Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. История открытия и основные свойства вироидов 9
1.2. Степень изученности вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) 14
1.3. Способы передачи инфекции в природе 19
1.4. Растения-индикаторы и круг растений-хозяев ВВКК 22
1.5. Принципы диагностики ВВКК 24
1.6. Значение селекции картофеля на устойчивость к ВВКК и приемов оздоровления 28
2. Материалы, методы и условия проведения исследований 30
2.1. Место и условия проведения работы 30
2.2. Материал 33
2.3. Методы исследований 34
2.4. Методы статистической обработки 38
3. Фитосанитарныи мониторинг распространения вироидной инфекции на культуре картофеля 40
3.1. Распространение ВВКК и поражаемость сортов 40
3.2. Вредоносность ВВКК 45
3.3. Исследование круга растений- хозяев ВВКК в Северо-Западном регионе РФ 59
4. Совершенствование методов изучения и диагностики вироидной инфекции 63
4.1. Диагностика патологии растений методом люминесцентного анализа с целью совершенствования фитосанитарного мониторинга 63
4.1.1. Принципиальное обоснование использования метода 63
4.1.2. Разработка методики люминесцентного анализа применительно к вироидной инфекции 64
4.1.3. Закономерности люминесценции водных настоев тканей растений томата-индикаторов на ВВКК 72
4.1.4. Закономерности люминесценции водных настоев клубней картофеля инфицированных ВВКК 74
4.2. Совершенствование индикаторного метода диагностики ВВКК 76
4.2.1. Исследование реакций набора растений-индикаторов на инфекцию ВВКК 77
4.2.2. Оптимизация условий и способов инокуляции вироидом 82
5. Скрининг генофонда картофеля по признаку устойчивости к ВВКК 86
5.1. Оценка коллекции картофеля по устойчивости к ВВКК и выделение источников для селекции на естественном инфекционном фоне с использованием метода растений индикаторов 86
5.2. Оценка коллекции картофеля по признаку устойчивости к ВВКК и выделение источников для селекции на искусственном инфекционном фоне с использованием метода растений индикаторов 100
5.3. Анализ центров происхождения выделенных источников среди диких видов и сортов картофеля, устойчивых к ВВКК и перспективных для селекции 104
5.3.1. Ботанико- географическая и хозяйственная характеристика выделенных источников, перспективных для селекции на устойчивость к ВВКК. 104
5.3.2. Выделение хозяйственно- ценных источников с устойчивостью к ВВКК и комплексу вредных организмов 106
Выводы 109
Практические предложения 110
Список литературы 111
Приложения 128
- Степень изученности вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК)
- Исследование круга растений- хозяев ВВКК в Северо-Западном регионе РФ
- Принципиальное обоснование использования метода
- Оценка коллекции картофеля по признаку устойчивости к ВВКК и выделение источников для селекции на искусственном инфекционном фоне с использованием метода растений индикаторов
Введение к работе
Картофель - ценная продовольственная, техническая и кормовая культура. Широкое распространение его во многих странах мира объясняется высокой экологической пластичностью, урожайностью, биологической ценностью, хорошими вкусовыми качествами, гармоничном содержанием Сахаров, витаминов, микроэлементов, минеральных солей. По распространенности картофель занимает пятое место среди культур, обеспечивающих человечество питанием и четвертое по валовому урожаю. Урожайность и ценность картофеля еще не исчерпаны и в решении проблемы питания человечества на Планете картофелю уделяется особенно большое внимание. Являясь тетраплоидом картофель с вегетативным размножением легко адаптируется, отличается высокой способностью к регенерации генов, поэтому к нему широко применимы нетрадиционные методы размножения, селекции и генной инженерии (РоссХ., 1989).
Однако большие потери урожаю картофеля наносят патогены, среди которых одно из ведущих мест занимают вирусы, микоплазмы и вироиды (Блоцкая Ж.В., Зубкевич О.Н., 1997; Власов Ю.И., Замалиева Ф.Ф.,1997; Власов Ю.И., 1999; Козлов Л.П., 1997).
Среди возбудителей болезней картофеля пока наименее изучены вироиды, их этиология, диагностика, пути циркуляции в природе и в растении, а также устойчивость к ним генотипов из разнообразия рода Solanum L.
Вироиды - принципиально новый класс патогенов растений. Исследование их одна из актуальных и практически важных проблем современной фитопатологии. Сложность решения проблемы именно в недостаточной изученности биологии вироидов, состоящих из одной низкомолекулярной РНК очень малого молекулярного веса.
В настоящее время в России предпринимаются меры по оздоровлению картофеля от вироида веретеновидности клубней (ВВКК); в частности, в
Северо- Западном регионе такой опыт накапливается в ВИЗР (Козлов Л.П., Якуткина Т.А., Солянкина Л.В., 1999).
Соответствующие работы продолжаются и в других учреждениях (Дрыгин Ю.Ф. и др., 1996; Мусин СМ. и др., 1997). Вместе с тем еще используются далеко не все возможности защиты картофеля от ВВКК.
Одним из наиболее радикальных направлений борьбы со всеми инфекционными заболеваниями является улучшение и выведение новых устойчивых сортов картофеля на основе межвидовой гибридизации. Н.И. Вавилов считал, что: «Наиболее целесообразно для успешности селекции на иммунитет вести работу, по возможности, с разнородным генетическим и географическим материалом». (Вавилов Н.И., 1964). Исходя из этого положения большое значение имеет исследование устойчивости к ВВКК широкого разнообразия клубнеобразующих видов рода Solanum L. для выявления источников устойчивости пригодных для последующего использования их в практической селекции.
Важным резервом ценного исходного материала является генофонд мировой коллекции картофеля ВИР (Костина Л.И., 1972; Трускинов Э.В., 1972). Однако вовлечение в селекцию источников устойчивости к ВВКК из мировых ресурсов коллекции осложняется пока малой изученностью их по признаку резистентности к данному заболеванию. Хотя в нашей стране предпринято разностороннее изучение ВВКК (Леонтьева Ю.А., 1971; Мо-жаева К.А., Васильева Т.Я., 1985), но целенаправленного исследования большого объема коллекционного материала диких и культурных южно и североамериканских видов картофеля, пока не проводилось.
Вышесказанное обусловило актуальность иммунологического анализа разнообразия рода Solanum L. по устойчивости к ВВКК и изыскания для селекции источников данного признака. В целях ускорения проведения иммунологического исследования генофонда большое внимание уделяли разработке и совершенствованию экспресс-методов оценки возбудителя болезни по патогенности, что также до последнего времени мало исследовано.
Ввиду актуальности, большой практической значимости, малой изученности перечисленных вопросов нами были определены следующие цель и задачи исследований.
Цель исследований - выявить и изучить особенности распространения ВВКК в Северо-Западном регионе России, на коллекции картофеля ВИР, осуществить поиск источников устойчивости к ВВКК и усовершенствовать экспресс-методы диагностики ВВКК.
Для выполнения поставленной цели решали следующие конкретные задачи: - изучить распространение, вредоносность, особенности патогенеза ВВКК. -усовершенствовать индикаторный метод диагностики ВВКК. осуществить анализ генофонда картофеля на устойчивость к ВВКК. выделить перспективные источники устойчивости к вироиду для использования их в селекционной работе. определить закономерности распределения видов носителей устойчивости в районах их произрастания в Южной и Северной Америке для целей их интродукции и использования в селекции.
Научная новизна исследований: определена степень вредоносности ВВКК для растений картофеля; выявлены новые растения индикаторы для диагностики ВВКК; изучен круг растений-хозяев ВВКК в Северо-Западном регионе РФ; впервые осуществлен обширный по объему скрининг генофонда мировой коллекции клубнеобразующих видов картофеля по признаку устойчивость к ВВКК; выделены ценные источники устойчивые к ВВКК для использования в качестве исходного материала в селекции; - по коллекционному материалу установлены ареалы произрастания устойчивых форм из рода Solanum L. на территории Южно-Американского и Северо-Американского центров происхождения культуры.
Практическая значимость работы. -определена органотропная симптомология штаммов ВВКК в Северо-Западной зоне РФ; -исследован круг растений-хозяев ВВКК среди культурных и дикорастущих сорных растений Северо-Западного региона РФ, а также среди культурных и дикорастущих видов рода Solanum L; -предложены для диагностики ВВКК новые растения индикаторы с коротким инкубационным периодом; -разработана методика люминесцентного анализа для выявления инфекции и проведения негативного отбора; -на фоне искусственного заражения выделены образцы картофеля с устойчивостью к ВВКК для целей практической селекции.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены: на Всероссийском съезде по защите растений ВИЗР (СПб., 1995 г.); на конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов СПбГАУ (СПб., Пушкин, 1996, 1997, 1998, 1999, 2000 гг.); на конференции молодых ученых ВНИИР им. Н.И. Вавилова «Современные проблемы растениеводства» (СПб., 1996 г.); на научной сессии Северо-Западного научного центра РАСХН (1997; 1998; 1999 гг.); на совещании РАСХН по теме: «Экологически безопасные методы борьбы с паразитическими нематодами и вирусными болезнями растений» (1997 г); на выставке АПК России (Москва, 1998 г.(х); на семинаре ВНИИР им. Н.И. Вавилова «Исходный материал, вопросы селекции и семеноводства картофеля на Северо- Западе России» (1999 г.).
Представленный материал отражен на рисунке 1.
Рис. 1. Выставка АПК России, декабрь, 1998 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликованы 5 и 2 работы находятся в печати.
Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории вирусных, микоплазменных и нематодных болезней ВИЗР, а также сотрудникам отдела клубнеплодов ВНИИР им. Вавилова за помощь, оказанную в процессе выполнения работы.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Степень изученности вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК)
По симптомам болезнь похожа на большинство вирусных патологий. Пораженные растения характеризуются угнетением роста, прямостоячим и вытянутом габитусом, обусловленным задержкой роста боковых побегов, а также малым количеством слабоколенчатых стеблей с уменьшенными листьями, отходящими от стебля под более острым углом. Листья отличаются от здоровых размерами и слабой рассеченностью.
На некоторых сортах патология проявляется в интенсивном пожелтении краев пластинок верхних листьев, в стягивании центральной, а затем и боковых жилок. Цвет ботвы вироидных растений в начале вегетации темно-зеленый, а с фазы цветения светло-зеленый, затем - желто-зеленый (Леонтьева Ю.А., 1971; Романова С.А., Леднева В.А., 1995; Bonde R. at al., 1951).
Клубни с ВВКК различной формы: веретеновидные, цилиндрические, грушевидные с выдающимися над поверхностью глазками и резкими «бровями», ослаблением интенсивности окраски (бледная - у краснокожих сортов; бурая, пятнистая - у бледноклубневых) (Леонтьева Ю.А.,1971; Фо-мюк М.К., 1955; Bonde R. at al., 1951; Bokx J., Piron P.G., 1981). Иногда на клубнях образуются глубокие трещины (Игонтов В.Г., 1972; Можаева К.А., Васильева Т.Я., 1985; Рожалин Л.В., Белова ОД,1948; Diener Т.О., 1979).
ВВКК влияет, как на клубни, так и на сосуды вегетирующего растения. Симптомы различаются в зависимости от сорта, степени зрелости растения и окружающих условий, в которых произрастает растение. Симптомы слабее при низких температурах и заболевание значительно труднее обнаружить в начале сезона.
Черешки листьев Сокращается камбиальная зона в проводящих пучках; уменьшается слой колленхимы; происходит сильное одревеснение сосудисто-волокнистого кольца (Марковская Т.К., 1983). В клетках коровой паренхимы появляются крупные включения округлой формы с зернистой структурой; гипертрофируются ядра: нуклеолы, глобулы, содержащие нуклеопро-теиды (Марковская Т.К., 1983).
В настоящее время известно, что ВВКК встречается на всех континентах: в Европе (Великобритания, Болгария, Польша, Россия), Северной и Южной Америке (США, Канада, Аргентина, Перу), Азии (Индия, Япония) и Австралии (табл.1.2.2). В отдельных Европейских странах (Франция, Бельгия) проблема изучения ВВКК менее острая, ввиду выращивания картофеля на небольших площадях.
В СССР и странах бывшего СССР достоверно известен ВВКК на Украине, в Узбекистане, Белоруссии, Киргизии, в Средней Азии, Закавказье, в Российской Федерации (Зыкин А. Г., 1976; Леонтьева Ю.А., 1971; Можаева К. А. и др., 1980).
В 70- х годах в РФ веретеновидность или «готика» считалась южным заболеванием с ареалом в Поволжье (13-27% больных растений), в предгорных районах Северного Кавказа (до 20% больных растений), а также в Алтайском крае и в Центральном и Центрально-Черноземном районе (Романова С.А., Можаева К.А., 1996).
На Северо-Западе и на Севере РФ., на всей территории Дальнем Востоке веретеновидность клубней ранее не отмечалась (Зыкин А.Г., 1976; Романова С.А. и др„ 1996). Вредоносность заболевания зависит от штамма ВВКК, сорта картофеля и условий выращивания. В жаркую и сухую погоду симптомы выражены гораздо резче, чем при влажной и холодной погоде. На молодых растениях проявление болезни сильнее, чем на поздних стадиях развития. Избыток азотных удобрений, а также наличие в растении вирусов X, Y, S усиливают вредоносность поражения клубней (Леонтьева Ю.А., 1964; 1980).
Под влиянием ВВКК резко повышается транспирация листьев. У листьев с больных растений количество устьиц на 1мм 2 площади листа выше, чем у здоровых. Поэтому засушливые периоды больные растения переносят тяжелее, чем здоровые, у них слабо развиты корни, в связи с чем накопление урожая клубней у больных растений идет неравномерно (Марковская Т.К., 1983; Clark H.L. at al., 1967).
В США и Канаде отмечено снижение урожая картофеля, пораженного сильным штаммом ВВКК, на 40-90%. У некоторых восприимчивых сортов отмечают снижение урожая под влиянием ВВКК на 70-90 % (Грама Д.П., 1969; Игонтов В.Г., 1973; Леонтьева Ю.А., 1971; Можаева К.А., Васильева Т.Я., 1985; Можаева К.А., и др., 1998; Plannenstiel М. A., Slack S. А., 1980). Одновременно ухудшаются вкусовые качества клубней, снижается крахма-листость, увеличиваются потери при хранении клубней. Происходит уменьшение массы одного клубня и возрастает поражаемость разными видами гнилей (Леонтьева Ю.А., 1971; Можаева К.А., Васильева Т.Я., 1985; Schultz E.S., Folson D., 1923).
В США при промышленной переработке картофеля до 1 % потерь происходит из-за картофеля, пораженного ВВКК. В России, в Поволжье потери картофеля от поражения «готикой» достигают 6% валового сбора. Вредоносность готики в последующих репродукциях постоянно возрастает. В результате этого на 3-5 год урожайность снижается на 80-95% (Леонтьева Ю.А., 1971).
Исследование круга растений- хозяев ВВКК в Северо-Западном регионе РФ
Вироиды, как мельчайшие и простейшие агенты инфекционных заболеваний, вызывающие экономически важные заболевания у растений, имеют способность к переносу от зараженных растений на здоровые. Поэтому крайне актуальна проблема контроля за кругом растений-хозяев ВВКК, особенно в агроценозах картофельных полей. Детально ранее этот вопрос в условиях Северо-Западного региона РФ не изучался.
В литературе известна идентификация вироидов на различных культурах, что служило определению круга растений-хозяев (табл. 3.7). Показано, что у зараженных вироидом растений часто отсутствуют визуальные признаки заболевания, т.е. отмечается способность к скрытой инфекции.
Серьезную опасность представляет болезнь каданг- каданг, вызываемая вироидом, от которой погибают миллионы пальмовых деревьев. Planta macho viroid является причиной новой очень вредоносной болезни томата в Мехико, встречающейся на некоторых видах диких растений (Galindo A., at al., 1982). Это доказывает возможность существования вироидных резерваторов среди диких растений.
Возможно очаги вироидных инфекций возникают вследствие случайного переноса вироидов от резерваторов, имеющиеся среди дикорастущих растений на культурные виды в агроценозах. Что же качается ВВКК, то принято считать, что главным источником инфекции для всех вариантов переноса служат посадки картофеля, зараженного вироидом. Однако выяснилось, что вироиды встречаются и в естественных биоценозах на дикорастущих видах рода Solanum L. Так, на американском континенте вироид, во многом сходный с ВВКК, обнаружен на дикорастущем виде Solanum cardiophyllum Lindle (Martinez- Soriano et all., 1996).
С этой точки зрения мы решили проверить зараженность вироидом дикорастущих представителей рода Solanum из коллекции ВИР. В итоге чв качестве носителей ВВКК выявлены следующие виды: Solanum bertaultii Hawk., S. leptopyes Bitt., S. neozossii Hawk., S. okadae Hawk., S. oplocense Hawk., S. sparsipilum Bitt., S. acaule Bitt., S. acroscopicum Ochoa., S. medians Bitt., S. demissum Lindl., S. jamessii Torr., S. pinnatisectum Dun.
Полученные нами данные должны учитываться при использовании дикорастущих видов в селекционной работе. Применение люминесцентного метода в биологических исследованиях, в том числе и в фитопатологии, изучали многие ученые (Гиренко В.И., Голланд М.И., 1954; Карнаухов В.И., 1978; Карнаухов В.И. и др., 1983; Кожанова Н.И., 1993). Бенкен А.А., Власова Э.А., Гусева Н.Н (1965) разработали макролюминесцентный метод диагностики вертициллезного вилта хлопчатника при искусственном заражении растений или с использованием вегетирующих растений на инфекционном фоне. При этом наблюдалась и оценивалась (самовозбуждающаяся) собственная люминесценция тканей в потоке УФ-лучей в виде яркого голубовато-зеленого свечения жилок листьев, продольных срезов корня и стебля растений, пораженных вилтом (Методические указания, 1965).
Что касается применения люминесцентного анализа в фитовирусологии, то наибольшее внимание нами уделено методике Власова Ю.И. и Лариной Э.И. (1963), по которой выявляли различия в свечении водных настоев тканей больных и здоровых растений. При этом интенсивное свечение наблюдали в случае использования настоев из тканей растений, пораженных вирусами. Очевидно, при патологическом процессе, вызванном той или иной инфекцией, возрастает накопление люминесцирующих веществ, что отличает их при сравнении с метаболизмом здоровых растений. Этот феномен возможно учитывать в практике как один из диагностических показателей патологии. Таким образом, эффект повышенной люминесценции помогает установить (в том числе и на ранних фазах развития болезни) аномальное развитие организма. Однако, имеются определенные ограничения в трактовке получаемых результатов. Так, на основе лишь одного явления люминесценции сложно, а нередко и практически невозможно с достоверностью установить вид возбудителя болезни, вызвавшего патологический процесс. Вместе с тем, указанный метод привлек наше внимание по следующим причинам: 1) представляет интерес сопоставление закономерностей патологии растений при вирусной и вироидной инфекции; 2) в случае получения четких различий в люминесценции экстрактов тканей вироидных и здоровых растений, данный метод мог бы оказаться полезным при негативном отборе зараженного материала.
Опираясь на имеющиеся литературные данные, мы начали подбор оптимальных условий для проведения теста на наличие вироида в исследуемых клубнях картофеля. Для данного типа растительной ткани интенсивность люминесценции было решено оценивать у водных настоев, приготовленных из измельченных клубней. В процессе просмотра люминесценции настоев в проходящем потоке ультрафиолетового света (через УФС-3) и при визуальной оценке интенсивности свечения в разных вариантах (рис. 4.1), нами была разработана и предложена соответствующая шкала (табл. 4.1).
Принципиальное обоснование использования метода
В качестве материала для проведения тестов были выбраны клубни картофеля двух сортов Луговской и Ресурс. Часть материала искусственно заражали ВВКК, поэтому при проведении анализа нам заведомо было известно, заражен тестируемый образец или нет. Это позволило оценить, насколько надежна разработанная методика. В конечном итоге было испытано по 24 варианта условий анализа для каждого из двух сортов картофеля (табл. 4.2). При этом в каждом варианте тестировались по два образца (зараженный и здоровый).
При температуре 18С динамика этого показателя отличается заметной стабильностью, как в контроле, так и при исследовании зараженных образцов. Средний балл в вариантах опыта с использованием температуры 18С составляет в контроле 2,1, в то время как использование повышенных (29-30С) и пониженных (4-5С) температур приводит к значительным колебаниям интенсивности люминесценции. При этом максимальные значения для зараженных клубней при 18С отмечены на уровне 4 баллов (табл. 4.3, рис. 4.3), которую считаем оптимальной для проведения анализа.
Примечание: Достоверность различий между выборками по критерию t diff Стьюдента; р - вероятность отсутствия статистически значимых различий между выборками. При этом параметре температуры, интенсивность люминесценции в опыте (зараженные ВВКК клубни) практически в 2 раза превышала контрольный вариант. Закономерность сохранялась на разных сортах . Примечание: 1 - клубни, зараженные вироидом; 2-здоровые клубни Что касается нарезки картофеля на терке (вариант «Мезга») в сравнении с использованием для настаивания кубиков, то предпочтение было отдано способу нарезки кусочков клубня кубиками, что проще в практическом плане, чем натирание клубней (мезга).
Резюмируя итоги методической части опытов эффектом люминесценции настоев с клубнями картофеля, отметим, что выбраны те условия тестирования, которые давали наиболее стабильные результаты и отмечаются статистически достоверные различия между зараженными ВВКК образцами и контролем, т. е. экспозиция водных настоев в течение 48 часов при температуре 18С.
По указанной методике в дальнейшем проводили все остальные исследования по люминесценции в процессе фитосанитарного мониторинга. Известно, что растения томата являются широко используемыми в практике индикаторами на вироид веретеновидности клубней картофеля (Леонтьева ЮА, 1971; 1980; Можаева К.А. и др., 1985). В определенных экологических условиях (повышенная температура, высокая интенсивность освещения) на томате развиваются четкие симптомы ВВКК. Подробные данные о растениях- индикаторах на вироид приведены в специальном разделе главы 1 (стр. 22-23). Как показала практика работы с индикаторами, их реакция на ВВКК не всегда четкая и трактуемая однозначно. Это может обусловлено условиями выращивания индикаторов, их возрастом, особенностями сорта. Эти обстоятельства требуют подтверждения заражения индикаторов вироидной инфекцией. Подтвердить заражение можно молекулярно- биологическими и другими тестами. Однако не всегда это возможно. Оказалось необходимым выяснить для подтверждения закономерностей люминесценции, установленных на картофеле (см. стр.72), на растениях- индикаторах, в частности на томате. Только после этого возможно рассматривать вопрос о практическом использовании феномена люминесценции для диагностической работы с растениями-индикаторами.
В исследовании использовали листья растений томата- здоровых и зараженных ВВКК. Для настоев нарезали диски (Д=1 см) и одинаковое число дисков помещали в пробирки с объемом 5 см3 воды.
Просматривали водные настои из листьев томата сортов Rutgers, Волгоградский 5/95, Сибирский скороспелый, которые предварительно заражали ВВКК. Соответственно- контроль готовили из листьев здоровых растений томата этих же сортов. Все испытуемые растения искусственно заражали ВВКК, каждый просмотренный вариант имел 5-10 повторностей.
На листьях опытных растений томата после инокуляции ВВКК через 7 суток симптомы еще отсутствовали, но просмотр настоев выявил яркую голубую интенсивность свечения люминесцирующего раствора при отсутствии такового в контроле. Однако, отсутствие свечения в инфицированном варианте оказалось более характерно на сорте томата Волгоградский 5/95 для нижних ярусов листьев. Это характерно для 7 го" 9-г0 яруса и соответствовала уровню интенсивности свечения 1-3-х баллов, при полном отсутствии люминесценции в контроле (0 балла).
Последующий анализ выявил и подтвердил изменения интенсивности люминесценции в зависимости от использования для настаивания листьев различных ярусов. Указанная работа имеет важное методическое значение с точки зрения достоверного взятия проб для проведения анализа.
В разных повторностях использовали искусственно зараженные и здоровые растения томата, имевшие в период отбора проб 7-9 ярусов листьев (ярусы нумеровали по стеблю сверху- вниз). Наиболее яркое свечение выявлено у настоев, полученных в опыте из листьев верхних ярусов (1го- 2го яруса), когда интенсивность свечения составила 4-5 баллов. Настои листьев из здоровых растений (контроль) имели люминесценцию менее интенсивную на уровне 2-3 баллов для 1Г0-2Г0 яруса листьев.
Резюмируя результаты, нами установлено, что при режиме настаивания (2-ое суток при t=18C) различия в люминесценции водных настоев вироидных и здоровых растений четко наблюдаются как на культуре картофеля, так и на культуре томата. Важно также отметить, что эффект свечения в ультрафиолете фиксируется на культуре томата намного раньше, до появления внешних симптомов ВВКК, т.е. на 7-и день после искусственного заражения вироидом. При этом симптомы визуально диагностируются, в зависимости от штамма, только через 15-30 дней. Это подчеркивает практическую значимость метода по ускорению эффекта диагностики.
Итоги проведенных исследований по использованию люминесцентного анализа полезны при работе по диагностике ВВКК индикаторным методом. Применение люминесцентного анализа для выявления ВВКК на растениях- индикаторах, впервые обосновано и предложено нами, и отсутствовало ранее в литературе. Сочетание этих двух методов повышает достоверность определения наличия ВВКК с помощью растений-индикаторов.
Оценка коллекции картофеля по признаку устойчивости к ВВКК и выделение источников для селекции на искусственном инфекционном фоне с использованием метода растений индикаторов
Второй этап скрининга включил работу специальными методами инфицирования по оценке выделившихся устойчивостью образцов, распределенных нами в первой и второй групп, т.е. объединившие образцы с повышенным уровнем устойчивости. Оценивали испытуемые растения путем инокуляции инфекционным соком, полученным из ростков клубней-накопителей ВВКК. В качестве источника инфекции использовали сильный штамм, идентифицированный нами в Северо-Западной зоне РФ, в процессе анализа клубневого материала, репродуцированного из АОЗТ «Онега».
При анализе вовлекали в скрининг образцы коллекции, учитывая их происхождение. Поэтому группировали изучаемый материал исходя из географической принадлежности образцов клубневого материала в коллекции. В иммунологический анализ на фоне искусственного заражения включены 55 образцов, из которых 23 (41,8%) составили дикие виды. Среди них (11 из Южной Америки и 12 из Северной Америки (табл. 5.1), а также 32 сортообразцов (58,1%) различного происхождения х (табл. 5.14, графа 1). В итоге оценки выделившиеся по признаку устойчивости к ВВКК на искусственном инфекционном фоне образцы дикорастущих видов включили 11 генотипов (20%) от 55, вовлеченных в исследование. Среди сортов выделились устойчивостью 12 , что составило 21,8% от числа изученных (табл. 5.14). Достоверность полученных результатов при оценке коллекции с использованием метода растений-индикаторов подтверждена обработкой общепринятыми математическими методами. Формулы и расчет представлены в главе 2, стр. 38-39, а также итоги обработки отражены в таблицах приложения 1 и 2 , стр. 128-151. Наибольшее число устойчивых образцов из южноамериканских видов выделено среди серий: Lignieaulia Hawk., Megistacroloba Card, et Hawk.
При оценке на инфекционном фоне индикаторным методом выделены 6 устойчивых образцов (50%) из 12 изученных североамериканских диких видов картофеля. Результаты представлены в таблице 5.16. Устойчивые виды картофеля выделены среди серий: Demissa Buk; Longipedicellata Buk. Дальнейший анализ устойчивости сортов позволил выделить группу устойчивых, составившую 12 образцов (37,5%). Среди интродуцированных сортообразцов из-за рубежа выявлены 6 генотипов картофеля, устойчивых к ВВКК, т.е. (31,5%) из 19 изученных. Из стран СНГ также на инфекционном фоне оценены 13 образцов, из которых 6 (46,1%) оказались устойчивы к ВВКК при диагностике индикаторным методом (табл. 5.17). После повторного этапа проверки на индикаторах, выделенные наиболее устойчивые образцы из всех изученных на фоне искусственного заражения ВВКК можно рассматривать как источники устойчивости к вироиду.
В итоге оценки выделены как устойчивые к ВВКК на искусственном инфекционном фоне 9 образцов следующих дикорастущих видов. Среди них: южно- американские виды 20160- Solarium holdelmanii Hawr.; 12489- S. kurtzianum Bitt. et Wittm.; 19170- S. raphanifolium Card, et Hawk.; 20899- S. lignicaule Vargas.; 20055- S. gigantophyllum Bitt. и северо- американские виды 19095- S. hougasii Corr.; 19082- S. fendleri A. Gray.; 23561- S. polytrichon Rydb.; 23550- S. polyadenium Greenm.
Эти же виды обладают высокой полевой устойчивостью к некоторым мозаичным вирусам, что делает их ценным исходным материалом для селекции. Среди оцененных нами на фоне искусственного заражения сортов картофеля выделены в качестве устойчивых к ВВКК Чародей, Оредежский, Явор, Альтаир, Aguti, Assia, Fortuna, Karlena, Karida, Valdor. Ботанико- географическая и хозяйственная характеристика выделенных источников, перспективных для селекции на устойчивость к ВВКК В учении о центрах происхождения культурных растений на территории Северной и Южной Америки выделено два основных центра происхождения культурных видов рода Solanum L. : Центрально-американский и Южноамериканский (Вавилов Н.И., 1964). Дальнейшее развитие учения о центрах происхождения культуры картофеля провел СМ. Букасов (1971), подразделив все виды на две географические группы: южноамериканскую и североамериканскую. Их ареал простирается от южной части Чили и Аргентины (от 50 ю.ш.) вдоль Анд, Южной и Центральной Америки до южных штатов США. Среди исследованного нами материала, оказалось 37 видов, сформировавшихся в южноамериканском центре происхождения, где сосредоточено в целом около 150 видов и разновидностей картофеля (Букасов СМ., 1978; Букасов СМ., Камераз А.Я., 1972).
Устойчивые к ВВКК виды картофеля преимущественно произрастают на территории двух ботанико- географических зон охватывающих предгорную полосу , протирающуюся от провинции Тукуман в Аргентине вдоль Боливии до горных районов Перу и Пустынную зону Анд, включающую высокогорные (от 2000 до 5000 м над уровнем моря) районы Анд, а также пустыню Атакама (Горбатенко Л.Е., 1975). Климат в первой зоне жаркий, среднегодовые температуры 16-21, средняя температура зимы 7-15, но зима теплая, заморозков нет, дожди выпадают преимущественно с сентября по апрель. Всего в течение года выпадает 800-1500 мм осадков. На территории этой зоны находятся нижние границы ареалов видов как S. microdontum Bitt, S. kurzianum Bitt. et Wittm., S. vernei Bitt. et Wittm, S. spegazzinii Bitt. et Wittm, S. megistacroiobum Bitt. et Wittm, S. gigantophyllum Hawk. Большинство из них являются ценными источниками устойчивости. В Пустынной зоне Анд климат сухой, с частыми ветрами, со среднегодовой температурой в зависимости от высоты над уровнем моря и географической широты изменяется от 6 до 20С, осадков выпадает 100-400 мм в год. В этой зоне находятся ареалы таких ценных по устойчивости диких видов картофеля как: S. kurtzianum Bitt. et Wittm, S. spegazzinii Bitt. et Wittm и культурного вида S. andigenum Buk. Для северо-американской группы видов рода Solanum L. Мексика является одним из центров происхождения наиболее важных видов картофель (Горбатенко Л.Е., 1975). Дикие виды мексиканского картофеля распространены в пределах 15-32с. ш. на высотах 1500-3800 м над уровнем океана. Средняя температура января от 10 на северо- западе до 25 на юге. В горных котловинах бывают морозы до -20С. В год на южных склонах Мексиканского нагорья выпадает до 4000 мм и более, а в восточной и западной части нагорья -до 1000 мм, во внутренних районах -200-500 мм; наименьшее количество осадков на северо-западе (около 100 мм в год). На территории Мексики произрастают более 35 диких клубненосных видов, в их числе выделенные нами относительно устойчивые к ВВКК виды: как S. hougasii Corr.,S. fendleri A. Gray., S. polyadenium Greenm (Будин K.3, Горбатенко Л.E., 1980).
Ниже приводятся сведения о географии, экологии произрастания и селекционной значимости видов, образцы которых проявили комплексную устойчивость к ВВКК. Сведения по географии и экологии видов приведены по данным Букасова СМ. (1971), хозяйственно-ценные качества видов описаны по Каталогу ВИР (1989; 1992); хозяйственно-ценные признаки сортов составлены по Каталогу ВИР (1999).
