Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Физико-химические предпосылки количественного описания гидролиза полипептидов и гидрофобные эффекты 13
1.1.1. Особенности протеолиза как процесса превращения пептидного полимерного субстрата и возможности его описания методами химической кинетики 13
1.1.2. Р-Казеин как субстрат протеолиза 31
1.1.3. Свойства пептидов, полученных ферментативным гидролизом 36
1.2.1. Основные подходы к описанию гидрофобных явлений 43
1.2.2. Экспериментальные методы определения гидратации 50
1.2.3. Гидратация белков, гидрофобный коллапс пептидов 63
ГЛАВА II. Кинетика ферментативного гидролиза полипептидных субстратов 76
2.1. Гидролиз р-казеина трипсином 76
2.2. Суммарная кинетика гидролиза химотрипсином 93
2.3. Кинетика деградации исходной полипептидной цепи 105
2.4. Гидролиз пептидов в реакторе открытого типа 112
ГЛАВА III. Компьютерное моделирование протеолиза 125
3.1. Компьютерное моделирование гидролиза пептидных цепей -программа Proteolysis 125
3.2. Компьютерное моделирование гидролиза пепсином 131
3.3. Компьютерное моделирование кинетики гидролиза трипсином и химотрипсином 143
ГЛАВА IV. Изучение гидратации в различных аминокислотно-пептидно-белковых системах 158
4.1. Шкалы гидрофобности аминокислот. Сравнение методов миллиметровой спектроскопии и дифференциальной сканирующей калориметрии 158
4.2. Оценка ассоциации по изменению гидратации 180
4.3. Гидратация белков, изменение гидратации при ферментативном гидролизе 185
4.4. Реология и гидратация гелей, образованных агрегатами казеиновых мицелл 191
4.5. Гидратация белковоподобных синтетических полимеров 210
ГЛАВА V. Методы исследования 221
5.1. Гидролиз полипептидов и анализ продуктов гидролиза 221
5.2. Измерение параметров гидратации 227
5.3. Программа Proteolysis 234
Заключение 237
Выводы 241
Литература
- Р-Казеин как субстрат протеолиза
- Кинетика деградации исходной полипептидной цепи
- Компьютерное моделирование гидролиза пепсином
- Гидратация белков, изменение гидратации при ферментативном гидролизе
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время методы физической химии все шире применяются к комплексным объектам природного происхождения и сложным биохимическим процессам. Один из таких процессов - ферментативный гидролиз полимерных цепей полипептидов и белков (протеолиз) лежит в основе ряда биологических явлений, проявляющихся в широком диапазоне степени гидролиза пептидных связей от ограниченного протеолиза при активации ферментов до глубокого гидролиза при пищеварении. Протеолизу принадлежит важная роль в процессах модификации пищевых белков и производстве белковых гидролизатов в пищевой промышленности. Получение биологически-активных пептидов протеолизом из неактивных белковых предшественников является перспективным методом получения биопептидов. Создание общей физико-химической модели протеолиза, включающей кинетическое описание процессов межцепочечных взаимодействий, приводящих к маскированию/демаскированию пептидных связей, и количественному выражению фермент-субстратного узнавания (специфичности) в отношении полимерного субстрата, является, таким образом, важнейшей задачей.
Гидрофобные явления играют ключевую роль в живой природе и в модельных полимерных водных системах, определяя гидрофобный коллапс полипептидных цепей в белках и переходы клубок-глобула в синтетических белковоподобных полимерах. Актуальной задачей является разработка методов анализа многокомпонентных водных смесей пептидов – в первую очередь с точки зрения количественного выражения гидрофобности пептидов и их склонности к гидрофобным взаимодействиям. Представляется перспективным определять параметры гидрофобности по упорядочению воды в гидратных оболочках неполярных групп, определяемому по поглощению электромагнитного излучения в миллиметровой части спектра.
Описание кинетики превращений смесей пептидных фрагментов требует компьютерного моделирования, которое должно учесть весь объем информации и представить результаты в форме, удобной для экспериментальной проверки. Понимание физико-химических закономерностей сложных процессов, таких как протеолиз, невозможно без создания компьютерных программ и комплексного экспериментального и теоретического подхода.
Все это делает исследование кинетики гидролиза полипептидов, компьютерное моделирование протеолиза и количественное изучение гидратации весьма актуальным.
Целью работы является изучение физико-химических закономерностей ферментативного гидролиза полимерных субстратов на примере протеолитических реакций, а также изучение гидратационных эффектов в водных аминокислотно-пептидных растворах и коллоидных системах.
В рамках этого в диссертации решались следующие задачи:
1. Разработать аналитические методы и подходы, позволяющие определять константы скорости гидролиза пептидных субстратов протеолитическими ферментами в кинетических экспериментах, анализирующих как суммарную кинетику гидролиза пептидных связей, так и индивидуальную кинетику изменения концентраций пептидов по данным разделительных методов (обращеннофазная ЖХВД, количественный электрофорез, аминокислотный анализ).
2. Разработать пакет компьютерных программ, позволяющих предсказывать кинетику протеолиза для пептидных цепей, имеющих произвольную аминокислотную последовательность, с базой данных кинетических параметров для ряда протеолитических ферментов.
3. Разработать количественный метод определения гидратации методом миллиметровой (микроволновой) спектроскопии, позволяющий изучать состояние воды в гидратных оболочках пептидов в различных водных системах и процессах, включая водные растворы глобулярных белков, протеолиз, взаимодействие полипептидов с казеиновыми мицеллами. Показать перспективность количественного изучения гидратации для определения шкал гидрофобности аминокислот, оценки стабильности полипептидных мицелл, оценки конформаций синтетических белковоподобных сополимеров.
Научная новизна работы заключается в следующем:
1. Впервые предложена общая физико-химическая модель протеолиза, позволяющая анализировать кинетику во всем диапазоне изменения степени гидролиза пептидных связей с помощью одних и тех же уравнений. Показано, что кинетика протеолиза в общем случае соответствует двухстадийной схеме, где первая кинетически значимая стадия представляет демаскирование пептидных связей, а вторая - гидролиз.
2. С использованием ЖХВД на обращенной фазе получены экспериментальные данные по константам скоростей гидролиза различных пептидных связей b-казеина трипсином дикого типа и мутированными формами трипсина.
3. Впервые предложен механизм демаскирования гидрофобного С-концевого участка при гидролизе b-казеина трипсином дикого типа и мутированными трипсинами.
4. Изучена суммарная кинетика гидролиза химотрипсином пептидных связей по поглощению N-тринитрофенильных производных образующихся аминогрупп. Впервые показано, что немонотонные участки нарастания аминного азота в ходе гидролиза связаны с маскированностью пептидных связей.
5. Изучена кинетика гидролиза панкреатином пептидов в реакторе открытого типа с удалением низкомолекулярных продуктов гидролиза. Экспериментально определены константы скорости выхода отдельных аминокислотных остатков в составе низкомолекулярных фракций.
6. Показано, что кинетика убывания исходной полипептидной цепи соответствует кинетике 1-го порядка. Получена оценка для отношения констант демаскирования и гидролиза глобулярных белков молока.
7. Впервые создана компьютерная программа PROTEOLYSIS, осуществляющая численное интегрирование дифференциальных уравнений, которые описывают демаскирование и гидролиз пептидных связей. Программа позволяет удовлетворительно предсказывать кинетику протеолиза с различными параметрами специфичности и маскированности, а также состав продуктов протеолиза (состав гидролизатов), полученных при различных кинетических условиях.
8. Разработан метод определения параметров гидратации с использованием миллиметровой (микроволновой) спектроскопии. Метод имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации, что впервые позволило использовать его для построения шкалы гидрофобности аминокислот и оценки количества неполярных групп, участвующих в гидрофобной гидратации или исключенных за счет гидрофобного взаимодействия. Метод позволяет определять кинетику развертывания белковой глобулы в ходе протеолиза.
9. Миллиметровая спектроскопия наряду с реологическими методами позволяет контролировать взаимодействие пептидов с казеиновыми мицеллами, в частности определять концентрации пептидов, при которых имеет место увеличение стабильности мицелл.
10. С помощью миллиметровой спектроскопии впервые показано, что гидрофобная модификация синтетических полимеров, не являющихся термочувствительными, приводит к меньшему изменению гидратации по сравнению с переходом клубок глобула в термочувствительных полимерах.
Практическая значимость.
Кинетические параметры представлены в работе для таких практически важных протеаз как трипсин, химотрипсин, и пепсин при протеолизе белковых субстратов, выделенных из молока. Представленная общая методология анализа кинетики протеолиза дает возможность применить наработанные методы к другим белковым субстратам и протеазам, представляющим практический интерес. В работе рассмотрено применение модельных представлений для анализа кинетики образования низкомолекулярных продуктов протеолиза в реакторе открытого типа, моделирующего in vitro панкреатическую стадию пищеварения. Эта часть работы имеет практическое значение для количественных оценок пищевой ценности белков.
Детальное изложение принципов построения программы PROTEOLYSIS может быть полезным при разработке других компьютерных программ, моделирующих сложные биохимические процессы. Применение компьютерного моделирования протеолиза может быть использовано для предсказания оптимальных кинетических условий получения белковых гидролизатов.
Использование метода количественного определения гидратации с помощью миллиметровой спектроскопии открывает новые аналитические возможности при исследовании различных амфифильных систем (белковых и полимерных). Количественные измерения гидратации позволяют контролировать гидролиз пищевых белков и образование казеиновых гелей, что может быть использовано в пищевой промышленности.
Защищаемые положения.
1. Расщепление пептидных связей в полипептидах происходит в две стадии: на первой осуществляется физический процесс конформационной перестройки пептидной цепи (демаскирование); на второй происходит собственно химический процесс – гидролиз пептидных связей.
2. Стадия демаскрования дает немонотонные участки увеличения аминного азота в ходе гидролиза и обеспечивает наличие кинетики накопления некоторых пептидов с лагом.
3. Отношение констант скоростей демаскирования и гидролиза является важным параметром при количественном описании протеолиза.
4. Компьютерное моделирование протеолиза дает возможность предсказывать состав (главные компоненты) гидролизатов для различных гипотетических механизмов протеолиза.
5. Количество связанной воды растет с увеличением доступной для воды поверхности молекул, в частности, в начальной стадии протеолизе.
6. Метод миллиметровой (микроволновой) спектроскопии имеет различную чувствительность к гидрофобной и гидрофильной типам гидратации.
7. Взаимодействие пептидов в небольшой концентрации с казеиновыми мицеллами приводит к увеличению стабильности мицелл, что определяется реологически и по изменению гидратации.
8. Гидратационные измерения позволяют дифференцировать конформационные состояния клубка и глобулы для синтетических белковоподобных полимеров.
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в формировании направления исследований, разработке зкспериментальных и теоретических подходов, проведении исследований и обобщении полученных результатов.
Апробация работы.
Результаты работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме по компьютерным вычислениям в химических исследованиях (Москва, Россия, 1996 г.); на V Симпозиуме по пищевым белкам (Потсдам, Германия, 1997 г.); на XIII Конференции Европейского коллоидного и поверхностного общества (Дублин, Ирландия, 1999 г.); на IX Симпозиуме по пищевым коллоидным системам, биополимерам и материалам (Вагенинген, Голландия, 2002 г.); на VIII (Хельсинки, Финляндия, 1998 г.), IX (Зихрон Яков, Израиль, 2000 г.) Международных симпозиумах по свойствам воды; на Европейском полимерном конгрессе (Москва, Россия, 2005); на XII Европейской конференции по спектроскопии биологических молекул (Бобини, Франция, 2007 г.); на XXIX Европейском конгрессе по спектроскопии молекул (Опатия, Хорватия, 2008 г.); на семинаре в научно-исследовательском центре фирмы «Нестле» (Лозанна, Швейцария, 1996 г.), на семинаре в Немецком федеральном центре по исследованиям в молочной промышленности (Киль, Германия, 1994 г.); на семинарах в Университете Лаваля (Квебек, Канада, 1992), Университетского колледжа Дублина (Дублин, Ирландия, 2002); на семинарах лаборатории физической химии полимеров ИНЭОС РАН.
Работа была выполнена при поддержке ряда проектов РФФИ, в том числе под руководством диссертанта: 98-03-32230 (Количественное изучение гидратации амфифильных молекул) и 07-03-00131 (Количественное изучение гидратации ферментоподобных сополимеров с цвиттерионными группировками).
Публикации. Материалы диссертации изложены в 24 статьях, а также в 7 тезисах указанных выше конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и выводов, а также списка цитируемой литературы из 291 наименования. Объем диссертации 273 страницы, включая 62 рисунка и 27 таблиц.
Р-Казеин как субстрат протеолиза
По-видимому, наиболее известным примером, демонстрирующим роль гидрофобного взаимодействия в регуляции гидролиза пептидных связей, является протеолиз Р-казеина. р-Казеин обладает уникальной аминокислотной последовательностью: гидрофобные аминокислотные остатки сгруппированы в области С-конца (остатки 136-209). Гидрофильные остатки, включая фосфорилированные остатки серина, находятся в области N-конца полипептидной цепи (остатки 1-40). Гидрофобная часть полипептидной цепи представляет объемную петлю, проницаемую для молекул воды [41].
Амфифильная структура Р-казеина предопределяет мицеллярные свойства его водных растворов, включая склонность к ассоциации, нарастающей с увеличением температуры. Р-Казеин не растворим при комнатной температуре в присутствии Са+2 в концентрации, сопоставимой с концентрацией Са в молоке. Однако, поскольку осаждение Р-казеина сильно зависит от температуры, комплексы кальция с белком являются растворимыми при 1С вплоть до концентрации Са+ 400 тМ [42]. Отсутствие в аминокислотном составе Р-казеина цистеина, имеющего SH группы, определяет отсутствие межцепочечных дисульфидных связей. Поэтому, исходя из первичной структуры Р-казеина долгое время считалось, что Р-казеин практически лишен вторичной структуры, и скорее может рассматриваться как случайный клубок полипептидных цепей [43]. С другой стороны в состав белка входит значительное количество остатков пролина, которые ограничивают конформационную подвижность полипептидной цепи, и поэтому можно предположить существование предпочтительных конформаций.
Недавние спектроскопические исследования (с помощью Раман-спектроскопии) показали присутствие существенного количества Р и у 32 форм [44]. Результаты спектрального анализа и компьютерного моделирования вторичной структуры, предсказанного по аминокислотной последовательности полипептидной цепи, дали следующие результаты (Таблица 1.1.2.1):
3D структура р-казеина была рассчитана методами молекулярной механики [45]. Оказалось, что конформация молекулы представляет собой промежуточную форму между глобулой и статистическим клубком. Молекула по форме напоминает краба с двумя большими искривленными клешнями, составленными в основном из гидрофильных аминокислотных остатков с высокой вероятностью нахождения там заряженных групп. Одна клешня состоит из остатков 85-119, другая - из остатков 28-55 (включая фосфосерин 35). В эти сегменты входят пептидные связи 28-29, 105-106 и 107-108, которые образованы специфичными для плазмина остатками. Тело крабоподобной макромолекулы включает гидрофобный С-концевой фрагмент р-казеина. Форма макромолекулы, таким образом, представляет вытянутый эллипсоид с соотношением осей 2:1. Высокая встречаемость последовательностей Pro-Pro и Рго-Х-Рго (X - аминокислотный остаток) определяет повышенную компактность полипептидной цепи. Остатки X в последовательностях Pro-X-Pro в центральной части макромолекулы являются преимущественно гидрофобными остатками. Эти жесткие гидрофобные сегменты могут являться сайтами, осуществляющими «заякоривание» других гидрофобных участков полипептидных цепей [44, 45].
Согласно вторичной структуре Р-казеина, расщепляемые плазмином сайты 28-29, 105-106 и 107-108 находятся на поверхности макромолекулы. Они хорошо гидратированы, и их гидролиз не лимитируется стерическими препятствиями [45, 46, 47]. Сайты, гидролизуемые химозином, расположены на гидрофобной части р-казеина. Можно предположить, что гидрофобные взаимодействия гидрофобных участков Р-казеина могут привести к маскированию специфичных сайтов, и таким образом к существенному замедлению скорости гидролиза. Действительно в работах [47, 48] было показано, что химозин гидролизует Р-казеин преимущественно при низких температурах, при которых гидрофобные взаимодействия и следовательно самоассоциация минимальны. При расщеплении гидрофобной части полипептидной цепи Р-казеина самоассоциация заметно ослабевает. Это было показано на примере крупного пептидного фрагмента 1-189, получающегося из Р-казеина при отщеплении гидрофобного пептида 190-209 [48].
Возможная конфигурация надмолекулярных комплексов Р-казеина была рассмотрена в [45] методами молекулярной механики. Показано, что тетрамерная структура имеет форму бруска размером 84 х 42 А, где гидрофобные аминокислотные остатки расположены в центре, а полярные -по бокам. Таким образом, гидрофобные остатки могут обеспечить дальнейшую ассоциацию за счет гидрофобного взаимодействия. В работе [49] была предложена мицеллярная модель полимеризации Р-казеина при комнатной температуре со степенью полимеризации 20.
Кинетика деградации исходной полипептидной цепи
Примеры изменения в ходе протеолиза суммарной скорости реакции V(DH) для индивидуальных казеинов представлены на рисунке 2.2.7, показывающем различные зависимости для аир казеинов. Для а-казеина имеет место убывающая монотонная зависимость, а для Р-казеина зависимость V(DH) имеет локальный максимум.
В главе 3, посвященной компьютерному моделированию протеолиза, будут рассмотрены несколько характерных случаев кинетики протеолиза химотрипсином, определяемых различным соотношением параметров (т — параметр, выражающий начальную степень маскирования пептидных связей): - А. Большинство пептидных связей изначально демаскировано, т.е. т«\. - Б. Большинство пептидных связей изначально маскировано, т.е. т \. - В. Концентрации изначально маскированных и демаскированных связей соизмеримы (т 0.5) при умеренном превалировании константы скорости гидролиза наиболее специфичной связи (Тгр) над остальными. - Г. Концентрации изначально маскированных и демаскированных связей соизмеримы (т-0.5) при значительном превалировании константы скорости гидролиза наиболее специфичной связи (Тгр) над остальными.
Типичный ход кривых для этих случаев представлен на рисунках 3.3.1-3.3.4 в главе 3. Сравнение экспериментальных кривых с теоретическими результатами приводит нас к следующим выводам: 1. Протеолиз а-казеина близок к случаю А (большинство пептидных связей изначально демаскировано). 2. Протеолиз Р-казеина близок к случаю Б (большинство пептидных связей изначально маскировано). химотрипсином при концентрации субстрата 0.05 г/л. 0=6.6-10" М.
Выполненный в этом разделе анализ суммарной кинетики протеолиза, конечно, не дает возможности проследить эволюцию отдельных фрагментов цепи, как это было сделано нами с помощью ЖХВД в предыдущем разделе. Тем не менее, мы опять приходим к необходимости включить в рассмотрение процесс демаскирования пептидных связей. При описании суммарной кинетики такая необходимость возникла для объяснения немонотонностей кинетических кривых, имеющих место при небольших степенях гидролиза пептдных связей (2-4%). Если маскирование проявляется при протеолизе малоструктурированных казеиновых белков, то следует ожидать большего эффекта демаскирования при протеолизе глобулярных белков, где внутренние пептидные связи изначально недоступны для действия протеаз. Анализу протеолиза глобулярных белков посвящен следующий раздел.
Количественный электрофорез (рисунок 2.3.1) и жидкостная хроматография высокого давления на современных высокоэффективных колонках позволяют проанализировать кинетику деградации исходной цепи. В этом разделе показано, что эту информацию можно использовать для количественной оценки параметра демаскирования глобулярных белков, поскольку скорости деградации полипептидных субстратов в форме глобул и клубковоподобных цепей различны. Существенное упрощение связано с тем, что для проведенного анализа не требуется привлекать данные по кинетике гидролиза промежуточных пептидов.
Электрофореграммы проб, полученных протеолизом Р-ЛГ химотрипсином. Температура 25С, Е0 - 95 мкг/мл. а, б - невосстановленные пробы; в, г - пробы, восстановленные Р-меркаптоэтанолом. Время протеолиза: а - 0; в - 0 ; 6-45 мин; г - 45 мин.
Имелось принципиальное отличие в протеолизе полипептидных клубков (казенны) и белковых глобул (глобулин, альбумины). Если для первого случая одновременно с уменьшением площади пика исходного субстрата регистрировались пики других высокомолекулярных продуктов, то для глобулярных белков высокомолекулярные продукты, отличные от исходного белка, не регистрировались. Таким образом, во втором случае имелись признаки протеолиза "one-by-one" типа [29].
Эффект маскирования при протеолизе глобулярных белков вызывается укрыванием внутренних пептидных связей внутри белковой глобулы. Низкая скорость демаскирования по сравнению со скоростью гидролиза вызывает поодиночный механизм протеолиза ("one-by-one" механизм), при котором гидролиз только одной пептидной связи вызывает развертывание белковой глобулы и ускоренный гидролиз пептидных связей в данной полипептидной цепи, поскольку они становятся демаскированными. При этом расщепление белковых молекул происходит поодиночно, и в реакционной смеси регистрируются в основном только негидролизованные молекулы белка и финальные продукты протеолиза. Для глобулярных белков лимитирующей стадией протеолиза является стадия демаскирования. Для казеинов же демаскирование большинства связей не лимитирует протеолиз, и преимущественно проявляется параллельный тип процесса.
Кинетические кривые расходования глобулина и альбуминов спрямлялись в координатах InC - t; (в качестве концентрации белков использовали концентрации восстановленных проб). Таким образом, имело место формальное соответствие уравнению первого порядка (рисунок 2.3.4). Константы скорости первого порядка при 25 и 35С, соответствующие уравнению ln(C/C0) = -k\t, и константы скорости второго порядка по ферменту k\i = k\IEQ для сывороточных белков, а также а- и Р-казеинов, представлены в таблице 2.3.1.
Компьютерное моделирование гидролиза пепсином
В этом разделе рассмотрено компьютерное моделирование протеолиза пепсином частично демаскированного Р-лактоглобулина, одного из сывороточных белков молока, составляющего около 60% от их суммы. Этот процесс имеет важное практическое значение для пищевой химии и понимания количественных закономерностей пепсиновой стадии пищеварения. Поскольку нативный бычий Р-лактоглобулин практически не гидролизуется пепсином (гидролизуется 1% белка при больших временах протеолиза) [34], были проведены исследования по увеличению гидролизуемости после деградации его третичной структуры различными физическими и химичесим методами, включая действие этилового спирта и высокое давление [38]. При этом были получены достоверные данные по составу гидролизатов, которые использованы нами для сравнения результатов компьютерного моделирования с экспериментом.
Рассмотрим возможности предсказания протеолиза с помощью программы для пепсина - фермента, имеющего ярко выраженную вторичную специфичность.
Аминный азот N увеличивается в ходе ферментативного гидролиза пептидных цепей благодаря расщеплению пептидных связей. Эта величина, а также степень гидролиза определяются программой PROTEOLYSIS в виде функций времени гидролиза /: N(t) и d(t) = N(t)/(Bm(t) + BJif) + N(t)), где Bm(t) -концентрация маскированных пептидных связей, BJf) - концентрация демаскированных пептидных связей. Эти функции определяют общую кинетику, описывая процесс протеолиза в целом, как это было показано в разделе 2.2 на примере протеолиза казеиновых субстратов. Необходимо заметить, что аминный азот является одной из самых надежно определяемых характеристик протеолиза (спектрофотометрическое определение тринитрофенильных производных, метод рН-статического титрования и т.д.).
Точные значения параметра kjkh для (3-лактоглобулина, подвергнутого различным методам обработки, экспериментально не определялись. В компьтерном моделировании этот параметр варьировался в пределах 4 - 0.04. Нижний предел соответствовал порядку величины, определенному нами в исследованиях по гидролизу молочных белков а-химотрипсином [249].
Функция d{t) показана на рисунке 3.2.1 при двух крайних значениях параметра kdlkh. Увеличение параметра kjkh приводило к увеличению средней скорости процесса, определяемой приращением аминного азота, полученного за все время протеолиза (120 мин, рисунок 3.2.1).
Определение близких кривых для субстратов с различной степенью маскирования пептидных связей не стало для нас неожиданностью. Например, в работе [250], показано, что скорость накопления продуктов при достаточном времени протеолиза при гидролизе трипсином примерно в два раза больше для казеина, чем для сывороточных белков.
Имеется три различных типа кинетических кривых для индивидуальных компонентов протеолитической системы — субстратов и продуктов протеолиза [253]. Первый тип представляет монотонно убывающая зависимость концентрации от времени. Она соответствует исходному субстрату (кривая 1, рисунок 3.2.2 а, б). Кинетика гидролиза исходной цепи, согласно принятым нами представлениям, определяется процессом демаскирования пептидных связей (параметр kd) и поэтому может быть использована для экспериментального определения параметров демаскирования (раздел 2.3).
Второй тип кинетических кривых соответствует промежуточным продуктам реакции - пептидам, которые сначала накапливаются в ходе реакции, а потом расходуются в результате гидролиза внутренних пептидных связей. Промежуточными продуктами являются относительно длинные пептиды, которые могут представлять практический интерес благодаря поверхностно-активным или физиологически-активным свойствам. Программа PROTEOLYSIS позволяет предсказывать временные интервалы, внутри которых можно ожидать накопление пептидов, представляющих практический интерес [253]. В качестве иллюстрации может служить рисунок 3.2.2, на котором приведены кинетические кривые для двух пептидов: Lys -Ile1 (кривая 3) и Leu1JJ-Ile1D" (кривая 2).
Гидратация белков, изменение гидратации при ферментативном гидролизе
Таким образом, величина 0.17-0.19, следующая из экспериментальных данных таблицы 4.2.1, согласуется с долей связанного лиганда, вычисленной согласно уравнению (4.2.6) из типичной величины константы связывания а-циклодекстрина с ароматическими группами аминокислот К=5МЛ, а также концентраций аминокислот и лиганда, использованных в эксперименте. Величина К=5М 1 , взятая для оценок, является средним значением измененных констант [267, 268].
Взаимодействия с константой ассоциации порядка 10 М"1 и меньше принято считать неспецифичными. Специфичные взаимодействия, известные для физиологически-активных соединений, имеют существенно большие величины констант ассоциации. Например, обратные величины константы Михаэлиса (1/Км) 104-105 М"1 больше на несколько порядков по сравнению с величиной 10 М"1. Неспецифичные взаимодействия, в принципе, могут быть ответственны за маскирование пептидных связей при ферментативном гидролизе. Приведенные в этом параграфе оценки показывают, что миллиметровая спектроскопия может быть использована для оценки таких эффектов.
Таким образом, общая закономерность заключается в том, что измеренное число гидратации для соединения, находящегося в растворе в присутствии другого способного к ассоциации соединения, меньше по сравнению с числом гидратации, определенным для соединения без другого ассоциирующего компонента. Следовательно, при увеличении концентрации растворенных веществ, склонных к ассоциации, измеренное число гидратации уменьшается.
Положительная гидратация как поверхностно-активное явление предполагает, что параметры гидратации пропорциональны площади доступной для воды поверхности. В разделе 4.1 мы привели данные по зависимости чисел гидратаци от площади доступной поверхности боковых радикалов и неполярных групп боковых радикалов аминокислот (рисунки 4.1.1 и 4.1.2). Следующий важный вопрос: выполняется ли пропорциональность между числами гидратации и ПДП функциональных групп для глобулярных белков. Поскольку глобулярные белки обладают определенной третичной структурой, величины площади поверхности могут быть вычислены по рентгеноструктурным данным или с помощью эмпирических формул.
Числа гидратации были измерены для следующих глобулярных белков: бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин, пепсин, химотрипсиноген, химотрипсин, трипсин, соевый ингибитор трипсина, Р" лактоглобулин, ос-лактальбумин, лизоцим и РНКаза. Для этих глобулярных белков величины ПДП (А2) были вычислены по следующей эмпирической формуле [269]: ПДП=11.12хМ2/3 (4.3.1) где М- молекулярная масса глобулярного белка в Да [269].
Зависимость N от ПДП для глобулярных белков можно считать пропорциональной с коэффициентом пропорциональности, находящимся в интервале 0.04 - 0.06 А"2 (рисунок 4.3.1) [258]. Этот параметр позволяет оценить среднее количество связанной воды, находящейся в гидратных оболочках глобулярных белков. Количественная оценка гидратации, выраженная в граммах связанной воды на грамм белка, в среднем для изученных глобулярных белков составляет величину 0.3 [258].
Сопоставление экспериментальных и теоретических значений N, предсказанных по полученным в предыдущем параграфе вкладам в N неполярной группы СН2 (2.6), усредненной полярной группы (около 0) и заряженной пары (-3.4), представлено в таблице 4.3.1 для рибонуклеазы и лизоцима. Как можно видеть, имеется неплохое согласие вычисленных и экспериментально полученных значений N.
Необходимо подчеркнуть, что полученное согласие имеет место для тех инкрементов, которые были получены для цвиттерионов аминокислот, а не незаряженных молекул, например спиртов или органических кислот (см. различия, представленные на рисунке 4.1.4).
Изменение гидратации при протеолизе представлено на рисунке 4.3.2 для гидролиза трех субстратов трипсином. Измеряемой величиной было количество связанной воды (вода, потерявшая вращательную подвижность в диапазоне десятков ГГц), приходящейся на единицу массы субстрата. Измерения проводились в случае, когда SQ»EQ, что соответствует приближению, при котором в главе 2 рассмотрены основные кинетические закономерности гидролиза пептидных связей.
Рисунок 4.3.2 показывает, что в процессе гидролиза как глобулярных белков ((3-лактоглобулина и БСА), так и (З-казеина происходит заметное изменение (увеличение) гидратации. Что касается глобулярных белков, то увеличение гидратации по мере развертывания полипептидной цепи является вполне понятным и ожидаемым. После гидролиза хотя бы одной пептидной связи происходит разворачивание белковой глобулы, внутренние пептидные связи становятся доступны воде, что и регистрируется при измерении гидратации.
