Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Высокоэффективная эксклюзионная хроматография биополимеров 9
1.1.1. Механизм эксклюзионного разделения 8
1.1.2. Сорбенты для эксклюзионной хроматографии 10
1.1.3. Неэксклюзионные взаимодействия при анализе белков и полисахаридов 12
1.1.3.1. Ионные эффекты 13
1.1.3.2. Гидрофобные взаимодействия 14
1.1.3.3. Адсорбция 15
1.1.3.4. Внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия 16
1.1.4. Калибровка хроматографической системы и расчет молекулярно-массовых характеристик 19
1.1.4.1. Калибровка колонок по коммерческим стандартам полисахаридов 22
1.1.4.2. Калибровка колонок по узким фракциям данного полисахарида 23
1.1.4.3. Калибровка колонок по полидисперсным образцам данного полисахарида 23
1.1.4.4. "Универсальная" калибровка 24
1.2. Строение агара и агарозы 25
1.3. Методы исследования строения агара и агарозы 30
1.3.1. Химические методы 30
1.3.2. Спектральные методы З 3
1.4. Производство агара и агарозы 35
1.4.1. Технология получения агара из A. tobuchiensis 37
1.4.2. Технология получения агара из G. amansii 40
1.4.3. Способы получения агарозы 41
Глава 2. Объекты и методы исследования 44
2.1. Объекты исследования 44
2.1.1. Получение агара из A. tobuchiensis 44
2.1.2. Получение агара из G. amansii 46
2.2. Методы исследования 47
2.2.1. Источники случайных и систематических ошибок в хроматографическом анализе и методы их устранения 47
2.2.2. Методика исследования основных физико-химических процессов получения агара 49
2.2.3. Определение молекулярной массы полисахаридов 51
2.2.4. Определение структуры полисахаридов 51
2.2.5. Физико-химическая характеристика полисахаридов 53
Глава 3. Результаты и их обсуждение 54
3.1. Разделение и идентификация смесей белков и полисахаридов методом ВЭЭХ 54
3.2 Исследование основных физико-химических процессов получения агара из A. tobuchiensis 58
3.2.1. Исследование процесса предварительной обработки водоросли 58
3.2.2. Исследование процесса экстракции агара 61
3.2.3. Исследование процесса очистки гелей экстрактов 68
3.2.4. Физико-химическая характеристика фракций агара из A. tobuchiensis 75
3.3. Исследование влияния условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii 82
3.4. Получение агарозы из A. tobuchiensis 92
Выводы 95
Список литературы 97
Приложения 121
- Неэксклюзионные взаимодействия при анализе белков и полисахаридов
- Калибровка хроматографической системы и расчет молекулярно-массовых характеристик
- Источники случайных и систематических ошибок в хроматографическом анализе и методы их устранения
- Исследование влияния условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii
Введение к работе
Актуальность проблемы. Агар и агароза - это гелеобразующие полисахаридные препараты, получаемые из некоторых видов красных водорослей относящихся к родам Gelidium, Gracilaria, Pterocladia к Ahnfeltia [1-6]. Агар и агарозу широко используют в биохимии, иммунохимии, молекулярной биологии, микробиологии, производстве сорбентов для аффинной, ионообменной и эксклюзионной хроматографии, а также в пищевой и фармацевтической промышленности.
В России основным источником агара являются красные водоросли Ahnfeltia plicata, произрастающая в Белом море, и Ahnfeltia tobuchiensis, произрастающая в дальневосточных морях [2, 7, 8]. Существуют технологии получения из A. tobuchiensis агара пищевого, микробиологического и особой очистки. Однако, без дополнительной очистки эти препараты не пригодны для проведения электрофореза, иммунологических, вирусологических и биохимических исследований. Потребности в высокоочищенном агаре и агарозе удовлетворяются за счет импорта.
В ряде публикаций [9-12] была эмпирически показана возможность получения из A. tobuchiensis не только агара, но и агарозы. Методами С ЯМР-спектроскопии и рентген-дифракционного анализа было доказано, что полисахарид из A. tobuchiensis лишь незначительно отклоняется от структуры истинной агарозы [10, 12, 13]. Основываясь на этих данных, с 1992 г. в ТИНРО-центре была начата разработка технологии получения агарозы из А. tobuchiensis. Для разработки данной технологии потребовалось исследовать процессы предварительной обработки водоросли, экстракции и очистки агара, так как они, в основном, определяют выход и качество продукта. Однако стандартные методы анализа агара [2, 14, 15] не подходили для таких исследований.
Проблема анализа состава углеводов в продукции на разных стадиях технологического процесса является актуальной не только в агаровом производстве, но и в других отраслях пищевой промышленности [16-19]. В настоящее время для анализа и разделения смесей углеводов наиболее перспективной считается высокоэффективная эксклюзионная хроматография (ВЭЭХ) [18-23]. Поэтому для изучения основных физико-химических процессов, протекающих при предварительной обработки водоросли, экстракции и очистки агара решено было использовать метод ВЭЭХ.
Цель работы: исследовать основные физико-химические процессы получения агара.
Основные задачи работы:
Подобрать условия хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов.
Методом ВЭЭХ исследовать физико-химические процессы, протекающие при предварительной обработки, экстракции и очистки агара из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis.
Методом ВЭЭХ изучить влияние условий экстракции на физико-химические свойства агара из красной водоросли Gelidium amansii. Научная новизна. Впервые методом ВЭЭХ исследованы основные физико-химические процессы, протекающие при предварительной обработки, экстракции и очистке агара из красной водоросли A. tobuchiensis. Изучено влияние условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii.
Практическая значимость работы. Разработана методика хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, применимая для исследования и контроля физико-химических процессов получения агара. Разработан простой и недорогой способ получения агарозы из красной водоросли A. tobuchiensis.
8 На защиту выносятся:
Методика хроматографического анализа смесей белков и полисахаридов, применимая для исследования физико-химических процессов получения агара.
Результаты исследования основных физико-химических процессов получения агара из A. tobuchiensis.
Результаты исследования влияния условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii.
Способ получения агарозы из A. tobuchiensis.
Неэксклюзионные взаимодействия при анализе белков и полисахаридов
Полимер адсорбируется на сорбенте, если его молекулы элюируются из колонки в объеме Ve Vt (Kav \). При гель-фильтрации адсорбция связана с ван-дер-ваальсовыми силами, ионными взаимодействиями и образованием водородных связей [48, 50]. Адсорбция большинства биополимеров обратима, изотермы имеют "ленгмюровскую" форму и описываются уравнением [50]: где са - равновесная концентрация вещества на поверхности адсорбента; с - равновесная концентрация вещества в водной фазе; ст - концентрация вещества на поверхности адсорбента при насыщении; К - константа процесса десорбции.
Механизм адсорбции, как правило, связан с природой вещества и зависит от рН и ионной силы подвижной фазы [48, 50, 52, 56, 57]. Адсорбция биополимеров с длинными углеводородными радикалами на силикагеле и макропористых стеколах при рН 3-9 определяется ван-дер-ваальсовскими силами, а при рН 9 - кулоновскими силами [50].
Для белков основную роль играет их заряд [48]. Белки с изоэлектрической точкой 7 обычно проявляют ион-исключающие взаимодействия, если ионная сила подвижной фазы низка. Белки с изоэлектрической точкой 7 образуют ионные связи между аминогруппой белка и силанольной группой силикагеля или анионной группой полимерного геля. Подвижная фаза с ионной силой 0,2 М значительно подавляет эти взаимодействия [48, 59]. Максимальная адсорбция белков наблюдается вблизи их изоэлектрических точек [50, 60]. Слева, а особенно справа от изоэлектрической точки белка адсорбционная ёмкость резко падает. При добавлении в подвижную фазу 10-20% диоксана белки не адсорбируются при всех значениях рН, что указывает на значительное влияние водородных связей и дисперсионных сил при адсорбции [50]. Добавление 10-20% этиленгликоля в подвижную фазу подавляет адсорбцию белков на сорбентах с диольными группами, что подтверждает гидрофобный механизм адсорбции [48, 59].
Большинство биополимеров являющихся полиэлектролитами солечувствительны, то есть при добавлении небольшого количества электролита происходит уменьшение вязкости раствора биополимера (так называемое полиэлектролитное набухание) [31, 53, 61]. Это объясняется тем, что при добавлении электролита в раствор биополимера уменьшается сила электростатического отталкивания ионных групп полимера, уменьшается слой противоионов и ослабляются внутримолекулярные осмотические силы. Как результат уменьшается гидродинамический объём полимера. Это приводит не только к снижению вязкости раствора биополимера, но и изменяет его хроматографическое поведение. Солечувствительность биополимеров зависит от содержания и гетерогенности состава ионных групп, конформации и гибкости полимерных цепей [31, 53, 58, 62, 63]. Наибольшей солечувствительностью обладают такие полиэлектролиты как карбоксиметилцеллюлозы, альгинаты, хитозан и сульфат хитозана [22, 53]. Нейтральные полисахариды, такие как агар, декстраны и пуллуланы, это свойство практически не проявляют [22, 48]. Для растворов агара и агарозы при температуре 45 С вязкость постоянна в диапазоне рН 4,5-9 и практически не зависти от ионной силы раствора [64].
При исследовании белков необходимо учитывать размер и форму молекулы, а также эффекты агрегации [40, 50, 65]. Определение истинной молекулярной массы белка невозможно до тех пор, пока его молекулы не примут форму беспорядочного клубка. Предварительно нужно разрушить дисульфидные связи либо путем восстановления или окисления надмуравьиной кислотой, либо проведения сульфитолиза [42]. При хроматографии в качестве подвижной фазы используют 0,1 - 1% растворы додецилсульфата натрия, 6 М растворы гидрохлорида гуанидина или мочевины, поскольку эти реагенты эффективно разрушают упорядоченные конформации белков [42, 48, 50, 57]. При использовании в качестве элюента трифторуксусной кислоты разделение белков по молекулярным массам можно проводить на немодифицированном силикагеле, белки в этой среде имеют конформацию статистического клубка [65].
При определении молекулярной массы биополимеров необходимо также учитывать взаимодействия их макромолекул между собой и связанное с этим образование ассоциатов, изомеров и комплексов [61]. Для полисахаридов в растворах характерно образование двойных спиралей, двухспиральных "доменов", "пачек" и трехмерных пространственных структур (гелей) [66-68]. Так, агароза может образовывать гели при концентрации 0,16 % и даже 0,075 % [69]. Полисахариды типа альгината образуют гели только при добавлении в раствор ионов кальция [66].
Ассоциация молекул глобулярных белков в растворе обычное явление. Статистическая обработка данных для 500 наиболее исследованных белков показала, что примерно 50 % этих белков составляют димеры, 30 % -тетрамеры, 8 % - гексамеры [70]. Ассоциаты могут образовывать и белки разной природы, например комплекс пепсин-альбумин [71]. Некоторые белки, например цитохром с, образуют димеры только при повышенных концентрациях детергентов [72].
Многие белки, например сывороточный альбумин, образуют комплексы с кислыми полисахаридами [71]. Так, помутнения плодово-ягодных соков и виноматериалов объясняется образованием устойчивых комплексов белков и полисахаридов [73, 74]. В зависимости от содержания того или иного компонента эти комплексы разделяют на две группы: белково-полисахаридные с преобладанием белков и полисахаридно-белковые - с преобладанием полисахаридов. Такие комплексы выпадают в осадок при рН ниже изоэлектрической точки белка и сохраняются в растворе при рН выше изоэлектрической точки. Степень ассоциации таких комплексов уменьшается при увеличении ионной силы раствора [71].
На основании вышеизложенного, все неэксклюзионные взаимодействия в системе полимер - сорбент - растворитель можно разделить на четыре основных типа:
Калибровка хроматографической системы и расчет молекулярно-массовых характеристик
Слово "агар" (или "агар-агар") имеет малайское (индонезийское) происхождение и при переводе имеет несколько значений: 1) "желе" [86, 87]; 2) название съедобных водорослей [1]; 3) "желирующий продукт питания из водорослей" [6]. В Японии и Китае агар имел целый ряд торговых названий: "кантен", что по японски означает "холодное небо"; "токоротен" (по китайски "большое сердце") [86]; "растительный, восточный или японский желатин", "хай-сао", "фикоколла" [1]; "желоза", "хан-тао" или просто "тао" [88]; "тангфен" (по китайски "замороженная пыль")[89].
Исследования строения агара начались с середины XIX века, когда в 1859 г. из красной водоросли Gelidium сотеит был выделен полисахарид под названием "желоза" и имевший брутто-формулу (СбНю05)п [2, 86]. В конце XIX века при исследовании продуктов гидролиза агара было установлено, что он на 2/3 состоит из D-галактозы [90]. В начале XX века в агаре была обнаружена сера, связанная с органической частью и отщепляемая при гидролизе в виде сульфат-иона [91] и кальций [92]. На основании этих данных агару приписывали формулу R-R (OS03)2Ca [86]. В 1937 г. японский ученый Араки разделил агар на две фракции: нейтральную агарозу и заряженный агаропектин [93], и до конца 60-х годов XX века считалось, что агар является их простой смесью [4, 5].
В 1938 г. при исследовании продуктов гидролиза была обнаружена и идентифицирована 3,6-ангидро-Ь-галактоза и сделан вывод, что в агаре значительная часть галактозы присутствует в виде остатков 3,6-ангидро-Ь-галактопиранозида [94]. После частичного гидролиза агара из Gelidium amansii был выделен дисахарид агаробиоза - основная структурная единица агара и агарозы [95]. При частичном метанолизе агара с выходом около 82% был получен диметилацеталь агаробиозы, что свидетельствовало о высокой степени регулярности полимерных цепей молекул агара. Позднее был выделен содержащий пировиноградную кислоту диметилацеталь 4,6-0-(1 -карбоксиэтилиден)-агаробиозы - одна из структурных единиц агаропектина [96].
В 60-е годы считали, что агароза состоит из чередующихся остатков 3-связанной p-D-галактопиранозы и 4-связанной 3,6-ангидро-а-Ь-галактопиранозы, и содержит одну сульфатную группу на 10 галактозных единиц и одну 4,6-0-(1 -карбоксиэтилиденовую) группу на 51 галактозную единицу [5, 97, 98]. Другой компонент агара - агаропектин был менее изучен. Считалось, что агаропектин - смесь полисахаридов сложного строения, в состав которых входят главным образом D-галактоза и 3,6-агидро-Ь-галактоза, а также D-глюкуроновая кислота и 1-2 % сульфатных групп [5].
В начале 70-х годов было показано, что агар не простая смесь агарозы и агаропектина [99-101]. Как индивидуальный полисахарид, которому можно приписать определенную химическую формулу, существует только агароза, а агаропектин это сложная смесь отрицательно заряженных галактанов, различающихся по структуре [102].
Идеальная агароза представляет собой линейный полисахарид, построенный из строго чередующихся 3-связанных остатков P-D-галактопиранозы и 4-связанных остатков 3,6-ангидро-а-Ь-галактопиранозы (рис. 1, структура I) [103, 104]. Реальные образцы агарозы несколько отклоняются от идеальной структуры и содержат некоторое количество сульфатных, 1-карбоксиэтилиденовых и метоксильных групп. Сульфатные группы, как правило, локализованы в 6 положении остатков L-галактопиранозы (структура II), значительно реже, во 2 положении 3,6-ангидро-Ь-галактопиранозы (структура III) или 6 положении D-галактопиранозы (структура IV) [67, 105]. Также возможно наличие двух сульфатных групп по 2 и 6 положениям L-галактопиранозы (структура V) [106]. Остатки D-галактопиранозы по положениям 4, 6 могут быть модифицированы пировиноградной кислотой в виде циклических ацеталей (структура VI) [67, 105, 106]. Метоксильные группы, как правило, локализованы в 6 положении D-галактопиранозы (структура VII) или 2 положении 3,6-ангидро-Ь-галактопиранозы (структура VIII) [12, 105, 107-110].
Накопление отклонений от структуры идеальной агарозы, особенно ионогенных групп, влечет за собой уменьшение гелеобразующих свойств вплоть до их полного исчезновения. Так как эти отклонения от структуры агарозы распределены вдоль цепи более или менее случайным образом, то для объяснения строения таких полимеров удобно пользоваться представлениями о
"замаскированной регулярности" структуры [67, 111]. Понятие индивидуальности для полисахаридов, обладающих "замаскированной регулярностью", является достаточно сложным. Так, фракционирование агара на DEAE-сефадексе дает непрерывный спектр молекул, начиная от нейтральной агарозы и кончая негелеобразующим сульфатированным галактаном, причем содержание сульфата плавно нарастает по фракциям, а содержание пировиноградной кислоты проходит через максимум; в определенный момент полисахарид теряет гелеобразующую способность [99, 100, 102].
Такой сложный полисахаридный состав агара и наличие "замаскированной регулярности", по-видимому, можно объяснить ступенчатым биосинтезом галактанов [67]. На первой стадии биосинтеза строится регулярная основа полимерной молекулы из остатков галактозы, затем происходит сульфатирование и завершает процесс ферментативное элиминирование сульфата из 6 положения 4-связанных остатков a-L-галактопиранозы, приводящее к образованию 3,6-ангидроциклов. Поскольку вторая и третья стадия биосинтеза могут протекать не полностью, конечным продуктом биосинтеза является смесь "молекулярных гибридов". До настоящего времени биосинтез сульфатированных галактанов во всех деталях не изучен. Так, не выяснена роль 4,6-0-(Г-карбоксиэтилиден)-галактозы, не известно, на какой стадии происходит метилирование агара О-метилтрансферазой [112].
Источники случайных и систематических ошибок в хроматографическом анализе и методы их устранения
Агар из A. tobuchiensis получают в основном тепловым методом и только незначительное количество вырабатывают фростационным методом [1-3, 169]. Общими процессами теплового и фростационного методов являются предварительная обработка водоросли и экстракция.
Предварительная обработка водоросли включает промывку водой для освобождения от механических и водорастворимых примесей и замачивание в 0,2-0,5 %-ном известковом молоке для облегчения экстракции и ослабления окраски получаемых экстрактов. Экстракцию агара из A. tobuchiensis проводят кипящими растворами, содержащими СаО, рН экстракционной среды должна быть не ниже 8. Полнота и скорость извлечения агара из водоросли зависят от режима экстракции. Режим экстракции агара определяется рН среды, гидромодулем, температурой, продолжительностью и кратностью процесса. При использовании автоклавов процесс экстракции ускоряется и увеличивается выход агара. Однако при повышении давления выше некоторого предела (порог критичности) выход и качество агара снижаются в результате гидролиза. Для более полного извлечения агара из водоросли проводят несколько последовательных экстракций [1, 2].
Экстракция агара из водоросли подчиняется закону Фика [3]: где S - количество агара, продиффундировавшего за время Z через площадь F сквозь слой растворителя толщиной /, Сі - концентрация агара в ткани водоросли, С2 - концентрация агара в экстракте, D - коэффициент диффузии, определяемый по формуле Эйнштейна: где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура экстракции; rj -вязкость экстракта, г - радиус частиц. Для получения однородного по свойствам продукта экстракты смешивают и направляют на сепараторы или центрифуги. Предельная концентрация агара в очищенном экстракте составляет не более 1,5 %, но обычно она не превышает 0,7-1,2 %, при общем содержании органических веществ 2,5-2,9 % и 0,6-1,8 % минеральных [1-3, 169]. Неагаровые вещества в экстракте представляют собой белки, пептиды, низкомолекулярные сахара и минеральные соли [169, 170].
Очищенные экстракты желируют в аппаратах с принудительным бесконтактным охлаждением морской или пресной водой и затем гель разрезают на пластинки или бруски толщиной 5-6 мм. При тепловом методе получения агара для очистки и обесцвечивания гель промывают водой. Очистка геля происходит за счет хорошей растворимости неагаровых примесей в воде. После удаления избытка воды получают коагель, содержащий 0,7-0,8 % агара. Его расплавляют и упаривают под вакуумом до содержания сухого агара 2,5-2,8 %. Концентрированный раствор сушат в распылительных или вальцовых сушилках [2, 169].
При фростационном методе обесцвечивание, очистка и высушивание агара происходит в естественных условиях. Этот метод очистки основан на том, что при медленном замораживании геля в его толще образуются крупные кристаллы льда, между которыми сосредоточены пленки замороженного более концентрированного агарового геля (коагеля). При оттаивании талая вода вместе с растворенными неагаровыми веществами стекает с коагеля, освобождая его от органических и минеральных загрязнений. Дополнительная очистка коагеля происходит за счет окисления примесей кислородом воздуха и разрушения их под действием солнечного света [2, 169]. Существуют также технологические схемы, где искусственное замораживание и дефростация применяются для частичного обезвоживания студня до или после промывки водой, а для сушки используют сушилки различных типов [2, 169]. Для получения агара особой очистки промытый водой гель плавят, охлаждают до температуры 55-60 С и при слабом перемешивании вводят в него суспензию СаСОз, массу дважды сепарируют и желируют. Гель измельчают, отжимают на гидравлическом прессе и сушат в сублимационной сушилке [169].
Существует японская технология получения агара из A. plicata, которая отличается от технологии, принятой в России, использованием NaOH вместо СаО при предварительной обработке и экстракции, методом очистки и обезвоживания агара [3]. По японской технологии предварительную обработку водоросли проводят 5-6 %-ным раствором NaOH при температуре 60-70 С в течении 3-4 ч, затем промывают водой и отмачивают 8-12 ч. Экстракцию проводят в автоклавах 0,5-0,7 %-ным раствором NaOH при 120-130 С в течении 3-4 ч. Экстракт фильтруют и направляют в машину непрерывного желирования. Гель отбеливают раствором NaCIO, для дехлорирования применяют уксусную кислоту. Обесцвеченный гель промывают водой, обезвоживают на гидравлическом прессе и сушат горячим воздухом [3].
По нормативно-технической документации [171-173] основными критериями качества агара считают прочность 0,85 %-ного геля агара, содержание воды, золы, общего азота и температуры плавления и застудневания. Для определения этих показателей используют стандартные методы анализа [2, 14, 15]. Физико-химическая характеристика разных видов агара из A. tobuchiensis приведена в таблице 2.
Исследование влияния условий экстракции на физико-химические свойства агара из G. amansii
Молекулярную массу полисахаридов определяли методом ВЭЭХ. 5 мг образца агара или агарозы растворяли в 5 мл смеси ДМСО-вода (9:1) при нагревании на водяной бане, фильтровали через мембранный фильтр Kurabo 25N (Япония) с размером пор 0.45 мкм и анализировали ВЭЭХ в описанных выше условиях.
Для определения молекулярной массы колонки калибровали по стандартам декстранов с молекулярной массой 10, 20, 40, 70, 80, ПО, 250, 500 и 2000 кДа (Pharmacia Biotech, Швеция). Концентрация растворов декстрана 1 мг/мл. Молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение рассчитывали с помощью компьютерной программы 7GPC (Shimadzu, Япония).
Для определения содержания сульфата в полисахаридах использовали метод Доджсона [124]. Точную навеску полисахарида (6-7 мг) растворяли в 2 мл 1 н НС1 и нагревали в запаянной ампуле 5 ч при 105-110 С. После охлаждения ампулы вскрывали, 0,2 мл гидролизата переносили в пробирку, содержащую 3,8 мл 3 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Добавляли 1 мл раствора желатина с ВаСІг и измеряли поглощение против контрольного раствора, в котором вместо гидролизата брали 0,2 мл 1 н раствора НС1. Измерения проводили на КФК-3 при длине волны 364 нм, кюветы длиной 1 см. Вторые 0,2 мл гидролизата смешивали с 3,8 мл 3 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, прибавляли 1 мл раствора желатина и измеряли поглощение против контрольного раствора. По разности величин оптической плотности рассчитывали содержание общего сульфата в полисахариде. Калибровочную кривую для расчетов строили по K2SO4, предварительно перекристализованному и высушенному при 105 С.
Для построения калибровки готовили исходный раствор K2SO4 с концентрацией 1 мг/мл, затем для построения калибровочного графика методом разбавления готовили серию растворов K2SO4 следующих концентраций: 40 мкг в 0,2 мл, 60 мкг в 0,2 мл, 80 мкг в 0,2 мл, 100 мкг в 0,2 мл, 120 мкг в 0,2 мл, 140 мкг в 0,2 мл, 160 мкг в 0,2 мл, 180 мкг в 0,2 мл. При построении калибровочной кривой измерения проводили только с реактивом ВаСЬ + желатин, холостая - дистиллированная вода. 0,2 мл раствора K2SO4 смешивали с 3,8 мл 3 % раствора трихлоруксусной кислоты, добавляли 1 мл раствора желатина с ВаСЬ- Через 5-10 мин измеряли поглощение на КФК-3 при длине волны 364 нм против дистиллированной воды. Расчет содержания сульфата в образце проводили по следующей формуле: где С - концентрация вещества определения по калибровочной кривой; т - навеска; 0,6 - коэффициент пересчета из K2SO4 в Na2SC 4. Мономерный состав полисахаридов определяли методом полного восстановительного гидролиза [143, 144, 181]. К точной навеске полисахарида (5-Ю мг) или сухой водоросли (15-20 мг) добавляли 40-50 мг 4-метилморфолинборана (Aldrich, США) и 1 мл 2 М трифторуксусной кислоты, содержащей инозит (0,9 мг/мл). Смесь нагревали в закрытой колбе 8 ч при температуре 100 С. После охлаждения к смеси трижды прибавляли и отгоняли на роторном испарителе по 8 мл этанола. К сухому гидролизату добавляли 1 мл 6 %-ного раствора хлоргидрата гидроксиламина в пиридине и нагревали 1 ч при 100 С. Затем добавляли 1 мл уксусного ангидрида и нагревали еще 1 ч при 100 С. После охлаждения к смеси трижды прибавляли и отгоняли на роторном испарителе по 10 мл толуола. Оставшуюся маслянистую жидкость растворяли в 3 мл хлороформа и добавляли 1 г силикагеля (Woelm, Германия). Все тщательно перемешивали и фильтровали через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывали два раза хлороформом порциями по 3 мл. Хлороформ отгоняли на роторном испарителе, остаток растворяли в 1 мл хлороформа и анализировали ГЖХ. ГЖХ-анализ выполняли на газовых хроматографах Shimadzu GC-14A (Япония) и Hewlett-Packard 5890А с пламенно-ионизационными детекторами и капиллярными колонками СВР1 (Shimadzu, Япония) и Ultra-1 (Hewlett-Packard), градиент температуры от 180 до 280 С, 5 С/мин и от 175 до 290 С, 10 С/мин, соответственно. В качестве внутреннего, стандарта использовали инозит. Коэффициент молярного отклика по отношению к ацетату инозита для 2-0-метил-3,6-ангидрогалактозы и 3,6-ангидрогалактозы - 0,58, для галактозы - 0,5. Пробы вводили шприцом на 1 мкл (SGE, Австралия), объём пробы 0,5-1 мкл. С ЯМР-спектры снимали для 1 %-ных растворов агара в D2O на спектрометре Broker WM-250 (Германия) с рабочей частотой по углероду 62,9 МГц, внутренний стандарт - метанол (50,16 м. д.). Содержание воды, золы, прочность геля 0,85 %-ного раствора полисахарида, температуры плавления и застудневания определяли стандартными методами по ГОСТ 26185-84. Общее содержание азотистых веществ определяли микрометодом по Кьельдалю на приборе "Kjeltec auto" 10 SO Analyser (Tecator, Япония). Содержание агарозы в агаре определяли весовым методом после фракционирования в дим етил сульфоксиде (ДМСО) по методу Тагава [178].
