch A., 2003, DeNardo D.G., Coussens L.M., 2007, . еt al. 2008, Standish L. еt al. 2008]. При этом иммунная система активна, и ее функционирование направлено на создание условий для поддержания опухоли.
Современная концепция иммунологического редактирования злокачественного роста рассматривает эти состояния – контроль опухолевого роста иммунной системой, равновесие между активностью опухоли и иммунной системой и избегание опухолью иммуно-опосредованных защитных механизмов со стороны хозяина – как смену последовательных фаз [Swann J.B., Smyth M.J., 2007]. При этом предполагается, что иммунная система также последовательно меняет функциональную направленность от противоопухолевой к проопухолевой по мере генерализации процесса [Балдуева И.А.,
Семиглазов В.Ф., 1996], что подразумевает определенную детерминированность
состояния иммунной системы в зависимости от распространенности опухолевого процесса [Гранов А.М., Молчанов О.Е., 2008] и невозможность ее изменения.
Вторым аспектом, не позволяющим однозначно определить роль иммунной системы в патогенезе злокачественно роста, является множественность механизмов взаимо(противо)действия опухоли и иммунной системы [Swann J.B., Smyth M.J., 2007, Nicolini A., Carpi A., 2009]. Большинство исследований направлено на выявление какого-либо одного ключевого механизма, определяющего про- или противоопухолевое действие иммунной системы. К настоящему времени сменилось несколько основных претендентов на место ключевого механизма: фагоциты, цитотоксические Т-лимфоциты, лимфокин-активированные лимфоциты, NK, интерфероны как противоопухолевые эффекторы, с одной стороны [Kurtenkov O. еt al., 2005, Zitvogel L. еt al., 2008, . et al., 2008, Schirrmacher V. et al., 2002], и опухолеассоциированные макрофаги, Т-регуляторные клетки, миелоидные супрессоры, провоспалительные цитокины как факторы содействия опухолевому росту, с другой стороны [Ben-Baruch A., 2003, DeNardo D.G., Coussens L.M., 2007, . еt al. 2008, Standish L. еt al. 2008]. Однако, само обилие выявляемых механизмов определенно указывает на существование многочисленных путей, направленных как на взаимо-, так и противодействие опухоли и иммунной системы. В каждую фазу взаимодействия одновременно функционируют механизмы той и другой направленности. Эффективное преобладание одной из них определяет общую стратегию иммунной системы. При изменении внешних или внутренних условий механизм, доминирующий на каком-либо этапе «естественной истории опухоли», может утратить свою значимость [Swann J.B., Smyth M.J., 2007], и тогда возможно обращение фазы взаимодействия «опухоль-организм».
Следующая причина неоднозначности в оценке роли иммунной системы в патогенезе злокачественных новообразований заключена в том, что влияние иммунной системы на опухолевый процесс рассматривают преимущественно на уровне эффектов непосредственно в опухолевом микроокружении [Ben-Baruch A., 2003, DeNardo D.G., Coussens L.M., 2007, . еt al., 2008,]. Иммунная система является одной из ключевых для поддержания гомеостаза организма и осуществляет жизненно важные функции, такие как обеспечение адаптации, естественной резистентности, противоинфекционной защиты, регуляции кроветворения и иммунопоэза, регенераторных возможностей [Абрамов В.В., Абрамова Т.Я., 1996, Гольдберг Е.Д. и др., 1996, Корнева Е.А., 2003,Чередеев А.Н., Ковальчук Л.В., 1997, Сепиашвили Р.И. и др., 2000, Ширинский В.С. и др., 2000, Юшков Б.Г. и др., 2010]. Вследствие этого иммунная система способна оказывать воздействие на злокачественный процесс опосредованно, изменяя клинический статус пациента. Системный принцип организации требует оценки морфофункционального состояния иммунной системы как комплекса взаимосвязанных разнонаправленных функций, осуществляемых ею в целом на разных уровнях функционирования [Li Y. еt al., 2008].
Не вызывает сомнений, что функции иммунной системы в существенной мере определяются генотипом организма. Индивидуальные различия связаны с нормальной генетической изменчивостью – полиморфизмом вовлеченных в функционирование иммунной системы генов, среди которых важное значение имеют гены основных медиаторов межклеточных взаимодействий – цитокинов [Баранов В.С., 2000, de Jong M., 2002, Wai C.T., 2003, Ben-Ari Z., 2003.]. На функциональную компетентность иммунной системы онкологического больного, наряду со злокачественным процессом и генетическими вариациями, также может влиять наличие иммунопатологических синдромов инфекционно-аллергической или аутоиммунной природы, приобретенных в онтогенезе [Swann J.B., Smyth M.J., 2007].
В настоящее время комбинированное противоопухолевое лечение является стандартом для большинства злокачественных новообразований. Лечение больных с операбельными формами РМЖ включает сочетанное или последовательное применение различных методов воздействия на опухоль с целью удаления первичного узла (неоадьювантная цитостатическая терапия, оперативное удаление опухоли) и профилактики метастазов (адьювантная химио-, радио- или гормонотерапия). Противоопухолевое лечение оказывает выраженное влияние как на опухоль, так и на организм, в связи с чем его следует позиционировать как фактор патогенеза [Zitvogel L. et al., 2008]. Рассматривая воздействие проводимого лечения на иммунную систему, можно выделить два аспекта. Первый аспект заключается в том, что цитостатические средства способны модифицировать ответ иммунной системы на злокачественное новообразование. В частности, под влиянием ряда химиопрепаратов селективно удаляются клоны клеток, обладающих иммуносупрессивной активностью. Транзиторная лимфопения, вызываемая цитостатическим лечением, приводит к индукции гомеостатической пролиферации иммунокомпетентных клеток [Zagozdzon R. et al, 2001, Ehrke M.J., 2003, Ostrand-Roseberg S. et al., 2004, Carson W.E., 2004, Lutsiak M.E. et al., 2005, Suzuki E.., 2005]. Второй аспект связан с вовлечением механизмов иммунной системы как необходимого звена в реализацию эффектов цитостатического лечения [Apetoh L. et al., 2007, Zitvogel L. et al., 2008]. Недавно появились доказательства, вскрывающие механизм вовлечения эффекторов естественной резистентности в опухолевый надзор. Показано, что индукция сигнального пути в ответ на повреждение ДНК в клетке под влиянием экзогенных и эндогенных генотоксических агентов приводит к экспрессии NKG2D лигандов, которые распознаются натуральными клетками-киллерами (NK) и / Т-лимфоцитами, что приводит к запуску эффекторного NK, NKT и Т-клеточного ответа на трансформированные клетки [Bauer S. et al., 1999, Gasser S. et al., 2005]. Хроническая активация этого ответа, а также индукция еще целого ряда стресс-индуцированных молекул в опухолях при воздействии цитостатических агентов может вносить вклад в распознавание и уничтожение опухолевых клеток в процессе химиотерапии [Бережной А.Е. и др., 2008].
Амбивалентный характер взаимодействия иммунной системы с опухолью, множественность, разнонаправленность и динамичность этих путей, системный принцип функционирования позволяют употребить термин «стратегия функционирования иммунной системы» при осуществлении ею программы сдерживания опухолевого роста или содействия ему. При этом объективным клиническим критерием направленности стратегии может выступать наличие или отсутствие прогрессирования заболевания.
Именно разнородность критериев оценки влияния иммунной системы на опухолевый процесс следует отметить в качестве еще одного объяснения неоднозначности сведений о ее роли в регуляции опухолевой прогрессии. Очевидно, что для корректного подтверждения участия иммунной системы в патогенезе онкологического заболевания необходимо при формировании групп сравнения нивелировать воздействие основных патогенетически значимых факторов злокачественного роста, которые по сути выступают стандартными критериями оценки прогноза клинического течения заболевания, и включают в себя распространенность процесса, биологические характеристики злокачественных клеток, а также клинико-анамнестические особенности пациента и мероприятия проведенного противоопухолевого лечения [Божок А.А. и др., 2005, Perou C.M. et al., 2000].
Таким образом, для адекватной оценки роли иммунной системы в патогенезе РМЖ следует учесть все выше перечисленные моменты. Стратегию иммунной системы следует оценивать на системном уровне функционирования, т.е. как интегрированного целого, включающего в себя весь комплекс осуществляемых ею на разных уровнях функций. Для классификации про- или противоопухолевой стратегии, реализуемой иммунной системой у больных РМЖ, ее состояние должно быть исследовано во взаимосвязи с клинически подтвержденным исходом, а именно, благоприятным (без признаков прогрессирования) или неблагоприятным (прогрессирование, основным фатальным проявлением которого является гематогенное метастазирование). При этом должна быть обеспечена релевантность групп сравнения по основным патогенетическим характеристикам процесса, влияющим на исход заболевания. Следует учитывать, что условия, в которых происходит формирование про- или противоопухолевой стратегии иммунной системы обеспечиваются в совокупности свойствами организма, опухоли и применяемых средств и методов лечения. Поскольку противоопухолевое лечение позиционируется как значимый фактор патогенеза РМЖ, оценку направленности стратегии иммунной системы необходимо проводить на каждом из основных этапов лечебных мероприятий. Комплексный подход, включающий клинические и экспериментальные исследования, а также адекватный аппарат математической обработки больших массивов данных предоставили возможность изучить роль иммунной системы в патогенезе РМЖ на этапах комбинированного лечения и ее влияние на исход заболевания.
Цель исследования: Патогенетическое обоснование различных стратегий иммунной системы, сопряженных с особенностями клинического течения и исходом рака молочной железы (без прогрессирования, различные типы прогрессирования), и исследование механизмов про- и противоопухолевой направленности функционирования иммунной системы у больных РМЖ при проведении комбинированного лечения.
Задачи исследования:
-
Обосновать методологический подход для исследования роли иммунной системы в патогенезе РМЖ.
-
Оценить взаимосвязь состояния иммунной системы как интегрированного целого с характером клинического течения и исходом РМЖ.
-
Исследовать механизмы, лежащие в основе про- и противоопухолевой стратегии, реализуемой иммунной системой у больных РМЖ до начала и на этапах специфического лечения.
-
Исследовать структуру факторов, определяющих различия в состоянии иммунной системы у больных РМЖ при проведении противоопухолевого лечения.
-
Исследовать роль генетической регуляции на основе оценки полиморфизма патогенетически значимых генов в формировании про- и противоопухолевой стратегии иммунной системы у больных РМЖ.
-
Исследовать влияние противоопухолевого лечения на состояние иммунной системы у больных РМЖ и оценить возможность изменения направленности функционирования (противоопухолевая или опухолестимулирующая стратегия) в процессе проводимых лечебных мероприятий.
-
Исследовать вовлечение механизмов иммунной системы в обеспечение различий в клиническом течении РМЖ в условиях применения препарата с адаптогенным действием.
-
Оценить информативную значимость оценки состояния иммунной системы до начала, во время проведения и после завершения комбинированного лечения в качестве дополнительного критерия прогноза клинического течения и исхода РМЖ.
Научная новизна. Создана и апробирована оригинальная модель оценки состояния иммунной системы на системном уровне функционирования. Модель основана на представлении состояния иммунной системы как многомерного наблюдения и его визуализации в пространстве многомерных признаков.
Впервые получены данные о различии в состоянии иммунной системы у больных РМЖ в зависимости от клинического течения и исхода заболевания при соблюдении принципа релевантности стандартных, патогенетически значимых признаков злокачественного процесса и проводимого противоопухолевого лечения в сравниваемых группах, что свидетельствует об участии системы иммунитета в патогенезе данного заболевания и влиянии на его исход.
Показано, что важную роль в изменении стратегии функционирования иммунной системы у больных РМЖ играет осуществляемое противоопухолевое лечение. Получены приоритетные данные, указывающие на динамичность состояния иммунной системы у больных РМЖ на различных этапах комбинированного лечения. Выявлено, что иммунная система в условиях противоопухолевой терапии способна изменить состояние от содействующего опухолевому процессу (проопухолевая стратегия) к обеспечивающему длительную клиническую ремиссию (противоопухолевая стратегия).
В условиях in vitro при воздействии апоптоз-индуцирующих агентов, таких как моноклональные антитела к CD95 для индукции Fas-опосредованного апоптоза, моноклональные антитела к CD3 для индукции активационного апоптоза и цитостатического препарата вепезида, оценены показатели клеточной гибели и связанных с этим механизмов активации и пролиферации мононуклеарных клеток периферической крови. Показаны существенные различия в свойствах клеток периферической крови групп пациентов с разным исходом заболевания: возможность благоприятного исхода РМЖ связана не столько с устойчивостью клеток иммунной системы к индукции клеточной гибели, сколько с пролиферативной активностью и способностью восстанавливать количественные потери, т.е. с механизмами гомеостатической пролиферации при проведении цитостатического лечения.
Впервые показано, что морфофункциональное состояние иммунной системы у больных РМЖ до начала лечения и через 1 год после его завершения формируется, в основном, под влиянием особенностей организма (генотип, адаптационный статус, иммунопатологические состояния), в процессе лечения – под влиянием опухолевого процесса (стадия, степень злокачественности). Влияние схемы, режима и объема проведенного лечения на состояние иммунной системы пациенток сохраняется после его завершения.
Впервые на основе оценки широкого спектра морфофункциональных показателей иммунной системы, характеризующих ее эффекторный и регуляторный потенциал, показано различие организации внутрисистемных процессов ее функционирования в зависимости от особенностей клинического течения злокачественного процесса. Получены новые данные о генетической компоненте регуляции функционирования иммунной системы у больных РМЖ, при этом структура регуляторного паттерна «ген-эффект» изменяется в зависимости от характера воздействий, применяемых на этапах противоопухолевого лечения.
Выявлено, что уровень продукции цитокинов у больных РМЖ до лечения находится под преобладающим влиянием генов провоспалительных цитокинов. На этапе неоадъювантной химиотерапии (НАХТ) регуляция продукции цитокинов зависит от генов CCR5, р53 и TGF-. После завершения лечения наибольшее значение имеет ген противовоспалительного цитокина IL-10.
Показано, что использование препарата рекомбинантного IL-1 беталейкина у больных РМЖ приводит к улучшению адаптационного статуса в процессе противоопухолевого лечения и увеличению периода безрецидивной выживаемости у пациенток с выраженной лимфогенной распространенностью процесса N2 (патент на изобретение № 2304445 «Средство, обладающее адаптогенным действием, и Способ подготовки больных раком молочной железы к проведению специфического противоопухолевого лечения с включением полихимиотерапии»). При этом эффект применения беталейкина связан с его влиянием на состояние иммунной системы.
Практическая значимость. Предложен инструмент интегральной оценки состояния иммунной системы у больных РМЖ как содействующего опухолевой прогрессии, либо как сдерживающего опухолевый рост. Использование предложенного подхода позволяет осуществлять прогноз клинического течения РМЖ до начала, во время проведения и после завершения комбинированного лечения (положительное решение по заявке № 2010129630 от 3.05.2011, приоритет от 15. 07. 2010, «Способ прогнозирования гематогенного метастазирования у больных раком молочной железы, основанный на оценке состояния иммунной системы при проведении противоопухолевого лечения»).
Показана потенциальная возможность регуляции состояния
иммунной системы проведением комбинированного лечения с целью влияния на характер клинического течения РМЖ и индивидуализации противоопухолевых мероприятий. Обоснована возможность использования препаратов, обладающих адаптогенным действием, для регуляции состояния иммунной системы на этапах противоопухолевого лечения.
Полученные данные свидетельствуют о целесообразности оценки состояния иммунной системы на этапах противоопухолевого лечения и динамического наблюдения для прогноза клинического течения РМЖ, риска прогрессирования заболевания, а также для адекватного назначения методов и средств иммунокоррекции. Полученные данные являются основой для валидации параметров, необходимых для адекватной оценки состояния иммунной системы у больных РМЖ на каждом из этапов противоопухолевого лечения и динамического наблюдения.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
При РМЖ существуют различные варианты функционирования иммунной системы, патогенетически связанные с характером клинического течения и исходом заболевания. Про- или противоопухолевая стратегия иммунной системы при РМЖ реализуется на системном уровнем ее функционирования и представляет собой комплекс взаимосвязанных механизмов, действующих на разных уровнях организации системы.
-
Стратегическая направленность функционирования иммунной системы при РМЖ формируется в результате взаимодействия генетически детерминированных и функциональных параметров организма, клинико-патологических характеристик опухолевого процесса. Вариабельность иммунологических параметров у больных РМЖ, определяющая морфофункциональные возможности системы, до начала противоопухолевого лечения и через 1 год после его завершения, в основном, связана с индивидуальными особенностями организма (генотипические вариации в продукции патогенетически значимых цитокинов, морфофункциональная асимметрия, адаптационный статус, иммунопатологические состояния), на этапах противоопухолевого лечения – с параметрами опухолевого процесса (стадия, биологические свойства опухолевых клеток).
-
Состояние иммунной системы при РМЖ динамично: проведение специфического лечения (неоадъювантная химиотерапия, оперативное удаление первичной опухоли) способствует изменению проопухолевой стратегии иммунной системы на противоопухолевую. Механизмы, определяющие стратегию функционирования иммунной системы у больных РМЖ, связаны с характером воздействий, осуществляемых на этапах специфического лечения.
-
Оценка состояния иммунной системы у больных РМЖ на этапах противоопухолевого лечения и динамического наблюдения может быть использована в качестве дополнительного критерия прогноза клинического течения РМЖ, риска прогрессирования заболевания, а также для адекватного назначения методов и средств иммунокоррекции.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции, посвященной памяти и 95-летию со дня рождения В.А.Пегеля (Томск, 2001), Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты» (Новосибирск, 2002), Обществе онкологов в (Томск 2003, 2005, 2007) на Объединенном Иммунологическом Форуме (Екатеринбург, 2004), на VIII, IX, XI Всероссийском научном
форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С-Петербург, 2004, 2005, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2006), республиканской научной конференции
«Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007), научной
конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири — 2008» (Томск, 2008), Четвертой всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), Российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы современной онкологии» (Барнаул, 2009), Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), Siberian-Taiwan Forum: Tomsk Region and Taiwan: Experience of Scientific – Technical and Innovation Cooperation, 16-17 September (Tomsk, 2009), International conference “Tumor and host: novel aspects of old problem” (Kyiv, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 73 работы, в том числе 16 – в центральных журналах, рекомендованных “Перечнем…” ВАК Минобрнауки, 2 в зарубежной печати. Получен патент на изобретение № 2304445 «Средство, обладающее адаптогенным действием, и Способ подготовки больных раком молочной железы к проведению специфического противоопухолевого лечения с включением полихимиотерапии» (заявлено 20.10.2004, опубликовано 20.08.2007, Бюл. № 23). Получено положительное решение по заявке № 2010129630 от 3.05.2011 (приоритет от 15. 07. 2010) на изобретение «Способ прогнозирования гематогенного метастазирования у больных раком молочной железы, основанный на оценке состояния иммунной системы при проведении противоопухолевого лечения».
Внедрение результатов исследования. Выявленные критерии прогноза клинического течения РМЖ на основании оценки состояния иммунной системы внедрены для практического применения в лаборатории иммунологии и отделении общей онкологии НИИ онкологии СО РАМН. Результаты исследования используются в учебном процессе для преподавания раздела иммунологии опухолевого роста на кафедре иммунологии и аллергологии ГОУ ВПО СибГМУ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 377 страницах машинописного текста и состоит из введения, восьми глав, включающих обзор литературы, материалы и методы исследования, шести глав с изложением собственных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 412 источника, из них 98 российских, 314 иностранных. Работа иллюстрирована 65 таблицами и 23 рисунками.
