Содержание к диссертации
Введение
Часть первая (Обзор литературы)
1.1 Химическая структура, природные источники тритерпенових гликозидов 1 1
1.2 Общность структуры тритсрпеноидов и гормонов 13
1.3 Биологическая активность некоторых тритсрпеноидов
1.3.1 Биологическое действие глицирретовой кислоты 13
1.3.2 Биологическое действие бетулина и его производных 17
1.4 Современные представления о механизме свободнорадикального окисления лнпидов 19
1.5 Особенности антиоксидантной активности и биологического действия некоторых природных ингибиторов 22
1.6 Современные представления об эффектах синергизма и антагонизма и совместном действии антиоксидантов 27
1.7 Антиоксиданты в онкотерапии 29
1.8 Активность тритсрпеноидов и стероидных гормонов
1.8.1 Ингибирующис свойства женских половых гормонов (эстрогенов) 31
1.8.2 Антиоксиданти о е действие тестостерона и прогестерона 32
1.8.3 Антиоксидантная активность тритериеноидов 32
Часть вторая (Собственные исследования)
2.1 Материалы и методы исследований
2.1.1 Хемилюминесцснтный метод определения ингибирующей активности фенольиых антиоксидантов 35
2.1.2 Метод ИК-спектроскопии 37
2.1.3 Манометрический метод 39
2.1.4 Определение скорости инициирования процесса окисления 41
2.1.5 Математическая обработка экспериментальных данных 41
2.1.6 Метод обратного ґюдометрического титрования 42
2.1.7 Определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ) методом Ребиндера 43
2.1.8 Методика приготовления исследуемых растворов 44
2.1.9 Реактивы и их очистка 44
2.2 Исследование антиоксидантно й активности аминокислотных производных бетулоновой и глицирретовой кислот
2.2.1 Характеристика объектов исследования 47
2.2.2 Характеристика модельных систем окисления, используемых для изучения ингибирующего действия тритерпеноидов 51
2.2.3 Антиоксидантная активность пептидных производных бстулоновой и глицирретовой кислот в системе окисления, инициированной АИБН 54
2.2.4 Антирадикальная активность ДБК и ДГК 56
2.2.5 Изучение особенностей ингибирующего действия тритерпеноидов и хинонов 58
2.2.6 Ингибирующее действие пептидных производных бетулоновой кислоты в системе окисления, инициированной солями железа 62
2.3 Роль различных фрагментов молекулы дипептида бетулоновой кислоты в процессе окисления
2.3.1. Взаимосвязь между антиоксидантної! активностью и строением производных ряда лупана в системе окисления, инициированной АИБН 64
2.3.2. Особенности ингибирующего действия дипептида бетулоновой кислоты 75
2.3.3. К механизму ингибирующего действия различных фрагментов структуры ДБК 78
2.4 Изучение совместного антиоксидантного действия u- токоферола с дипептидными производными тритерпеноидов и хмнонов
2.4.1. Кинетические эффекты ингибирующего действия а-ТФ
с дипептидными производными бетулоновои и глицирретовой кислот 88
2.4.2. Изучение совместного антиоксидантного действия природных хинонов и а-ТФ 92
2.4.3. Спектроскопические исследования межмолекулярных взаимодействий в системе а-ТФ - хинон 95
2.4.4. Изучение роли различных фрагментов структуры дипептида бетулоновои кислоты при его взаимодействии с а-токоферолом 98
Обсуждение результатов 102
Выводы 115
Список литературы
- Биологическое действие глицирретовой кислоты
- Хемилюминесцснтный метод определения ингибирующей активности фенольиых антиоксидантов
- Определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ) методом Ребиндера
- Антиоксидантная активность пептидных производных бстулоновой и глицирретовой кислот в системе окисления, инициированной АИБН
Введение к работе
Природные и синтетические антиоксиданти находят все большее применение для стабилизации процессов свободнорадикалыюго окисления органических материалов различного назначения: топлива, пластических масс, лекарственных препаратов, липидсодержащих пищевых продуктов. С целью выявления высокоэффективных ингибиторов окисления во всем мире ведется тестирование потенциальных источников природных антноксидантов, химическая модификация и направленный синтез новых соединений. В этом отношении повышенный интерес в последние годы вызывают тритерпеновые сапонины. Наиболее перспективными соединениями этого класса являются глициррстовая кислота, получаемая из корней солодки, и бетулоновая кислота, входящая в состав коры березы. Установлено, что бетулоновая и глициррстовая кислоты и их производные проявляют широкий спектр биологического действия. Выявлена их потивовоспалительная и противоязвенная активность /90,101,164,241/, гепатопротекторные и гшюлипидемическис свойства /29,102,132/, противоопухолевое действие /244,249/, противовирусная активность /170,193,229/. Известно, что введение аминокислотного фрагмента в структуру тритериеноидов влияет на их способность ингибировать репродукцию вируса в клеточных структурах /186,193,207,227/. С целью получения активных анти-ВИЧ агентов в НИОХ им. П.Н. Ворожцова СО РАН синтезированы индивидуальные дипептидные производные бетулоновой и глицирретовой кислот/100,101/.
Систематических исследований бетулоновой, глицирретовой кислот и их пептидных производных в качестве потенциальных антноксидантов ранее не проводилось. В литературе имеются единичные сведения об ингибирующем действии природных смесей тритериеноидов /34,60/, данные об активности индивидуальных соединений еще более ограничены. Показано, что глициррстовая кислота способна тушить люминесценцию сингл ситного кислорода, причем в сравнении с агликоном эффективность соответствующего гликознда выше /60/. Для ряда производных бетулоновой кислоты на биологической модели острого токсического гепатита установлен эффект ингибирования накопления продуктов окисления липидов печени крыс /28/, показано, что введение аланшшмидного фрагмента в молекулу бетулоновой кислоты усиливает антиоксиданті іьіе свойства у самой кислоты и ее метилового эфира /56/. В классических модельных системах антиоксидантная активность веществ этого класса не тестировалось. Представления о возможном механизме ингибирующего действия этих соединении отсутствуют, не изучена роль в процессе окисления различных характеристических групп, входящих в структуру тритерненоидов.
Известно, что в природных объектах тритерпеноиды присутствуют в композициях с природными антиоксидантами (а-токоферолом, флавоноидами, хипопами), однако данные о характере их совместного ингибирующего действия в литературе отсутствуют.
В связи с вышеизложенным изучение кинетики и механизма ингибирующего действия индивидуальных тритерпеноидов и их функциональных производных, в частности, дипептидов, представляет немаловажный теоретический и практический интерес.
Целью работы являлось изучение закономерностей ингибирующего действия индивидуальных пептидных производных бетулоновой и глицирретовой кислот, исследование взаимосвязи между строением и эффективностью соединений, выявление характера совместного действия тритерпеноидов и основного природного антиоксиданта а-токоферола. Задачи исследования:
1. Исследовать кинетику окисления модельного субстрата (метилолеата) в
присутствии производных тритерпеноидов: метилового эфира N -{N-[3 ацстокси-11-оксо-12-олсанен-29-оил]-9-аминонаноил}-3-амино-3 фенилпропионовой кислоты (I); метилового эфира N -{N-[3-OKCO-20(29) лупен-28-оил]-9-амішонаноил}-3-амиію-3-фенилпропионовой кислоты (II); бстулина (III); 3-ацетоксибетулина (IV); 28-ацстоксибетулина (V); 3,28-диацстоксибетулина (VI); 3-оксобетулина (VII); метилового эфира бетулоновой кислоты (VIII); метилового эфира бетулиновой кислоты (IX); метилового эфира Н -[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-2 аминоуксусной кислоты (X) при различных способах инициирования процесса.
2. Изучить характер зависимости брутто-ингибирующего действия от концентрации исследуемых соединений.
3. Хемнлюминесцснтным методом протестировать антирадикальную активность дипептидных производных тритерпеиоидов (I, II).
4. Оценить роль различных фрагментов молекулы в обеспечении брутто-ингибирующего действия дипептидов глицирретовой (I) и бетулоповой кислот (II).
5. Исследовать кинетику совместного антиоксидантного действия дипептидов глицирретовой и бетулоповой кислот с а-токоферолом.
6. Изучить характер и механизм совместного ингибирующего действия а-токоферола с природными хинонами (убихиноном Qio, филлохиноном, токотриенолхиноном).
Научная новизна, В диссертационной работе впервые исследованы антиоксидантиые свойства индивидуальных тритерпеиоидов: метилового эфира Ы {Ы-[3-ацетокси-П-оксо-12-олеаиен-29-оил]-9-аминонаноил}-3-амино-3-фенилпропионовой кислоты (I); метилового эфира N -{N-[3-OKCO-20(29) ynen-28-оил]-9-аминонаноил}-3-амшю-3-фенилпропиоіювой кислоты (II); бетулина (луп-20(29)-ен-3,28-диол) (III); 3-ацетоксибетулииа (3-ацетокси-луп-20(29)-сн-28-ол) (IV); 28-ацетоксибетулина (28-ацетокси-луп-20(29)-ен-3-ол) (V); 3,28-диацетоксибетулина (3,28-диацетокси-луп-20(29)-сн) (VI); 3-оксобетулина (3-оксо-луп-20(29)-ен-28-ол) (VII); метилового эфира бетулоповой кислоты (метилового эфира 3-оксо-луп-20(29)-сп-28-оил) (VIII); метилового эфира бетулиновой кислоты (метиловый эфир 3-гидрокси-луп-20(29)-еи-28-оил) (IX); метилового эфира Г-[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-2-аминоуксусной кислоты (X).
УстаноЕшены диапазоны концентраций, соответствующие проявлению максимальной антиоксидантной активности соединений. Методом хемилюминесценции показано, что тритерпеноиды (I и II) не активны в реакции с пероксильными радикалами. Установлена возможность связывания дипептидом бетулоповой кислоты (II) солей железа в ферри-форме (Fe+2), Выявлена роль различных функциональных групп в обеспечении брутто-ингибирующего действия бетулина (III). Показано, что наибольший вклад вносят первичный С-28 гидроксил (53,9±2,0) %, лупановос ядро за счет пзопропснилыюго заместителя обеспечивает 27% брутто-ингнбирующего действия, вторичный спиртовый С-3-гидроксил - 16,3iO,S %. Суммарное действие всех вышеназванных фрагментов аддитивно.
Впервые установлено и кинетически изучено проявление эффектов антагонизма в совместном ингибирующем действии а-токоферола с дипептидными производными глицирретовоіі и бетулоповой кислот, природными хшюиамн (убихиноном Qio, филлохиноном, токотриенолхиионом). Установлен механизм проявлений неаддитивности в действии смеси а-токоферола и коэнзима
Научно-практическая значимости работы заключается в отборе наиболее эффективных антпоксидантов в ряду производных лупанового ряда. Установлено, что наибольшую антиоксидантную активность проявляют бетулпн и дипептид бетулоповой кислоты. Действие дипептидных производных бетулоповой и глицирретовой кислот на 70% превышает эффективность их родоначальної"! структуры (агликона). Установлено, что дипептидные производные тритерпеноидов, природные хиноны (убихинон QJO, филлохинон, токотриенолхи но и) способны связывать основной лшшдный антиоксидант а-токоферол, существенно снижая его ингибпруюшее действие в смеси с указанными антагонистами. Обнаруженный нами эффект позволяет рассматривать пептиды тритерпеноидов, равно как и хиноны, в качестве средств медикаментозного воздействия на состояние антиоксиданти ой системы опухолевых клеток.
Показаны направления химической модификации структур исследуемых соединений с целью направленного синтеза высокоэффективных антпоксидантов ряда пептидных производных тритерпеноидов.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции «Свободнорадикальные процессы: экологические, фармакологические и клинические аспекты» (г. Санкт-Петербург, 1999 г.); VI Международной конференции «Биоантиоксидант» (г. Москва, 2002 г.); X Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2003 г.); IV Конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (г. Томск, 2003 г.); Международном симпозиуме «Медицина и охрана здоровья» (г. Тюмень, 2000, 2001, 2004 гг.); Межвузовской научной конференции "Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины" (г. Тюмень, 2001, 2002, 2003, 2004 гг.).
Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 15 работах (8 статей и 7 тезисов докладов).
Биологическое действие глицирретовой кислоты
Глицирретовая кислота (ГЛК) относится к тритерпеноидам ї-амиринового ряда и является агликоном глицирризиновой кислоты, которая в виде K-Ca-Mg-соли (глицирризипа) содержится в корнях солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.) и уральской (Gl. uralensis F.) /184,233/. Содержание глицирризипа в корнях солодки колеблется от 2 до 24 % в зависимости от места произрастания и вида солодок /32/. ГЛК впервые была получена Чирхом и Гсдсбергом путем гидролиза глицирризиновой кислоты. Усилиями нескольких групп химиков во главе с Ружичкой, Джераси, Битоном и Спрингом, Кори и Кантролом ГЛК была приписана структура Зр,20р-3-окси-11-оксо-12-олеанен-29-оевой кислоты /112/.
Структура ГЛК подобна кортикостероігдам, поскольку содержит группировку ос,р-ненасыщенного кетона /22,247/. Структурное сходство ГЛК и 11-кетостероидов обусловливает их близкую биологическую активность. У ГЛК и ее производных обнаружена минералкортикоидная активность /245/ и кортикостероидиое действие /22,102,23,73,74/ Подобно гормонам надпочечников ГЛК оказывает влияние на водно-солевой обмен, усиливая задержку Na+, уменьшая содержание К+ в организме. ГЛК снижает объем выделяемой мочи и повышает кровяное давление /176/. Минералкортикоидоподобное действие экстракта солодки объясняется низким сродством к глюкокортпкошшым рецепторам (в 5 раз ниже, чем у дексамстазона) /144/, Минералокортикоидная активность ГЛК проявляется в дозе на 3-4 порядка более высокой, чем для альдостерона /144/ и похожа на синдром избытка минералкортикостероидных гормонов ("псевдоальдостеронизм"). Предполагается, что ГЛК частично потенцирует действие альдостерона, а также частично связывается с мпнералкортикоидными рецепторами почек /185/. О последующем высвобождении этих рецепторов можно судить но постепенной нормализации кровяного давления, повышенный уровень которого сохраняется длительное время после прекращения введения ГЛК. Дезоксикортикостероидное действие ГЛК нейтрализуется при ее введении совместно с аминокислотами. Это чрезвычайно важное свойство позволило блокировать нежелательное действие ГЛК при разработке лекарственных препаратов на ее основе /210/.
При оральном введении ГЛК и глицирризиновая кислота снижают концентрацию тестостерона в тромбозов, вызываемых избытком тестостерона. Отмечено, что ГЛК и ее гликозиды ингибируют метаболизм прогестерона, ГЛК конкурентно связывается с прогестероновыми рецепторами цитозоля матки, что ослабляет се воздействие на сывороточные глобулины, андрогспиыс и эстрогенные рецепторы половых гормонов /243/. Установлена антаэстрогенпая сыворотке крови и являются перспективными средствами для лечения активность ГЛК, которая заключается в ингибировании действия эстрадиола на матку животных и в подавлении (З-глюкуронидазной активности у животных с удаленными яичниками /200/, Вероятно этими свойствами ГЛК обусловлено применение в восточной медицине корня солодки при лечении гинекологических заболеваний.
ГЛК обладает мощным противовоспалительным действием, которое по данным ряда авторов, сравнимо с активностью гидрокортизона /164,180,205,211/. Высокая противовоспалительная активность ГЛК была открыта в 1958г., после чего английская фирма "Байорекс" стала производить лекарственные препараты на основе ГЛК.
ГЛК и ряд ее производных показали антиэкссудативное и нротшюартритное действие, превосходящее эффекты бруфена и гидрокортизона /182/. Производные ГЛК - днгемифталаты как при оральном введении, так и местном применении уменьшают отек уха у мышей, вызванный арахидоновой кислотой /181/. Касаясь механизма противовоспалительного и антиаллергического действия, отмечают, что ГЛК и глицпрризиновая кислота усиливают влияние экзогенных гормонов коры надпочечников, ингибируют окислительное фосфорилирование и биосинтез сульфатированных мукополисахаридов, понижают активность фосфолипазы Аг, повышают активность глутаминтрансаминазы /148,255/, подавляют синтез простагландина Ег активированными макрофагами. Установлено, что ГЛК ингибирует 5-липоксигеназу фермент, участвующий в биосинтезе лейкотриенов, определяющих развитие воспаления и медленно текущей анафилаксии /183/.
Высокая противовоспалительная активность ГЛК сочетается с выраженным противоязвенным действием /72,111,230,241,254/, обусловленным усилением синтеза нуклеиновых кислот в слизистой оболочке желудка /191,241,243/. Аммонийная соль ГЛК ускоряет процесс регенерации тканей при обширных ожогах тела и язве желудка, а 18-дегидроглнцирретовая кислота уменьшает степень изъязвления дуоденальной области желудка, в 4-5 раз и превосходя по защитному эффекту метнлурацил /111/. В работе /101/ отмечают выраженную противоязвенную активность ам иди о го производного 3-ацетилглицнрретовой кислоты, содержащего фрагмент метилового эфира р-аланина.
Известно, что ГЛК и глицирризшювая кислота обладают гепатопротекторным действием, при поражении печени ССЦ /196/, которое сочетается с антиоксидантним эффектом /59,257/. ГЛК оказалась эффективной при лечении хронического гепатита. Она обладает также желчегонной /22/, гиполннидемической /23,102/ и антикоагулянтной активностью, снижает содержание холестерина, (З-липопротеинов и триглицеридов в крови у кроликов с экспериментальным атеросклерозом.
В литературе обсуждается антивирусная активность ГЛК и се гликозида /227/. Показано, что глицирризшювая кислота и се моноаммониевая соль полностью ингибируют in vitro репродукцию ДИК и РНК-содержащих вирусов в концентрациях 0,001-5% /227,228,229/. Особенно привлекательным является сообщение о способности ГЛК и ее производных ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) /186,187,188,221/. Среди веществ, перспективных в качестве анти-ВИЧ-агентов, оказалась динатриевая соль кислого сукцината глицнррстовой кислоты, широко применявшаяся для лечения язвенной болезни /162/. Известно, что в комплексе с альбумином ГЛК инактивируст вирус вазикулярного стоматита /147/, а 3-О-сульфонат ГЛК н его соли показали 100% ингибирующую активность относительно вируса карциномы Rous /251/
Хемилюминесцснтный метод определения ингибирующей активности фенольиых антиоксидантов
Для исследования ингибирующеіі активности хемилюминсцеитным (ХЛ) методом использовали модель инициированного окисления кумола. Для данной модельной системы доказан механизм окисления и определены константы скоростей основных элементарных реакций
Разложение инициатора при повышении температуры происходит с образованием свободных радикалов
Из. совокупности элементарных реакций, определяющих кинетику инициированного окисления, только реакции рекомбинации перокенльных радикалов достаточно экзотермичны для возбуждения свечения в видимой области. При достаточно высокой концентрации кислорода в системе преобладают 1Ю/-радикалы и интенсивность свечения I пропорциональна скорости их рекомбинации: где п - квантовый выход люминесценции
Ингибиторы, взаимодействуя с пероксильными радикалами, снижают их концентрацию, а, следовательно, интенсивность свечения. Экспериментальное измерение этого параметра позволяет количественно оценить концентрацию перокенльных радикалов и их пропорциональную убыль в присутствии антиоксиданта. Это позволяет использовать ХЛ метод для определения количества ингибитора и оценки его относительной антирадикальной активности.
Кинетические кривые, описывающие процесс хемилюминесценции имеют S-образную форму и характеризуются следующими параметрами: минимальной относительной интенсивностью свечения I; периодом индукции т; максимальной скоростью изменения интенсивности свечения (dl/l0/dt)ma4, где I и 10 интенсивность свечения в присутствии антиокснданта и без него соответственно.
Величина константы скорости реакции взаимодействия пероксильных радикалов с ингибитором окисления к7 может быть определена с помощью следующих зависимостей
Константа к7, вычисленная по формуле (2), не зависит от возможного протекания в системе реакции X. Из семейства кинетических кривых ХЛ можно определить стехиометрический коэффициент ингибирования f, т.е. число цепей, гибнущих на одной молекуле антиокснданта. Значение f можно оценить по значению тангенса угла наклона зависимости периодов индукции от концентрации введенного ингибитора, либо по формуле:
Для измерения интенсивности свечения была использована фотометрическая установка, созданная в институте химической физики РАН. Окисление кумола проводили в стеклянной ячейке, расположенной в светонепроницаемой камере фотометрической установки, снабженной фотоумножителем ФЭУ-29. Ячейка имеет термостатируемую рубашку. Через ячейку пропускали очищенный от пыли и наров воды воздух. Исследуемое вещество вводили в окислительную ячейку по ходу реакции с помощью шприцевого устройства. Излучаемый свет фокусируется на фотоумножитель с помощью системы сферических зеркал. Окисление инициировалось АИБН. Скорость зарождения свободных радикалов определялась экспериментально с помощь реперного ингибитора — хромана С\ — и составила 2,3x10"8 Мхе"1. Для усиления свечения использовался люминофор 9,10- ди бром антрацен в концентрации 5x10" М, не оказывающий влияния на кинетику окисления. В ходе эксперимента были получены типичные S-образные кинетические кривые, которые характеризовались следующими кинетическими параметрами: минимальной интенсивностью свечения (Imin), периодом индукции (т,„и) -промежутком времени, в течение которого сохранялось минимальное значение интенсивности свечения. Основной кинетической характеристикой ХЛ кривых является величина тангенса угла наклона касательной, проведенной в точке перегиба, пропорциональная максимальной скорости расходования антиоксиданта [d(Io/iydt]ma4,
Определение критической концентрации мицеллообразования (ККМ) методом Ребиндера
Для приготовления растворов а-токоферола (XII), использовали реактив фирмы «Serva» (США), а-токоферол представляет собой вязкую субстанцию светло-желтого цвета. Вещество хранилась в условиях морозильной камеры, взвешивание производилось после доведения температуры склянки до комнатной (20±2)" С. Далее отбирали некоторое количество вещества с помощью кварцевого капилляра. В предварительно взвешенную специальную кварцевую лодочку наносили реактив концом капилляра, каждый раз определяя массу лодочки с а-токоферолом. Взвешивание производилось на аналитических весах с точностью до 4 знака после запятой, Весы поверялись в Центре метрологии и стандартизации. Взвешивание вещества заканчивалось после того, как навеска соответствовала искомой. Затем реактив количественно смывали малыми порциями через специально изготовленную маленькую воронку, соответствующую по размерам горлу пикнометра и реакционного сосуда. В пикнометре объемом 1-10 см , поверенном в Центре метрологии и стандартизации, доводили до метки объем растворителя с помощью калиброванной пипетки.
Приемы приготовления растворов остальных анализируемых мелкокристаллических соединений не отличались от общепринятых, навески веществ взвешивались на аналитических весах с точностью до 4 знака после занятой, в качестве растворителя использовался хлорбензол, инертный к окислению. Растворы готовились непосредственно перед работой. Для выполнения серии экспериментов, готовили концентрированные основные растворы, из которых путем разбавления готовился рабочий раствор непосредственно перед экспериментом. Основной раствор хранился в холодильнике не более недели. Параллельно с основными экспериментами проводились контрольные опыты с аликіютой рабочего раствора как проба на качество реактивов.
В работе использовали соединения, синтезированные в Новосибирском институте органической химии (НИОХ) им, Н.Н. Ворожцова СО РЛІІ: ДГК (метиловый эфир N -{N-[3-aneTOKCH-l 1-оксо-12-олеанен-29-оил]-9-аминонаноил}-З-амино-3-фенилпропионовой кислоты) (І); ДБК (метиловый эфир N -{N-[3-OKCO-20(29)-лупен-28-оііл]-9-аминонаноил}-3-амино-3-фенидпропионовой кислоты) (II); бетулин (луп-20(29)-ен-3,28-диол) (III); З-ацетоксибетулин (3-ацетокси-луп-20(29)-ен-28-ол) (IV); 28-ацетоксибетулин (28-ацетокси-луп-20(29)-ен-3-ол) (V); 3,28-диацетоксибетулин (3,28-диацетокси-луп-20(29)-сн) (VI); 3-оксобетулин (3-оксо-луп-20(29)-ен-28-ол) (VII); метиловый эфир бетулоновой кислоты (метилового эфира 3-оксо-луп-20(29)-ен-28-оил) (VIII); метиловый эфир бетулииовой кислоты (метилового эфира 3-гидрокси-луп-20(29)-ен-28-оил (IX)); метиловый эфир N -[3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-2-аминоуксусной кислоты (X);
Подлинность исследуемых соединений была доказана методами ИК-спектроскопнии, ТСХ в системе хлороформ : метанол (10:1). Все АО отвечали качеству «хроматографически чистые».
Чистота ингибиторов контролировалась по температуре плавления, определяемой в приборе Тиля. В период проведения экспериментов температура плавления веществ не менялась и соответствовала данным, приводимым в паспорте пробы синтезированного в НИОХ СО РАН вещества.
В работе использовали антиоксидант сс-токоферол (XII) фирмы «Serva» (США). При ТСХ-хроматографии в системе бензол: нетролейпый эфир (95:5) на пластинках «Silufol» выявлялось одно пятно с Rf= 0,79.
Дибунол (XI) фирмы «Serva» (США). В качестве модельных соединений применяли петиды: карнозин (XVI) фирмы «Serva» (США) и глутатион (XVII) фирмы «Reanab (Венгрия); хиноны фирмы «Serva» (США): токотриенолхинон (ХШ), филлохшюн (XIV) и убихинон (XV).
В качестве субстрата окисления использовали метилолеат, синтезированный в ПИОХ СО РАН. Метилолеат дважды очищали путем вакуумной перегонки в токе аргона при 105 С при остаточном давлении 5 мм рт.ст, Свежеперегнанный метилолеат, представляющий собой прозрачную бесцветную маслянистую жидкость, был расфасован по ампулам объемом 10 см3, которые хранились в морозильной камере. Для каждого из опытов вскрывались новые ампулы, таким образом, качество субстрата в период выполнения экспериментов не изменялось. Качество содержимого ампул оценивалось методом газожидкостной хроматографии. Использовали линолевую кислоту фирмы «Serva» США. Содержание основного вещества в ампулах составляло 99%, что соответствовало качеству, заявляемому производителем.
В качестве инициатора использовали азобисизобутиронитрил фирмы «Serva» (США). Очистку АИБН проводили последовательной перекристаллизацией из безводных этанола, ацетона и бензола. В качестве растворителей применяли хлорбензол и четыреххлористый углерод, очищенные методом простой перегонки.
Антиоксидантная активность пептидных производных бстулоновой и глицирретовой кислот в системе окисления, инициированной АИБН
Исходя из представлений о химическом строении, можно было полагать, что соединения, по всей вероятности, не являются классическими ингибиторами, поскольку не содержат фенольных ОН- или ароматических амино-групп. Имеющиеся в литературе единичные сведения об ингибирующей активности тритсрпеноидов /5,56,60,113/, требовали системного количественного изучения их действия, выявления роли различных фрагментов молекулы в процессе окисления.
Ниже приведены результаты тестирования действия тритерпеноидов в условиях АИБН-инициированного окисления, при котором ведущими являются пероксильные радикалы R02".
Изучение антиоксидантной активности (АОА) проводили в широком диапазоне концентраций (1 х 10"5 - lxlO"3) М. На рис.2 приведены кинетические кривые поглощения кислорода при окислении МО в присутствии указанных соединений. Было показано, что при введении в систему индивидуальных дипептидных производных эфиров бетулоновой и глицирретовой кислот (ДГК и ДБК) появляются периоды индукции, превосходящие в 1,5 - 2,2 раза латентный период окисления МО. Таким образом, ДГК и ДБК проявляют ингибирующее действие. Их антиоксидантная активность тестировалась при различных концентрациях, наибольший брутто-ингибирующий эффект наблюдался в узком диапазоне концентраций (2,5 - 8,0)х10 4 М. Результаты показали, что при сравнимых концентрациях (например, 2,5 10"4 М) ДБК на 60% более эффективен, чем ДГК.
На основании полученной брутто-характеристики ингибирования окисления модельного субстрата в присутствии ДБК и ДГК не представлялось возможным установить механизм их действия. Наблюдаемый эффект ингибирования мог быть связан с непосредственным взаимодействием с пероксильными или алкильными, или алкоксильными радикалами. В связи с этим целесообразно было исследовать действие ДБК и ДГК в модельной системе, в которой хорошо изучена природа активных радикалов /117/. Таковой является система инициированного окисления углеводородов (этилбензола или кумола). Эффекты торможения при этом обусловлены высокой эффективностью ЛО в реакции с перокештьньши радикалами (реакция VII, согласно общепринятой схемы /12/).
Антирадикальную активность соединений устанавливали хемилюминесцентным методом в модельной реакции инициированного ЛИБН окисления кумола. Известно, что природа хемилюмииесцснции связана с рекомбинацией перокхильных радикалов с образованием молекулярных продуктов (кетонов), вызывающих в возбужденном состоянии сверхслабое свечение. Хемилюминесценция усиливается в присутствии активаторов свечения (9,10-дибромантрацена) /131/.
Ниже приведены результаты сравнителыюго изучения активности производных ДГК (І), ДБК (II) и фенольных антиоксидаптов в реакции с пероксильными радикалами (реакция VII). На рис. 3 представлены типичные кинетические кривые термохемилюминссценции кумола в присутствии дибуиола (XI) и а-токоферола (XII). Видно, что кривые ХЛ представляют собой S-образную зависимость. После ВВЄДЄЕШЯ ингибитора (InH) происходит тушение свечения до уровня Jmin, на кривых выделяется период индукции, пропорциональный количеству внесенного в систему АО.
Было установлено, что при добавлении в систему ингибиторов фенольной природы: а-токоферола (XII) и дибуиола (XI) - происходит практически полное тушение свечения, постепенно нарастающее после их полного расходования в реакции с R02 . Из серии кинетических кривых окисления субстрата с разной концентрацией антиоксиданта (10"4-10"6) М при экстраполяции зависимости [d(J/J0)/dt -Сло] к оси ординат оценивали значение к7 (см. раздел материалы и методы исследований). Для а-токоферола и дибуиола величина к7 составила 3,3x106 М и 1,4хЮ4М соответственно.
Изучение в тех же условиях активности различных концентраций дипептидных производных бетулоновой и глицирретовой кислот показало, что их введение в систему окисления не вызывает снижения интенсивности хемилюмииесценции и появления периодов индукции. Изучаемые соединения, таким образом, не проявляют антирадикальной активности. Результаты этих экспериментов позволяли заключить, что исследуемые дипептиды не взаимодействуют с пероксильными радикалами (RO2") (реакция VII).
Проявление ДБК и ДГК брутто-ингибирующего действия (см. раздел 2.2.3) показывает, что их активность связана, по всей вероятности, с возможностью присоединения алкильных и алкоксильных радикалов (R и RO ) по карбонильной группе или двойной связи, присутствующих в структуре изучаемых соединений. Известно, что такой же механизм ингибирования окисления характерен для хинонов /45,77,93,95/, антирадикальная активность которых в отношении R(V, как было показано ранее, невелика /75,76/.
