Содержание к диссертации
Введение
ВВЕДЕНИЕ 7
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Глава I. КОНДЕНСИРОВАННЫЕ СОСТОЯНИЯ ДНК II
I. Зависимость структуры растворов полиэлектролитов от концентрации
2. Упорядоченные структуры ДНК в водных растворах . 18
3. Компактные структуры ДНК 24
Глава 2. СОВРЕМЕННЫЕ ТЕОРИИ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ 34
I. Теория-Манинга 34
2. Применение уравнения Пуассона-Больцмана для ,исследования полиэлектролитов 49
Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ . 58
I. Используемые материалы и методики 58
2. Потенциометрическое исследование растворов ДНК 66
3. Спектрофотометрическое изучение растворов ДНК 84
4. Переход спираль-клубок в концентрированных бес ,солевых растворах ДНК. Микрокалориметрические измерения 99
5. Особенности состояния ДНК, иммобилизованной в ,полиакриламидном геле 108
6. Компактные структуры иммобилизованной ДНК . 122
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 134
I. Особенности Ц-ДНК 134
2. Особенности связывания противоионов полиионом ,ДНК в бессолевых растворах 135
3. Зависимость свойств ДНК в экстремальных условиях от тонких различий в исходных образцах 148
4. Анализ материального баланса ионов - метод исследования компактных структур 152
ВЫВОДЫ 155
ЛИТЕРАТУРА 157
ПРИЛОЖЕНИЕ 175
- Зависимость структуры растворов полиэлектролитов от концентрации
- Теория-Манинга
- Используемые материалы и методики
- Особенности Ц-ДНК
Введение к работе
Известно, что ДНК в ядре клетки находится в компактной форме и сконцентрирована в очень ограниченном объеме. Однако лишь в последнее время изучение конденсированных форм ДНК перешло от стадии накопления данных о явлениях, приводящих к образованию компактных структур, к попыткам выяснения их строения /I/. До сих пор неясны детали структуры компактного состояния , нет единого мнения о природе сил, приводящих к "коллапсу" ДНК. Недавно высказано мнение, что решающую роль в поддержании компактной структуры ДНК и упорядоченного расположения полиэлектролитных цепей в растворе играет взаимодействие полиион-противоионы. Показано, что в широком интервале концентраций растворы ДНК структурированы /3/.
Особый интерес представляет изучение бессолевых растворов. Их исследование имеет важное биологическое значение, так как показано, что из-за высокой концентрации в ядре клетки соотношение числа фосфатных групп ДНК и низкомолекулярных катионов в нем такое же, как и в бессолевых растворах ДНК /4/. Концентрированное бессолевое состояние ДНК практически не изучено: основное внимание исследователи уделяли разбавленным растворам ДНК, содержащим избыток низкомолекулярной соли. Между тем, установлено, что образование компактных и "жидкокристаллических" структур ДНК обычно происходит в растворах, содержащих небольшие количества низкомолекулярного электролита.
Разработанные несколько лет назад в лаборатории стабильных изотопов Химического факультета МГУ метод получения ионитов на основе ДНК и методики изучения ее ионообменных свойств позволили детально изучить взаимодействие ДНК с противоионами /5,6/. Особенностями состояния ДНК, иммобилизованной в полиакриламидном геле, являются ко-нформационная заторможенность и высокая концентрация, что позволяет рассматривать его как модель ДНК иг situ,. Другой подход, предложенный в этой же лаборатории, - исследование изоионных растворов Н-ДНК ( растворы ДНК, полученные пропусканием через смешанный слой ионитов). Он позволяет наблюдать образование компактных структур, вызываемое протонированием, при помощи кислотно-основного титрования /7,8/. В связи с недавними сообщениями о том, что взаимодействие ДНК /9/ и РНК /10/ с протоном играет большую роль при компак-тизации .их в головке фага, дальнейшее изучение этого взаимодействия на простых моделях становится весьма актуальным.
Целью настоящей работы является изучение физико-химических свойств концентрированных бессолевых растворов ДНК в широком интервале концентраций и связывания противоионов иммобилизованной ДНК.
Такие исследования являются актуальными не только для молекулярной биологии, но и для развития теорий полиэлектролитов, которые в последнее время наиболее интенсивно разрабатываются именно для бессолевых систем.
В работе впервые определены термодинамические параметры плавления Nar и Ll-ДНК в бессолевых растворах: энтальпия перехода спираль-клубок в этих растворах имеет значения, характерные для натив-ной ДНК ( 15 - 19 кДк/моль) . Показано, что температура плавления (Тпл) ДНК в бессолевом растворе является линейной функцией логарифма концентрации ДНК (CL). Значения d TnjI/d 4)CL совпадают по величине с наклонами зависимости Т от 4) ( ^s " концентрация 1-І зарядного электролита в растворе ДНК при С « Cs ). Это позво- ляет предположить, что природа стабилизации двойной спирали ДНК в солевых и бессолевых растворах во многом одинакова. Полученные данные свидетельствуют о том, что ДНК в бессолевом растворе при температуре ниже 25 и С > 3*10 М нативна. На основе сопоставления па-раметров плавления ДНК в бессолевом и содержащем поддерживающий электролит растворах оценены параметры плотности заряда нативной ("?„) и денатурированной (,а) ДНК. Для Ll-ДНК в растворах LlCE обнаружено уменьшение & при понижении концентрации Ll .
Линейная зависимость Тпл от ^С объяснена с точки зрения теории Манинга. Впервые решение уравнения Пуассона-Больцмана для полиэлектролитов применено для анализа результатов по переходу спираль-клубок в ДНК. В рамках этих теорий проведен анализ особенностей бессолевых растворов полиэлектролитов.
В работе показано, что измерение селективности ДНК, иммобилизованной в ПААГ, к ионам меди является надежным методом определения состояния ее вторичной структуры: константа равновесия ионного обмена в системе Са - Си, **" увеличивается от 1,9 - 2,0 до 7,6 -8,2 при переходе от нативной к денатурированной ДНК.
Показано, что в изоионных растворах и в иммобилизованном состоянии образование компактных структур под действием гистонов или спермина сопровождается вовлечением 40-50$ противоионов ДНК в эти структуры. Компактные структуры иммобилизованной ДНК образуются также под действием НдО+ и Ll . Ионы НдО+ в некоторых случаях связываются иммобилизованной ДНК в сверхэквивалентном соотношении. Перечисленные явления зависят от тонких различий в образцах ДНК и хорошо воспроизводятся для одного и того же образца. Эти различия в образцах особенно сильно проявляются в экстремальных условиях бессолевой и иммобилизованной ДНК, хотя в растворах при Cs» С все эти образцы ( согласно общепринятым критериям) являются одинаково нативными. Исследование связи свойств ДНК в экстремальных условиях с физико-химическими свойствами исходных препаратов нативной ДНК и их биологической активностью представляется перспективным для разработки дополнительных критериев нативности ДНК.
В работе использован комплекс физико-химических методов: потен-циометрия, микрокалориметрия, спектрофотометрия и метод ионного обмена.
Результаты работы могут быть использованы в лабораториях, зани' мающихся изучением ДНК и других полиэлектролитов, а также в спецкурсах по физической химии ДНК и растворов полиэлектролитов. Метод определения емкости ионитов на основе ДНК может быть применен в аналитических целях для анализа содержания иммобилизованных белков и нуклеиновых кислот.
Работа состоит из введения, двух глав литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения.
Л И Т ЕР А Т У РН;Ы Й ОБЗОР.
Зависимость структуры растворов полиэлектролитов от концентрации
Наиболее широко применяемым подходом при изучении ДНК в растворах является исследование ее спектральных свойств. При изучении ДНК по ультрафиолетовым спектрам поглощения, спектрам кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения, светорассеяния концентрация по-лиэлектролита в растворе1 составляет приблизительно 10 - 10 М ( в молях мономерных единиц на литр). При изучении полэлектролитов методами потенциометрии /11,12/, осмометрии /13/, измерения донна-новского равновесия /13/, вискозиметрии /14/, дилатометрии /15/, калориметрии /16,17/ концентрации полимера в растворе составляют
М. Вместе с тем, в посдеднее время для изучения полиэлектролитов ( особенно ДНК) все шире применяются физические методы, требующие высокой концентрации полимера в системе. К таким подходам можно отнести методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР) /18 -20/, малоуглового рассеяния рентгеновских лучей /21/ и нейтронов /2/, микроволновой и ультразвуковой спектроскопии /22/, некоторые методики седиментационного анализа /23,24/, иммобилизации ДНК /5/ и ряд других. Спектральные и многие другие экспериментальные методики изучения ДНК в растворе обладают малой чувствительностью к присутствию низкомолекулярных солей ( за исключением случаев, когда поддерживающий электролит вызывает значительные перестройки в структуре макромолекулы). Соответственно, весьма удобным представляется изучение этого важного природного полиэлектролита в условиях боль - 12 -шого избытка низкомолекулярного электролита, что позволяет создавать "стандартные" ( 0,1 М 1-І зарядного электролита), "физиологические" ( 0,195 М А/а!" рН 7) и другие удобные экспериментальные условия.Важная особенность таких растворов заключается в том, что при С Ср и малых Ср молекулы полиэлектролита полностью экранированы друг от друга низкомолекулярным электролитом. В таких растворах изучаемое свойство легко отнести к "изолированной макромолекуле" или к отдельному ее звену. Возможность во многих случаях пренебречь влиянием концентрации полиэлектролита на изучаемые свойства создала определенный стереотип мышления и иногда приводит к ошибкам в интерпретации результатов. Например, в работе /25/ не учтена концентрация диссоциированных противоионов ДНК, которые вносят вклад в общую ионную силу раствора при сопоставимых концентрациях полиэлектролита и низкомолекулярного электролита. Между тем, экранирование фосфатных групп противоионами обеспечивает сохранение вторичной структуры ДНК в бессолевых растворах /26,27/.
Теория-Манинга
Теоретическая разработка моделей растворов полиэлектролитов характеризуется в настоящее время очень высокой интенсивностью. Помимо практического и научного интереса, резкому увеличению числа публикаций по этой тематике в немалой степени способствует горячая дискуссия вокруг выдвинутой Манингом достаточно простой и последовательной теории полиэлектролитной конденсации /86-88/. В последнее время практически ни один исследователь, изучающий полиэлектролиты , не обходится без сопоставления своих результатов со следствиями из этой теории. В смысле легкости извлечения практически применимых следствий для широкого круга явлений эта модель оставляет позади все другие описания полиэлектролитов /89/. Такая простота интригует и часто вызывает критику со стороны исследователей, считающих описание Манинга излишне схематичным, не отражающим действительную картину /90-92/.
Используемые материалы и методики
Использовали коммерческие препараты ДНК из эритроцитов цыплят фирмы "Reana" (ВНР), а также ДНК из молок осетровых рыб (МОСР), любезно предоставленную В.А.Троновым ( Институт биофизики Минздрава СССР). Молекулярная масса ДНК по измерениям вязкости в 0,1 М NaCi.
Содержание солей в коммерческих препаратах ДНК из эритроцитов цыплят, определенное ионообменным методом /43/, было не более 5% ( г-экв примесей 100 / моль фосфатных групп ДНК); в ДНК из МОСР количество примесей около 10% по весу ( 55% по эквивалентам). При однократном переосаждении ДНК из МОСР из 0,01 М Na.CE этиловым спиртом достигается практически полная очистка от примесей солей.
В дальнейшем для ДНК из эритроцитов цыплят номер заводской партии будет приводиться без специальных оговорок, например, ДНК-28І9.
В работе использовали суммарную фракцию гистоновых белков, любезно предоставленную В.Т.Андриановым ( Институт биоорганической химии АН БССР, Минск) и спермин (N ,N -бис(3-аминопропил)-1,4-ди-аминобутан-4НС1 - CI0H26N 4-4НС1) фирмы "Serua» (Щ1).
Использовали катиониты КУ-2 (СССР) и Дауэкс 2 8 (США) и анионит AB-I7 (СССР), соответствующие ионные формы которых получали по известным методикам /151/.
Все неорганические соли имели классификацию "х.ч." или "о.с.ч.".
Для получения полиакриламидных гелей применяли набор реактивов фирмы "ReajieJ " (ВНР). Потенциометрическое титрование растворов ак-риламида и N ,N -метилен-бисакриламида ( сшивающий агент) показало, что реагенты практически не содержат примесей акриловой кислоты, т.е. в матрицу полиакриламидного геля (ПААГ) с исходивший реактивами ионогенные группы не вносятся.
Дистиллированную воду очищали пропусканием через смешанный слой ионитов непосредственно перед проведением экспериментов. Содержание примесей ионов в такой воде не превышало 10 - 10 М
link4 Особенности Ц-ДНК link4 Характеризуется более сильным ( по сравнению с другими ионами щелочных металлов) связыванием с ДНК. Поэтому в случае LI-ДНК общепринятое значение параметра плотности заряда нативной ДНК, которое рассчитывают из структуры двойной спирали и принимают равным 4,2 , возможно, уменьшено из-за специфического связывания ионов Ы+ с ДНК. Из данных Стигтера следует, что что для Ll-ДНК -„ в 0,05 М LlCC меньше такового для других солей ДНК и составляет приблизительно 2,5 - 3,0 /92/.
Косвенным подтверждением специфического связывания Ll макроионом ДНК является малая чувствительность вторичной структуры Ll-ДНК к протонированию в разбавленных растворах ( рис.3.8), что возможно вызывается тем, что Ы+ конкурирует за те же места связывания в ДНК, что и ион гидроксония /7/. Местами связывания Ll+ в ДНК являются фосфатные группы, и взаимодействие с полиноном увеличено за счет небольшой координации LI с N 7 гуанина, доступного со стороны большого желоба В-формы ДНК. Существует предположение, что N 7 гуанина участвует в переносе иона водорода к N3 цитозина при протонировании GC-пары оснований в двойной спирали ДНК /156/. По-тенциометрическим методом показано, что константа "термодинамического связывания Ll+ с ДНК Kj превышает единицу при всех соотношениях Ll+ и К+ в растворе ( рис.3.2,б и 3.3,6). Микрокалориметрическое изучение бессолевых растворов показало, что Тпл Ll-ДНК при данном С приблизительно на 5 выше Тпл Ца.-ДНК (рис.3.9 и 3.II, таблицы 3.8, 3.9). В растворах Ll-ДНК + LlCE и Ner-ДНК + N&CI эта разница составляет 5-8, уменьшаясь с понижением концентрации под - 135 держивающего электролита.
Обнаруженное свойство ионов Ьс образовывать компактные структуры в иммобилизованной ДНК выделяет его не только в сравнении с ионами щелочных металлов, но и с такими двухзарядными катионами каш Са , Ma + и CLU . Переход ДНК в компактное состояние под действием катиона щелочного металла отмечен впервые. В водных растворах этим свойством обладают катионы с зарядом не ниже трех, в водно-органических средах с низкой О компактизация ДНК может происходить при действии и двухзарядных катионов /1,71/. Полиакриламидный гель, содержащий ДНК, относится к таким средам. Между тем, показано, что двухзарядные катионы не вызывают уменьшения обменной емкости иммобилизованной ДНК. Обнаруженное свойство Ll следует отнести скорее с специфическим свойствам этого катиона, а не к особенностям ДНК, иммобилизованной в ПМГ. По способности к образованию компактных структур ДНК в иммобилизованном состоянии Ll можно сравнить только с таким сильно и специфически связывающимся с ДНК катионом, как ион гидроксония.
