Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Эпидемиология бронхоспазма физической нагрузки 9
1.2. Механизмы реализации бронхоспазма физической нагрузки 13
1.3. Роль оксида азотав организме 22
1.4. Методы измерения оксида азота 34
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 35
2.1. Характеристика исследуемых групп 3535
2.2. Методы исследования 36
ГЛАВА 3. Результаты 50
3.1. Клиническая характеристика исследуемых групп 50
3.2. Особенности функции внешнего дыхания в исследуемых группах 523
3.3. Распространенность бронхоспазма физической нагрузки 57
3.4. Динамика уровня оксида азота в выдыхаемом воздухе и его метаболитов в дыхательном конденсате до и после тренировки в сравниваемых группах 62
3.5. Взаимосвязь уровня оксида азота в выдыхаемом воздухе м его метаболитов с параметрами функции внешнего дыхания
3.6. Особенности динамики окида азота в выдыхаемом воздухе после тренировки у спортсменов 68
3.7. Особенности динамики оксида азота в выдыхаемом воздухе и его метаболитов в дыхательном конденсате в группе спортсменов с наличием и без бронхоспазма физической нагрузки 7171
Глава 4. Обсуждение 76
Выводы 9090
Список литературы
- Механизмы реализации бронхоспазма физической нагрузки
- Методы измерения оксида азота
- Распространенность бронхоспазма физической нагрузки
- Особенности динамики окида азота в выдыхаемом воздухе после тренировки у спортсменов
Механизмы реализации бронхоспазма физической нагрузки
В настоящее время появляется все больше данных о том, что воспаление дыхательных путей играет немаловажную роль в патогенезе БФН. Известно, что интенсивные, повторяющиеся физические нагрузки на выносливость в течение длительного периода времени в сочетании с неблагоприятными условиями окружающей среды способны инициировать воспалительные изменения в дыхательных путях [28, 41, 51, 133, 163]. Так, в группе молодых лыжников с гиперреактивностью дыхательных путей к холодному воздуху, выявлено повышенное количество лимфоцитов и утолщение базальной мембраны по данным бронхиальной биопсии [118, 200, 201]. По некоторым данным, холодный воздух самостоятельно способен вызвать воспаление дыхательных путей у здоровых лиц [138]. Кроме того, ряд исследований продемонстрировали, что изолированная физическая нагрузка также способна приводить к воспалению воздухоносных путей. Так, в эксперименте в группе тренированных мышей выявлено достоверное (р 0,001) снижение количества реснитчатого эпителия, утолщение базальной мембраны, увеличения лейкоцитов в стенке дыхательных путей по сравнению с группой «нетренированных» мышей [41]. Схожие результаты получены у гончих собак на Аляске, по данным бронхоальвеолярного лаважа отмечалось повышенное количество макрофагов и эозинофилов по сравнению с контрольной группой собак [51].
Еще одним подтверждением данного факта служит исследование Helenius и соавторов, в индуцированной мокроте высококвалифицированных пловцов отмечалось достоверное (р 0,01) повышение эозинофилов, нейтрофилов по сравнению с контрольной группой здоровых добровольцев [102]. При проспективном наблюдении этих спортсменов в течение 5 лет отмечено увеличение эозинофилов и лимфоцитоза в индуцированной мокроте в группе активных пловцов, в то время как у спортсменов, завершившие спортивную карьеру, наблюдалось достоверное их снижение, вместе с этим исчезли клинические проявления БФН и БГР [103].
Ряд исследований установили, что механизмы воспаления при бронхоспазме физической нагрузке у пациентов с бронхиальной астмой не идентичны таковым без сочетания с БА. Так, например, известно, что бронхоспазм у пациентов с БА/БФН эффективно купируется ингаляционными кортикостероидами, в то время как при БФН без БА данного эффекта не отмечается. Еще одним фактом различия патогенеза БА и БФН служит исследование Holzer и соавторов. Установлено, что 80-90% пациентов с БА/БФН имеют положительный тест с метахолином, в то время как авторы зарегистрировали его лишь у 21% (п=9 из 42) спортсменов с симптомами обструкции дыхательных путей, в то время как у 60% (п=25) отмечался положительный тест с эукапнической гипервентиляцией [ПО].
Воспаление дыхательных путей при бронхиальной астме и БА/БФН, как правило, носит эозинофильный характер, изолированный феномен БФН у элитных спортсменов больше связан с нейтрофильным или смешанным типом воспаления [101, 105, ПО, 183]. Нейтрофильный характер воспаления при бронхоспазме физической нагрузке у спортсменов обусловлен высвобождением провоспалительного хемокина - ИЛ-8, который играет существенную роль в патогенезе воспаления мелких бронхов. ИЛ-8 высвобождается тучными клетками во время дегрануляции в условиях гиперосмолярности и охлаждение дыхательных путей [33, 35, 99, 104]. Кроме того, повышения уровня нейтрофилов может быть следствием ответа на внешний раздражитель и различные вирусные агенты, в результате активации IgE- независимых иммунных механизмов, в отличие от атопического воспаления [58]. Более того существуют данные, что повышение уровня нейтрофилов увеличивает чувствительность гладких мышц дыхательных путей и является важным фактором в индукции бронхиальной гиперреактивности и БФН у элитных спортсменов [10, 12]. По ряду данных, продемонстрирована взаимосвязь БА/БФН и эозинофильного воспаления, так в одном из работ был выявлено достоверно (р=0,006) высокий процент эозинофилов в индуцированной мокроте после физической нагрузки у лиц с БФН/БА по сравнению с лицами с БА и без БФН. В группе БА/БФН получена достоверная (р=0,009) положительная корреляция между тяжестью БФН и степени увеличения эозинофилов [60, 129, 228].
Между тем, Gauvreau и соавторы установили, что бронхоспазм, провоцируемый физической нагрузкой, самостоятельно не способен вызывать воспаление дыхательных путей и бронхиальную гиперреактивность. Так, в исследование были включены пациенты с БА, которые рандомизированы на подгруппы с бронхопровокационными тестами с физической нагрузкой и метахолином. В группе пациентов стандартным тестом с физической нагрузкой воспалительных изменений в мокроте и в крови не обнаружено, и более того, физическая нагрузка не влияла на реактивность бронхов. В то время как в группе пациентов с метахолиновым тестом отмечалась достоверное увеличение (р 0,05) эозинофилов в индуцированной мокроте и БГР [80, 117].
Механизмы повреждения дыхательных путей при бронхоспазме физической нагрузки Следующим важнейшим фактором БФН является повреждение слизистой дыхательных путей при повторяющейся гипервентиляции во время физической нагрузки и при воздействии холодного воздуха, что наиболее актуально для спортсменов, занимающихся зимними видами спорта [10]. Вдыхание большого потока холодного воздуха приводит к повреждению эпителия дистальных бронхов, которые наиболее чувствительны и склонны к обезвоживанию и повреждению. В результате повреждения эпителиальных клетках нижних дыхательных путей происходит экссудация плазмы и индукция воспалительного ответа [10, 90]. Ключевым моментом является многократное повторение цикла повреждения и репарации слизистой ДП в течение сезона, в частности у спортсменов, занимающихся зимними видами спорта [169].
Получены убедительные данные, подтверждающие гипотезу процессов повреждения и восстановления слизистой дыхательных путей. Так, в образцах эндобронхиального биоптата лыжников было обнаружено утолщение базальной мембраны и большая степень концентрации нейтрофилов в мокроте, что нетипично для картины атопической или неатопической астмы [32, 33, 118, 201]. Важным подтверждением гипотезы повреждения дыхательных путей являются исследования Chimenti и соавторов: по данным иммуногистохимического исследования легких мышей после активной тренировки под действием холодного воздуха выявлено повреждения реснитчатого эпителия, утолщение базальной мембраны, увеличение воспалительных клеток, признаки пролиферации клеток [41].
Методы измерения оксида азота
Протокол непрямого определения NO (суммарная концентрация стабильных метаболитов NO - нитратов и нитритов) в конденсате выдыхаемого воздуха (Total NO/Nitrite/Nitrate Assay R&D Systems) С целью оценки взаимосвязи синтеза оксида азота с БФН, всем субъектам, вовлеченным в исследование, проводили измерение эндогенного нитрита и общего нитрита.
Принцип метода. Тест определяет общее количество оксида азота NO и основан на ферментном превращении нитрата в нитрит с участием фермента нитрат-редуктазы. Реакция регистрирует колориметрически концентрацию нитрита по азокрасителю, образующемуся в реакции Грисса. Реакция Грисса основана на двухстадийной реакции диазотирования, в которой кислый N02-производит нитрозатирующий агент, реагирующий с сульфаниловой кислотой с образованием иона диазония. Этот ион присоединяется к №(1-нафтил) этилендиамину с формированием цветного азопроизводного, которое поглощает свет на длине волны 540-570 нм. Необходимые материалы и оборудование 1. Набор для количественного определения окиси азота Total NO/Nitrite/Nitrate Assay (Кат. №KGE001 - 96 определений):
Определить оптическую плотность ячеек при 540 нм (референс-фильтр 690 Образцы должны быть профильтрованы и разбавлены. Нитрат-редуктаза должна быть разбавлена. Расчет результатов. Рассчитать среднее значение поглощения для каждого стандарта и образца, вычитая значение оптической плотности (ОП) Бланка. Построить стандартную параметрическую кривую, используя программное обеспечение.
В качестве альтернативы: построить калибровочную кривую "оптическая плотность/концентрация". Определить концентрации в образцах из стандартной кривой.
Протокол определения нитротирозина в дыхательном конденсате (НК501 Nitrotyrosine ELISA kit (Hycult biotech)
Для количественного определения нитротирозина в дыхательном конденсате использовался набор НК501 Nitrotyrosine ELISA kit (Hycult biotech). Nitrotyrosine ELISA представляет собой готовый к использованию набор, в основе лежит метод твердофазного иммуноферментного анализа (принцип «сэндвича»). Определение уровня нитротирозина используется в качестве маркера воспаления и оценки продукции NO. Кроме того, будучи белковой структурой нитротирозин имеют более длительный период полураспада в сравнении с другими метаболитами NO. Поскольку нитротирозин является стабильным конечным продуктом окисления пероксинитрита, измерение его концентрации также могут быть полезны в качестве оценки нитрозативного стресса.
Принцип метода. Моноклональные антитела, специфичные к нитротирозину иммобилизуются на внутренней поверхности полистиролового 96-луночного планшета для микротитрования. Вносили образцы конденсата и разведенные стандарты набора инкубируют. После инкубации и промывок в ячейки планшета вносят вторые антитела, в виде конъюгата с биотином. Вновь инкубируют и промывают. Затем вносят конъюгат пероксидазы со стрептавидином, имеющий очень высокое сродство к биотину, вновь инкубируют и промывают. После вносят субстрат тетраметилбензидина, с которым связывается конъюгат стрептавидин-пероксидаза. Ферментативную реакцию останавливают добавлением щавелевой кислоты. Измеряют активность связанной пероксидазы с помощью автоматического спектрофотометра для микропланшетов. Материалы и реактивы, необходимые для постановки анализа. б) Буфер для разведения. Готовить буфер для разведения путем смешивания 10 мл 10х буфера разбавления и 90 мл дистиллированной или деионизированной воды, что является достаточным для 2x96 тестов. При необходимости приготовления меньшего объема, подготовьте требуемый объема буфера для разведения разбавлением 1 части 10х буфера разбавления в 9 частях дистиллированной или деионизированной водой. Концентрированный буфера разбавления может содержать кристаллы. Если кристаллы не исчезают при комнатной температуре в течение 1 часа, нагрейте концентрированный буфер разбавления до 37 С. Не трясите. в) Стандартный раствор. Стандарт восстанавливают с помощью добавления 1 мл дистиллированной или деионизированной воды. Подготовьте стандарты нитротирозина в полипропиленовых пробирках путем серийного разведения восстановленного стандарта с буфером разведения. г) Раствор индикатора Tracer (биотинилированные вторые антитела). Раствор индикатора восстанавливают с помощью добавления 1 мл дистиллированной или де-ионизированной водой. Развести 1 мл восстановленного Tracer с 11 мл буфера для разведения, что достаточно для 1 х 96 тестов. При необходимости меньшего объема, получить желаемый объем индикатора разбавлением 1 части восстановленного Tracer ell частями буфера для разведения. д) Раствор стрептавидин-пероксидазы (конъюгат). Стрептавидин-пероксидазу восстанавливают с помощью добавления 1 мл дистиллированной или деионизированной воды. Развести восстановленный 1 мл раствора стрептавидин-пероксидазы с 23 мл буфера для разведения, достаточного для 2x96 тестов. При необходимости меньшего объема, подготовить необходимый объем раствора стрептавидин-пероксидазы разбавлением 1 части восстановленной стрептавидин-пероксидазы с 23 частями буфера для разведения. 3. Определить количество ячеек, поставить необходимые стрипы в пригалаемую рамку, и заполнить лист сбора данных. Верните неиспользованные полоски в упаковку с осушителем, запечатайте и храните при температуре 2 - 8 С.
Распространенность бронхоспазма физической нагрузки
В нашем исследовании изучались фракции NO в выдыхаемом воздухе исходно и после тренировки у спортсменов, с целью уточнения роли NO в механизмах БФН. Согласно литературным данным, у больных БА с БФН содержание NO в выдыхаемом воздухе выше, чем у здоровых добровольцев. Результаты данного исследования не обнаружили такой закономерности, более того в группе спортсменов с диагностированным БФН по сравнению с лицами без такового выявлены достоверно (р 0,01) низкие исходные показатели FeNO и VNO, после тренировки статистически значимых различий не продемонстрировано (таблица 21). Для более полного представления о роли NO в развитии нитразивного стресса у лиц с БФН также оценивались показатели метаболитов оксида азота (СКНН, NO ", NO ", 3-нитротирозин) в дыхательном конденсате. При анализе значений метаболитов оксида азота в группах с наличием и без БФН показатели были сопоставимы как исходно, так и после тренировки достоверных различий не выявлено (таблица 21). Динамики по метаболитам до и после тренировки в обеих группах с и без БФН не зарегистрировано.
Необходимо отметить, что после тренировки в группе спортсменов без БФН отмечалось статистически значимое снижение фракции оксида азота и объема выдыхаемого оксида азота за минуту (таблица 22, рисунок 13). Кроме того, в этой же группе получена достоверная прямая корреляция между исходным и постнагрузочным уровнем выдыхаемого оксида азота (г=0,67, р 0,0001) (рисунок 14). Выявленные изменения в группе без БФН обусловлены ускоренным выведением NO из дыхательных путей в условиях гипервентиляции на фоне физической нагрузки.
В группе с БФН подобных закономерностей не зарегистрировано (таблица 22, рисунок 13). В обеих группах получена достоверная (р 0,01) прямая корреляционная взаимосвязь между постнагрузочным уровнем FeNO и скоростными показателями кривой спирографии (таблица 23, рисунок 15, 16, 17).
Изучению патофизиологических механизмов формирования БА/БФН были посвящены многие исследования последних лет. Тем не менее, по-прежнему не существует общепринятой точки зрения и однозначных объяснений изолированного феномена БФН. Актуальным также является исследование особенностей БФН у практически здоровых людей. В настоящее время доказано, что такие пациенты входят в группу риска по формированию БА [9]. В современной литературе представлены две конкурирующие гипотезы возникновения БФН. Термальная гипотеза предполагает участие дыхательных путей в процессах теплообмена и так называемая осмотическая теория, согласно которой во время физической нагрузки происходит испарение влаги с поверхности воздухоносных путей и жидкость, оставшаяся на поверхности бронхов, обретает гиперосмолярные свойства, что приводит к дегрануляции тучных клеток и, в конечном счете, запускает механизмы бронхоспазма (рисунок 18) [211, 229].
Открытие способности многих клеток человека синтезировать оксид азота послужило поводом широких исследований, посвященных роли этой свободнорадикальной молекулы в физиологических и патофизиологических процессах. Оказалось, что NO является важнейшим сигнальным мессенджером, вовлеченным в регуляцию многих сложных биологических процессов, включая аспекты биологии воздухоносных путей. Оксид азота принимает участие в воспалительных реакциях не только, оказывая антибактериальное, противовирусное и цитостатическое действие, но и специфически влияя на направленность иммунного ответа [108, 143, 184, 186].
Определение оксида азота в выдыхаемом воздухе может быть полезно для диагностики бронхиальной астмы и оценки эффективности противовоспалительной терапии.
Несмотря на постоянный интерес исследователей к изучению NO при БА и БА/БФН, в источниках литературы встречаются противоречивые данные об интерпретации роли NO в механизмах формирования изолированного феномена БФН.
Интересным представляется, возможность оценить активность синтеза оксида азота неинвазивными и простыми методами путем определения уровня NO в выдыхаемом воздухе онлайн-методом одиночного вдоха и метаболитов оксида азота в КВВ. Актуальным является изучение взаимосвязи активности синтеза NO и показателей его метаболитов в КВВ, характеризующих воспаление воздухоносных путей у здоровых лиц с феноменом БФН. Одним направлением данного исследования была оценка функции внешнего дыхания в бронхопровокационной пробе с физической нагрузкой в условиях тренировки на открытом воздухе в группе спортсменов, занимающихся зимними видами спорта и в группе здоровых добровольцев, не занимающихся профессиональным спортом. На рисунке 19 представлен алгоритм диагности БФН у атлетов.
При исследовании ФВД в обеих сравниваемых группах как исходно, так и после физической нагрузки показатели спирографической кривой были сопоставимы. При сравнении основных объемно-скоростных показателей внешнего дыхания между мальчиками в обеих группах достоверных различий не выявлено, аналогичные результаты получены и среди девочек. В группе мальчиков спортсменов отмечалось транзиторное снижение МОС25-75 по сравнению с контрольной группой. Выявлены тендерные различия в обеих группах, спортсменов и контрольной, мальчики продемонстрировали статистически высокие исходные и постнагрузочные показатели функции внешнего дыхания.
Полученные результаты вполне ожидаемы, различия обусловлены анатомическими особенностями строения грудной клетки, большей площадью поверхности дыхательных путей и физиологией внешнего дыхания у мужского пола, что предрасполагает к более высоким показателям ФВД.
Одной из важных задач данного исследования было выявление бронхоспазма физической нагрузки и изучение распространенности этого феномена в двух группах, в группе спортсменов, занимающихся зимними видами спорта и в группе здоровых добровольцев, не занимающихся профессиональным спортом. Известно, что распространенность бронхоспазма физической нагрузки высока у лиц с атопическими заболеваниями (бронхиальная астма, аллергический ринит) [134]. Необходимо отметить, что БФН встречается и в общей популяции у практически здоровых людей [88].
Особенности динамики окида азота в выдыхаемом воздухе после тренировки у спортсменов
Более 20% спортсменов продемонстрировали увеличение фракции NO в выдыхаемом воздухе после физической нагрузки. В данной группе отмечались достоверно более высокие объемно-скоростные показатели внешнего дыхания как исходно, так и после нагрузки по сравнению с лицами без повышения фракции NO. Причем определена положительная взаимосвязь исходных и постнагрузочных значений ПСВ и фракции оксида азота в выдыхаемом воздухе (исходно г=0,46, р=0,04; после нагрузки г=0,50 р=0,02). Аналогичные результаты были получены в ряде работ, De Gouw и соавторы отметили значительное увеличение NO в выдыхаемом воздухе после физической нагрузки у здоровых добровольцев, что достоверно отличалось от значений этого показателя в группе пациентов с астмой [55]. Также увеличение NO у здоровых субъектов после нагрузки в отличие от больных астмой описаны в работе Terada и соав. [204]. Такое увеличение оксида азота в выдыхаемом воздухе у здоровых субъектов может быть вследствие повышения уровня циркулирующего NO в плазме в ответ на физическую нагрузку, который впоследствии диффундирует в альвеолярное пространство. Другим объяснением может служить эндотелиальная гиперпродукция NO в результате увеличения напряжения бронхиальной стенки во время физических упражнений [55]. Вероятно, найденные изменения также обусловлены большей активацией индуцибельной NO-синтазы за счет интенсивного воздействия холодного воздуха на дыхательные пути во время гипервентиляции. У спортсменов с исходно большими объемно-скоростными показателями ФВД возможно предположить, что увеличение площади поверхности дыхательных путей приводит к большему воздействию холодного воздуха [66, 92]. Важно отметить, что у спортсменов с зарегистрированным БФН, вопреки ожидаемым результатам, исходный показатель оксида азота в выдыхаемом воздухе был значимо меньше чем в группе без БФН. После физической нагрузки статистически значимых различий этого показателя не выявлено. Известно, что NO оказывает значимое воздействие на тонус бронхов и сосудов, регуляцию мукоцилиарного клиренса, вероятно зарегистрированный его «дефицит» в выдыхаемом воздухе в группе с БФН и объясняет механизмы реализации феномена бронхоспазма. Кроме того, по мнению Hyde и соав. увеличение продукции оксида азота в дыхательных путях во время физических нагрузок не всегда сопровождается повышением NO в выдыхаемом воздухе. В виду высокой диффузионной способности легких для NO, что связано с низким парциальным давлением азота в капиллярах и высоким градиентом концентрации в клетках дыхательных путей и межклеточного пространства, большая доля NO, продуцируемая в легких, через легочные капилляры транспортируется в кровь [112]. В крови, NO быстро связывается с восстановленным гемоглобином и взаимодействует с цистеиновыми остатками Р -субъединиц гемоглобина с образованием S- нитрозотиолов. Было установлено, что 94% NO из нижних дыхательных путей диффундирует в кровь, в то время как оставшиеся 6 % поступают в просвет дыхательных путей с выдыхаемым воздухом [112]. Последние математические модели, разработанные Hyde и его коллегами, предусматривают, что если продукция NO в дыхательных путях во время физических упражнений остается постоянной, то концентрация NO в выдыхаемом воздухе уменьшается из-за значительного увеличения расхода с выдохом, что, в конечном счете, сокращает время контакта выдыхаемого NO со стенкой дыхательных путей [192]. Это в свою очередь приведет к уменьшению градиента концентрации между альвеолярным пространством и кровью в легочных капиллярах, за счет снижения уровня NO в крови и увеличения его объема NO в выдыхаемом воздухе. Таким образом, физические нагрузки не всегда приводят к повышению уровня NO в выдыхаемом воздухе за счет гиперпродукции эпителиальными клетками дыхательных путей, это может быть обусловлено сдвигом в сторону выведения NO с выдыхаемом воздухом от общего объема продукции из альвеолярной капиллярной сети, в виду увеличения альвеолярной вентиляции [112].
В группе без БФН отмечалось значимое снижение уровня NO в выдыхаемом воздухе после физической нагрузки. Кроме того, найдена тесная положительная корреляция между исходным и постнагрузочным значением NO, подобные изменения ожидаемы в виду ускоренного выведения NO из дыхательных путей в условиях нагрузочной гипервентиляции. По данным полученных результатов в 2х группах с наличием и без БФН показатели метаболитов оксида азота были сопоставимы как исходно, так и после физической нагрузки. Кроме того в обеих группах достоверных различий в динамике метаболитов оксида азота после физической нагрузки не выявлено.
Несмотря на то, что рядом исследований было продемонстрировано увеличение метаболитов оксида азота в ответ на физическую нагрузку в результате усиленного потребления последнего, существуют и противоположные данные. Так, Croix и соавторы не выявили различий в уровне N03-, N02- в плазме венозной крови после физических нагрузок, как при легких, так и при интенсивных упражнениях. Такие же результаты были получены и другими исследователями, не выявлено изменений в содержании конечных продуктов метаболизма NO после теста с физической нагрузкой на тредмиле у здоровых людей [131, 170]. Другими авторами было установлено обратное, длительный бег и езда на велосипеде приводили к значимому увеличению уровня N03 - и N02 - в венозной крови [116, 161]. Вероятным объяснением может служить следующее: что увеличение локального синтеза NO в сосудистом русле легких не всегда способна создавать достаточную концентрацию для измерения метаболитов оксида азота в венозной крови из периферических сосудов. Полученные результаты нашей работы свидетельствуют о том, что реализация неспецифической гиперреактивности бронхов в меньшей степени зависит от экспрессии индуцибельной NO-синтазы по сравнению с атопическим эозинофильным воспалением [219]. Особенности синтеза NO при БФН отличаются от таковых при сочетании данного феномена с астмой. Нами установлено, что физическая активность индуцирует продукцию оксида азота и ассоциирована с лучшими скоростными показателями ФВД у спортсменов.
![Влияние метотрексата и лефлуномида на цитокиновый профиль и метаболизм оксида азота у больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс]](/i/i/4502/210545.png "Влияние метотрексата и лефлуномида на цитокиновый профиль и метаболизм оксида азота у больных ревматоидным артритом [Электронный ресурс] Медведь Елена Эдуардовна")