Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 8
1.1. Каталитическая активность ферментов в неводных средах 10
1.2. Влияние содержания воды в системе вода-органический , растворитель на каталитическую активность ферментов 18
1.3. Влияние природы органического растворителя на свойства ферментов 31
1.4. Селективность и специфичность белков в органических средах 40
1.5. Влияние способа приготовления белкового препарата на его свойства 44
1.6: Стабильность ферментов в органических средах 52
Глава 2. Экспериментальная часть 71
2.1. Постановка задачи, выбор объектов исследования 71
2.2. Реактивы и материалы :. 72
2.3. Уф-спектрофотометрический эксперимент 72
2.4. Изучение каталитической активности фермента 74
2.5. Обработка кинетических кривых 78
2.6. Активность воды в органических средах 83
Глава 3. Результаты и обсуждение 84
3.1. Влияние протоноакцепторных органических растворителей на каталитическую активность 84
3.2. Влияние органических растворителей на связывание профлавина 100
3.2.1. Спектры профлавина в воде и органических растворителях ... 100
3.2.2. Связывание профлавина а-химотрипсином в воде 104
3.2.3. Связывание профлавина а-химотрипсином в смесях воды с органическими растворителями 107
3.3. Сопоставление физико-химических параметров протоноакцепторных органических растворителей и воздействия водно-органических смесей на свойства фермента 125
3.4. Влияние спиртов на каталитическую активность химотрипсина 132
3.5. Влияние гидрофобных растворителей на каталитическую активность химотрипсина 141
3.6. Интегральный анализ кинетики ферментативных реакций в случае протекания процессов денатурации/ренатурации 147
Основные результаты и выводы 163
- Влияние содержания воды в системе вода-органический , растворитель на каталитическую активность ферментов
- Влияние способа приготовления белкового препарата на его свойства
- Уф-спектрофотометрический эксперимент
- Спектры профлавина в воде и органических растворителях
Введение к работе
Актуальность работы. Ферментативный катализ в органических средах является одним из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии. На сегодняшний день ферментативный катализ в органических растворителях нашел применение в синтезе лекарственных препаратов, пищевых продуктов, реагентов тонкого химического синтеза. Исследование ферментативного катализа в органических средах позволяет не только оптимизировать многие биотехнологические процессы, но и значительно расширяет наше представление о факторах, определяющих каталитическую активность и стабильность биокатализаторов, предоставляя информацию, которая зачастую недоступна в рамках традиционных «водных» исследований.
Однако анализ литературных данных свидетельствует о том, что, не смотря на значительный практический интерес к ферментативному катализу в органических средах, многие фундаментальные особенности этого явления до настоящего времени не ясны. В частности, не ясны факторы, определяющие каталитическую активность и стабильность ферментов в водно-органических смесях во всем диапазоне составов.
Это предопределило наш интерес к свойствам белков в органических средах и, в частности, влиянию смесей воды с различными органическими растворителями на свойства модельного фермента - бычьего панкреатического а-химотрипсина.
Цель научной работы. Основной целью настоящей работы является установление физико-химических параметров, определяющих влияние водно-органических смесей во всем интервале составов на каталитическую активность бычьего панкреатического а-химотрипсина. Для достижения этого необходимо было решить следующие задачи.
-изучение влияния смесей органических растворителей с водой на каталитическую активность химотрипсина,
-изучение связывания конкурентного ингибитора профлавина химотрипсинам в смесях протоноакцепторных растворителей с водой,
-интегральный анализ кинетических кривых ферментативной реакции.
Научная новизна работы. В ходе работы было впервые исследовано влияние смесей воды с семью протоноакцепторными растворителями и рядом моноатомных алифатических спиртов во всем интервале составов, а также ряда гидрофобных органических растворителей, на каталитическую активность химотрипсина. Впервые разработана методика, позволяющая исследовать связывание конкурентного ингибитора профлавина ,. в низководных органических средах. Связывание профлавина химотрипсином впервые изучено в широком диапазоне активностей воды в смесях воды с семью протоноакцепторными органическими растворителями. Разработаны подходы, позволяющие анализировать воздействие медленных процессов денатурации/ренатурации на протекание ферментативной реакции.
На защиту выносятся следующие положения:
Обнаружено, что смешивающиеся с водой протоноакцепторные растворители можно разделить на две группы по их влиянию на каталитическую активность и связывание конкурентного ингибитора профлавина бычьим панкреатическим а-химотрипсином. В растворителях первой группы (ацетонитрил, ацетон, диоксан и тетрагидрофуран) каталитическая активность подавлена в области активности воды -0.8, а зависимость связывания профлавина от состава водно-органической- смеси имеет максимум в области средних активностей воды (0.5-0.6); в растворителях второй группы (ДМФА, ДМСО, пиридин) положения минимума каталитической активности варьирует, связывание профлавина подавлено, либо (в ДМСО) на зависимости доли связанного профлавина от состава водно-органичской смеси отсутствует максимум в области средних активностей воды.
Деление растворителей на группы согласуется с различием в протоноакцепторной способности растворителя.
В ряду моноатомных алифатических спиртов (метанол, этанол, пропанол-1 и бутанол-1) в области высоких и низких активностей воды наблюдается противоположные зависимости между длиной углеводородного радикала и влиянием спирта на каталитическую активность фермента. В области низких активностей воды наибольшее инактивирующее действие проявляют спирты с небольшим размером радикала (метанол и этанол), а в области высоких активностей спирты с большей длиной радикала (пропанол-1 и бутанол-1). По влиянию на каталитическую активность фермента метанол близок к протоноакцепторным растворителям второй группы, а пропанол-1 и бутанол-1 к растворителям. первой, группы, этанол занимает промежуточное положение.
Установлено, что снижение каталитической активность фермента при его инкубации органических средах не сопровождается значимыми изменениями величин константы Михаэлиса, при этом максимальная скорость ферментативной реакции снижается, что свидетельствует о снижении доли каталитически активной формы фермента. Исключение представляют ароматические органические растворители, такие как толуол и бензол, которые являются конкурентными ингибиторами химотрипсина, они вызывают повышение величин константы Михаэлиса ферментативной реакции в воде.
Предложены модифицированные формы интегрального уравнения Михаэлиса-Ментен, которые позволяют учитывать искажение форм кинетических кривых за счет процессов денатурации/ренатурации. Полученные кинетические уравнения хорошо аппроксимируют экспериментальные кинетические кривые.
Практическая значимость работы состоит в том, что полученные в настоящей работе зависимости каталитической активности
химотрипсина от состава водно-органических смесей позволяют определять оптимальный состав реакционной среды для проведения биокаталитических процессов. Проведенные в настоящей работе исследования являются основой для поиска путей повышения каталитической активности ферментов в органических растворителях. Предложены модифицированные формы интегрального уравнения Михаэлиса-Ментен, которые позволяют учитывать протекание, процессов ренатурации/денатурации фермента в ходе протекания реакции.
Структура работы. Работа изложена на 177 страницах, содержит 17 таблиц, 104 рисунка и 118 библиографических ссылок. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы.
В первой главе рассмотрены литературные данные о свойствах белков в органических средах, а также о влиянии органических растворителей на каталитическую активность ферментов.
Вторая глава содержит описание объектов- исследования и проведённых экспериментов.
Третья глава посвящена обсуждению собственных результатов. В ней описаны зависимости воздействия водно-органических сред на каталитическую активность химотрипсина от их состава. Описаны принципы определения связывания профлавина химотрипсином в смесях воды с органическими растворителями, а также результаты проведенного исследования связывания профлавина. Обсуждается связь между физико-химическими параметрами растворителя и его влиянием на функционирование фермента. Описан подход к анализу кинетических кривых ферментативных реакции при протекании медленных ренатурационных/денатурационных процессов.
Апробация работы и публикации Основные результаты диссертации изложены в 3 статьях, опубликованных в центральных российских изданиях, а также в тезисах 12 докладов на следующих конференциях: Международной конференции.. "BIOCATALYSIS 2002: Fundamentals &
Applications" (Москва, 2002); III-VII Научные конференции молодых
ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ
"Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003-07); XVII
Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Казань, 2003);
Итоговые конференции республиканского конкурса научных работ среди
студентов на соискание премии им. Н.И. Лобачевского (Казань, 2002-03);
Международная конференция студентов и аспирантов по
фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, 2004); IX
Международной конференции «Проблемы сольватации и
комплексообразования в растворах» (Плес, 2004); Итоговая научная конференция КГУ (Казань, 2007)
При соруководстве автора были выполнены курсовые и дипломные работы Кармановой Ю.В. и Комиссаровым И.А.
Работа выполнена на кафедре физической химии Химического института им. A.M. Бутлерова Казанского государственного университета. Исследования проводились при поддержке совместной программы CRDF и Российского Министерства Образования "Фундаментальные исследования и высшее образование" (грант REC-007), а также гранта НИОКР АНТ №03-3.10-131/2003 (Ф).
Настоящая диссертационная работа является продолжением систематических исследований свойств белков в органических средах, проводимых в отделе физической химии Химического института им. А.М'. Бутлерова КГУ, и выполнена под руководством к. х. н., доцента В.А. Сироткина. Автор считает своим долгом, выразить ему, а также заведующему кафедрой физической химии профессору Б.Н. Соломонову, искреннюю благодарность за постоянное внимание к работе и поддержку в процессе проводимых исследований. Автор признателен к.ф.м.н., инж. каф. физической химии Климовицкому А.Е. и с.н.с. ИОФХ им.А.Е. Арбузова Захарычеву Д.В.
Влияние содержания воды в системе вода-органический , растворитель на каталитическую активность ферментов
Выше было отмечено, что остаточное содержание воды на молекуле фермента оказывает большое влияние на его каталитическую активность. Систематическое изучение зависимости каталитической активности фермента от содержания на нем воды проведено в работе [17] (рис. 4). Обнаружено, что при помещении препарата фермента с некоторой исходной влажностью в органический растворитель происходит перераспределение воды в системе, в результате чего устанавливается равновесие между содержанием воды на ферменте и в органическом растворителе. Зависимости каталитической активности фермента от влажности органического растворителя существенно отличаются в разных растворителях, в то время как те же данные унифицируются, если независимой переменной представлено содержание воды на белке.
Наличие пороговой гидратации обычно связывают с необходимостью достижения ферментом определенной степени структурной подвижности, для проявления которой достаточная влажность препарата имеет определяющее значение. В работе [18] поведение гидратной оболочки фермента в органических средах моделировалось с помощью квантово-химических расчетов. Было показано, что структура молекулы фермента не претерпевает значительных изменений при внесении в органический растворитель, в то время как наблюдается десорбция воды с поверхности белковой молекулы в органический растворитель. Для многих изученных растворителей такая зависимость имеет сходный трехэтапный вид. Как видно из рис.5, наибольшую каталитическую активность фермент проявляет в чистой воде; по мере увеличения содержания органического растворителя в системе фермент теряет активность. Однако в области высоких содержаний органического растворителя каталитическая активность вновь восстанавливается. Похожие по форме зависимости наблюдаются в смеси вода-этанол (рис.6). 40 60 80 100
Соотношение между содержанием воды в органическом растворителе и влажностью белковой макромолекулы определяется изотермой сорбцией воды на белке для данной водно-органической смеси. В работах [21,22] было показано, что изотермы сорбции из водно-органической смеси имеют вид, близкий к изотермам сорбции воды из газовой фазы, по крайней мере, до активности воды 0.5.
В связи с этим, рядом авторов было предложено выражать содержание воды в системе.v вода — органический растворитель в координатах термодинамической активности воды. Смысл этого предложения заключается в том, что термодинамическая активность компонентов системы, находящейся в равновесии, во всех фазах одинакова. Таким образом, в двух разных органических растворителях, при одной активности воды в системе, активность воды в фазе биокатализатора будет также одинаковой, несмотря на то, что содержание воды в растворителях может быть различным. Если каталитическая активность фермента определяется преимущественно термодинамическим состоянием воды, то в разных растворителях при одной и той же термодинамической активности воды каталитическая активность должна быть одинаковой.
Действительно, в ряде случаев, наблюдается унификация каталитической активность фермента в разных растворителях в координатах активности воды. Так, в работе [23] обнаружено, что каталитическая активность липазы из плесени в ряде органических растворителей максимальна при активности воды 0.55, в то время как в координатах молярной концентрации воды положение максимума активности значительно различается .
Каталитическая активность липозима в зависимости от А) активности воды aw; Б) молярной концентрации воды в органической фазе. Растворители: гексан (А), толуол (х), трихлорэтилен (о), диизопропиловый эфир (), пентанон-3 (0), смесь додекановой кислоты и додеканола 1:1 (+), [23]. Следует отметить, что в большинстве органических растворителей активность воды зависит от концентрации воды существенно нелинейно. Поэтому, например, представление результатов работы [19] в координатах активности воды показывает, что полученные данные охватывают лишь достаточно узкий интервал составов водно-органической смеси .
По-видимому, наблюдающиеся различия в пороговых активностях можно связать с тем, что взаимодействие фермент — органический растворитель по-разному проявляется в различных растворителях. Тем не менее, применение координат термодинамической активности воды в системах белок - вода - органический растворитель, безусловно, обосновано.
Показанные выше примеры свидетельствуют о значительном влиянии содержания воды в системе на свойства ферментов. Для установления факторов, определяющих воздействие воды на свойства ферментов на молекулярном уровне, были привлечены данные различных физико-химических методов исследования. Эти данные можно описывают два аспекта состояния белковой макромолекулы - данные о молекулярной подвижности и данные о структуре ферментов.
Подвижность субтилизина Карлсберга была изучена с помощью спиновых меток в работе [25]. Было установлено, что с ростом содержания воды в системе вода-ТГФ подвижность молекулы фермента повышается, а так же возрастает полярность активного центра фермента. Рост подвижности макромолекулы согласуется с наблюдающимся увеличением каталитической активности фермента до концентрации воды в системе 1% об. При дальнейшем увеличении содержания воды каталитическая активность начинает падать; в то время как подвижность макромолекулы фермента и полярность активного центра выходят на постоянный уровень.
В работе [26] подвижность молекулы субтилизина Карсберга исследована с применением метода твердофазной ЯМР-релаксации. По данным этого метода, в составе белковой макромолекулы можно выделить два вида протонов - протоны с высокой и низкой подвижностью. По мере увеличения активности воды в системе увеличивалась доля протонов с высокой подвижностью, кроме того, времена релаксации обоих типов протонов уменьшались, что свидетельствует о росте подвижности макромолекулы (рис. 13).
Сопоставление параметров подвижности молекулы фермента были с его каталитической активностью [26], позволило обнаружить корреляцию между долей протонов с высокой подвижностью и каталитической активностью. Аналогичные данные были получены для другого-фермента — а-химотрипсина, однако изменения в параметрах подвижности были менее выражены и происходили при более высоких активностях, чем в случае субтилизина.
Влияние способа приготовления белкового препарата на его свойства
Особым, нехарактерным для водных растворов, качеством белков в органических растворителях является зависимость их свойств от предыстории препарата.
Первоначально внимание исследователей было привлечено зависимостью каталитической активности ферментов от рН водного раствора, из которого препарат фермента был лиофилизирован. Например, липазы [4], химотрипсин и субтилизин Карлсберга [5] демонстрируют колоколообразную зависимость каталитической активности в органическом растворителе от рН исходного раствора . Зависимость каталитической активности липазы из поджелудочной железы свиньи от рН водного раствора, из которого фермент был лиофилизирован. Кривые: а) гидролиз трибутирина в воде (100% соответствует скорости реакции 1,4 ммоль/час-мг фермента), Ь) переэтерификация между трибутирином и гептанолом (2 моль/л гептанола в трибутирине, содержание воды 0,02%; 100% соответствует скорости реакции 5,6 ц.моль/час-мг фермента), [4].
С другой стороны, авторы работы [60] установили, что при использовании в качестве буферов летучих соединений (например, HCOONH4), которые могут быть удалены в процессе лиофилизации, эффект «рН-памяти» не наблюдается.
Более фундаментальным является, по-видимому, зависимость ферментативной активности ферментов от порядка смешения реагентов и пути увлажнения. Так, авторами работы [61] проведено исследование каталитической активности фермента от способа увлажнения .
Схема эксперимента по оценке влияния способа приготовления реакционной системы на каталитическую активность фермента. А - лиофилизированный фермент, В - раствор фермента в воде, С - суспензия фермента в органическом растворителе, [61].
Использованная методика заключается в следующем [61]. В первом случае препарат фермента помещали в однопроцентную смесь воды с органическим растворителем, во втором случае водный раствор фермента разбавляли сухим органическим растворителем до достижения 1% объемного содержания воды. Конечный состав смеси в обоих случаях был одинаков. Затем была изучена каталитическая активность препаратов фермента полученных обоими способами. Как видно из табл. 9 практически во всех растворителях фермент более активен, если система приготовлена способом №2, причем наибольшая разница наблюдается в самых гидрофобных растворителях, однако произвести однозначную классификацию растворителей на основании полученных данных не удалось. Таблица 7 Влияние способа увлажнения фермента на его каталитическую активность (реакция пропанолиза этилового эфира Т-ацетил-(Ь,В)-фенилаланина), [61].
Авторы работы объясняют наблюдаемое явление тем, что белок в органических растворителях находится в кинетически заторможенном состоянии. Полученный по первому пути препарат изначально находится в обратимо денатурированном состоянии (за счет лиофилизации) [40], и помещение его в низководную органическую смесь приводит к частичному восстановлению нативной структуры. Однако значительная жесткость препарата в органическом растворителе не позволяет восстановить нативную структуру до уровня препарата, полученного способом №2 (путем разбавлением водного раствора фермента, изначально находившегося в нативном состоянии).
За счет высокой жесткости, молекул белков в неводном окружении появляется возможность «создавать» специфические сорбаты путем процесса биоимпринтинга. Схема процедуры биоимпринтинга модельного белка бычьего сывороточного альбумина (БСА) яблочной кислотой приведена на рис. 20 [62]. БСА и яблочную кислоту растворяют в воде и лиофилизируют. Полученный комплекс промывают тетрагидрофураном для удаления яблочной кислоты. Белок, подвергнутый биоимпринтингу, в безводном этилацетате демонстрирует значительное увеличение степени связывания по сравнению с исходным препаратом. Эта способность наблюдается только в неводных растворителях и отсутствует в воде.
Предполагается, что после проведения процедуры биоимпринтинга на белке образуются «отпечатки» молекулы лиганда. Безводные органические растворители практически не изменяют жесткость белка, поэтому в органических растворителях «отпечатки» сохраняются, и белок приобретает способность высокоселективно связывать целевой лиганд. В воде белковая макромолекула становится гибкой, и отпечатки пропадают.
Похожий подход применен в работе [63]. Показано, что лиофилизация субтилизина Карлсберга из водного раствора, содержащего конкурентные ингибиторы (с последующим их удалением), приводит к значительному повышению каталитической активности фермента в безводном октане (табл.8). Авторы объясняют это тем, что при связывании ингибитора фермент принимает конфигурацию, которая благоприятствует каталитическому процессу и сохраняется в процессе лиофилизации.
Схожая методика, примененная в работе [64], позволила получить препарат фермента, катализирующий этерификацию D-изомеров аминокислот в низководных органических средах. Специфичность по отношению к D-форме аминокислот по мере увеличения содержания воды в системе падает, что дополнительно свидетельствует в пользу того, что наблюдающиеся свойства ферментов являются результатом их структурной жесткости. Аналогичные результаты получены в работе [65], где в качестве добавок при лиофилизации применялись различные нуклеозидные соединения, что позволило добиться селективности фермента по отношению к нуклеозидным субстратам.
Круг соединений применяемых для биоимпринтинга может быть расширен за счет водонерастворимых веществ [66]. Для этого необходимо использовать производные целевых веществ с повышенной растворимостью в воде; либо проводить лиофилизацию препарата фермента из водно-органической смеси, в которой целевые соединения растворяются.
Ферменты нерастворимы в низководном окружении, и поэтому могут считаться гетерогенными катализаторами. Широко известно, что на каталитическую активность гетерогенных катализаторов большое влияние оказывают добавки. То же самое наблюдается и в случае ферментов в неводных средах.
Так, в работе [67] показано, что добавка КС1 на стадии лиофилизации значительно повышает каталитическую активность субтилизина и химотрипсина. Добавки соли в реакционную смесь с ферментом, лиофилизированным в отсутствие соли, активации не вызывают. Наибольший эффект (увеличение кса1/Км в. 3750 раз для реакции переэтерификации этилового эфира г Г-ацетил-Ь-фенилаланина в гексане, катализируемой субтилизином) наблюдается при содержании соли примерно 95% г/г. Активирующий эффект проявляют и другие соли калия. Кинетические данные показывают, что действие соли проявляется в увеличении кСйЬ и не зависит от буферных свойств соли.
Авторами работы. [68] на.основе анализа данных ЯМР-релаксации установлено, что в присутствии солей значительно повышается подвижность остаточных молекул воды, что в свою очередь может повышать гибкость структуры фермента, облегчая образование переходного состояния в ходе каталитического процесса. Активность препаратов ферментов удается увеличить также их лиофилизацией вместе с различными органическими соединениями и ионными жидкостями. Например, в работе [69] проанализировано влияние добавки циклодекстринов на стадии лиофилизации на активность и стабильность химотрипсина в водно-ацетонитрильной (93% об. ацетонитрила) смеси. Установлено, что добавки циклодекстринов значительно повышают активность и стабильность химотрипсина в этих условиях, не оказывая влияния на соотношение скоростей конкурирующих реакций гидролиза и переэтерификации. Наибольшим активирующим и стабилизирующим эффектом обладает изо-пропил-р-циклодекстрин. Авторы предполагают, что добавки циклодекстрина предотвращают агрегацию фермента и способствуют образованию частиц катализатора небольшого размера, повышая количество доступных активных центров аналогично эффекту подложки у гетерогенных катализаторов.
Уф-спектрофотометрический эксперимент
В работе были использованы органические растворители марки «хч». Для приготовления титранта был использован КОН марки «ч». В качестве стандартного раствора для определения концентрации титранта применяли стандарт-титр НС1. Применяли бидистиллированную деионизированную воду
Классическими конкурентными ингибиторами химотрипсина являются ароматические органические соединения: бензол, толуол, фенол, пиридин, индол, Р-нафтиламин, а-нафтол, акридин. Одним из подробно изученных конкурентных ингибиторов химотрипсина является профлавин (3,6-диаминоакридин):
Для изучения связывания профлавина ферментом нами был выбран УФ-спектрофотометрический метод. Краситель профлавин является очень удобным объектом для такого исследования, поскольку полоса поглощения профлавина (1 =444 нм) лежит в области, где практически отсутствует поглощение большинства белков и многих органических растворителей. Связывание профлавина с ферментом а-химотрипсином происходит весьма эффективно (Кс 22000-30000 л/моль), по этому параметру профлавин сравним со специфическими субстратами фермента. В сочетании с высоким коэффициентом экстинкции, это позволяет работать с малыми добавками ингибитора, что позволяет пренебречь его влиянием на свойства среды.
Связывание профлавина химотрипсином хорошо изучено в воде и в области малых добавок органических растворителей, однако практически не изучено в низководных органических средах, представляющих на сегодняшний день большой интерес.
В настоящей работе нами изучено влияние ацетонитрила, ацетона, диоксана, тетрагидрофурана, пиридина, ДМФА и ДМСО на связывание химотрипсином профлавина в широком интервале составов водно-органической смеси.
Исследование связывания было проведено в области рН-оптимума а-химотрипсина (рН 8). Для поддержания этого состояния в работе был использован трис-НС1 буфер, широко применяющийся в биохимических исследованиях. УФ-спектрофотометрические измерения были выполнены на спектрофотометрах "Perkin-Elmer" Lambda 35 и "Hitachi". Измерения проводили при следующих условиях: температура эксперимента 25С; 0,01М трис-НС1 буфер рН 8 0; концентрация органического- растворителя 0 - 99,5 %(об.). Исходная концентрация профлавина - 1-Ю"5 моль/л, фермента—2-Ю 4 моль/л (в воде концентрация фермента варьировалась от 6,67-10"6 до 2-Ю"4 моль/л), использовались оптические кюветы с 1=1 см. І При изучении связывания а-химотрипсином профлавина в воде растворы готовили прибавлением к аликвоте 1-Ю"5 моль/л раствора профлавина в 0,01 моль/л трис-НС1 буфере навески препарата фермента.
В тех водно-органических смесях, где фермент не растворяется, к водно-органической смеси прибавляли навеску фермента, обеспечивающую массовое содержание фермента 5 мг/мл, что соответствует концентрации 2-Ю"4 моль/л. Аналогичным образом, к раствору прибавляли навеску трис-HCl буфера, достаточную для достижения концентрации 0,04 моль/л и рН 8,0 в воде. Для достижения равновесия между «связанным» и «свободным» профлавином приготовленные суспензии :п.фермента в растворе профлавина выдерживали в течение 1 ч. Готовые растворы профлавина хранились в темноте при комнатной температуре, при хранении в течение месяца не было обнаружено значимого изменения спектров красителя. При необходимости осуществляли приведение спектров к базовой линии. Методика эксперимента описана в следующих работах [101, 102, 103].
Для изучения реакции гидролиза АТЕЕ, катализируемой а-химотрипсином, был выбран метод потенциометрического титрования в рН-статическом режиме. Титрование в рН-статическом режиме позволяет изучать ферментативные реакции без добавления буферных солей, что является несомненным преимуществом, поскольку позволяет исключить из рассмотрения один из влияющих на свойства фермента факторов.
Измерения проводили при следующих условиях: температура эксперимента 25С; концентрация органических растворителей варьировалась в интервале от 0 до 100 %(об.); исходная концентрация этилового эфира N-ацетил-Ь-тирозина - 4 10"3 М, фермента - 2 10"7 М. Все измерения были выполнены на потенциометрическом титраторе «Hiranuma Comtite-101» .
Схема экспериментальной установки. 1-титратор «Hiranuma Comtite-101», 2-компьютер, 3-насос, 4-электроды, 5-эл-хим. ячейка, 6-термостат. В качестве титранта использовался раствор гидроксида калия, концентрация которого оценивалась по соляной кислоте (Снсі = 0.1 М), выбранной в качестве первичного стандарта. При оценке концентрации титранта погрешность измерения не превышала 1.5%.
Реакционную смесь готовили следующим образом. Препарат фермента помещали в водно-органическую смесь требуемого состава и инкубировали в течение одного часа при 25С; содержание фермента в водно-органической смеси составляло 1мг/мл. Затем, при постоянном перемешивании, отбирали аликвоту водно-органической смеси, содержащей фермент (V=100 мкл), которую использовали для инициирования гидролитической реакции.
Электрохимическая ячейка содержит три электрода — хлоридсеребряный, стеклянный и температурный датчик. Стеклянный электрод был откалиброван по фосфатному буферу с величиной рН 6.87 при 25С и по раствору тетраборнокислого натрия с рН 9.18 при 25С.
Кинетическая кривая представляет собой зависимость объёма титранта, пошедшего на титрование выделяющейся кислоты, от времени. Для регистрации кинетических кривых прибор был сопряжен с компьютером, для чего автором настоящей работы, вместе с инженером кафедры физической химии Климовицким А.Е., была написана компьютерная программа.
Спектры профлавина в воде и органических растворителях
Для-подтверждения полученного деления смешивающихся с водой протоноакцепторных растворителей на две группы по их воздействию на свойства фермента, нами было проведено исследование связывания конкурентного ингибитора профлавина в органических средах. Связывание конкурентного ингибитора может нести ценную информацию об особенностях образования фермент-субстратного комплекса. Изучение этого процесса в органических средах осуществить проще, чем исследовать модельную гидролитическую реакцию [28-29]. В месте с тем, в литературе подобные данные практически отсутствуют. Исключение составляют работы [5, 30], однако в работе [5] изучение связывания проведено лишь в одном органическом растворите и воде для двух ингибиторов, а в работе [30] изучены смеси воды с ДМСО с содержанием ДМСО не выше 60% об.
Для получения количественных данных о связывании профлавина химотрипсином в различном окружении нами было исследовано влияние среды на УФ-спектры профлавина. Молекула профлавина содержит три протоноакцепторные группы (гетероциклический азот в акридиновом кольце и две. аминогруппы)и:и,., следовательно, краситель способен участвовать в протолитических равновесиях. При изменении рН раствора (рис. 50) в спектре профлавина наблюдается перераспределение между двумя полосами.
Длинноволновая полоса поглощения профлавина в воде имеет максимум при 444 нм и коэффициент экстинкции є = 32000 л/моль-см (рН 8.0). Коротковолновая полоса (А-—390 нм), появляющаяся при высоких рН (выше 8.4), была отождествлена с депротонированной формой красителя.
Долю протонированной формы профлавина (при постоянной суммарной концентрации профлавина) можно определить из отношения оптической плотности в максимуме поглощения этой формы (444 нм) к оптической плотности в максимуме полосы при низких рН, когда профлавин в растворе полностью протонирован. На основании зависимости доли протонированной формы профлавина от рН (рис.51) нами была определена рКА профлавина, равная 8.4 при 25С.
Спектры профлавина в водно-органических смесях были получены при фиксированном содержании буфера, соответствующем рН 8.0 в воде. С ростом содержания в смеси органического компонента наблюдается рост коэффициента экстинкции и смещение в область больших длин волн полосы протонированной формы профлавина. Изучавшиеся в работе протоноакцепторные растворители способны смещать равновесие между формами профлавина, вызывая увеличение доли депротонированной формы красителя .
Определение Кс по методике, аналогичной используемой в водных растворах, невозможно в смесях воды с органическими растворителями. Данные из литературы [44] свидетельствуют о значительном снижении величин Кс уже при небольших концентрациях органических растворителей. Поэтому определение Кс по методике, описанной выше, потребует использования очень высоких концентраций фермента (оценочно на Г-2 порядка больше) что представляется нецелесообразным. Кроме того, при увеличении содержания, органических растворителей снижается растворимость фермента [44], что делает невозможным достижение необходимых для связывания ингибитора концентраций фермента в растворе.
Для определения влияния состава водно-органических смесей на способность фермента связывать профлавин мы определяли долю профлавина, связанного в комплекс (отношение концентрации профлавина, связанного в комплекс, к общей концентрации профлавина. в системе), при фиксированных концентрациях фермента и профлавина в системе. При известных концентрациях профлавина и фермента и стехиометрии связывания величина Кс, в принципе, может быть вычислена по доле связанного профлавина.
В изученных водно-органических смесях при активностях воды менее 0,9 а-химотрипсин практически нерастворим; при этом связывание профлавина суспензией фермента приводит к уменьшению концентрации красителя в растворе. Концентрацию-профлавина, связанного в комплекс, в этом случае можно определить непосредственно по убыли содержания красителя в растворе. Отношение величины минимума в разностном спектре (Мшп) к величине максимума в спектре исходного раствора (Атах) соответствует доле связанного ,ч профлавина (ггт%) при данной концентрации белка. Как видно из рисунка 57, возмущение спектров профлавина белком в области высоких и низких активностей отсутствует, из чего можно сделать вывод, что в таких смесях фермент не связывает профлавин. Наличие минимума в спектре при средних активностях воды свидетельствует о связывании профлавина ферментом.
