Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. История открытия возбудителя, вызывающего веретеновидность клубней картофеля. Географическое распространение ВВКК 8
1.2. Основные свойства ВВКК 11
1.3. Симптомы поражения и влияние вироидов на растения, штаммы ВВКК, круг растений-хозяев 15
1.4. Методы диагностики ВВКК 19
1.5. Способы распространения и сохранения патогена в природе. Транспорт в растении 25
1.6. Влияние ВВКК на урожайность картофеля и томатов 30
1.7. Способы инактивации ВВКК и меры борьбы с заболеванием 33
Глава 2. Объект и методы исследования
2.1. Объект и материалы исследования 40
2.2. Метод инокуляции растений 42
2.3. Методы препаративного выделения ВВКК
2.3.1. Выделение суммарной низкомолекулярной РНК 42
2.3.2. Фракционирование суммарной РНК методом электрофореза в полиакрил амидном геле (ПААҐ) 44
2.3.3. Методика выделения ВВКК из полиакриламидного геля 44
Глава 3. Совершенствование методов выделения и диагностики вироидов 45
3.1. Диагностика ВВКК методом возвратного электрофореза 49
3.2. Исследование вироидной РНК с помощью сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) 51
3.3. Использование томатов в качестве растений-индикаторов ВВКК 53
Глава 4. Сохранение нативности вироидной РНК во время хранения in vivo и in vitro
4.1. Сохранение инфекционное вироида в препаратах суммарной низкомолекулярной РНК 57
4.2. Сохранение инфекционности ВВКК в сухих листьях 59
4.3. Возможность сохранения и передачи вироида через почву и с растительными остатками 61
4.4. Сохранение вироида в питательном растворе
4.4.1. Влияние возраста растений на скорость заражения их вироидом 66
4.4.2. Способность вироида сохраняться в питательном растворе после удаления из него больных растении 69
4.5. Возможность длительного сохранения вироидов в семенах 69
4,5.1, Возможность сохранения вироида в семенах, утративших всхожесть.72
Глава 5. Влияние ВВКК на растения картофеля
5.1. Особенности первичного заражения картофеля вироидом 73
5.2. Влияние ВВКК на рост и продуктивность различных сортов картофеля 74
Выводы 89
Литература 91
Приложения 108
- Симптомы поражения и влияние вироидов на растения, штаммы ВВКК, круг растений-хозяев
- Способы распространения и сохранения патогена в природе. Транспорт в растении
- Исследование вироидной РНК с помощью сканирующего туннельного микроскопа (СТМ)
- Возможность сохранения и передачи вироида через почву и с растительными остатками
Введение к работе
Картофель является ценной продовольственной, технической и кормовой культурой. Вместе с тем, его производство в нашей стране носит пока экстенсивный характер. Среди множества патогенов, вызывающих болезни картофеля, в последние годы выделяются вироиды, - особый класс патогенов, представленных одной низкомолекулярной РНК, - инфицирование которыми может приводить к снижению урожая до 70 - 90%.
Картофель может поражаться несколькими вироидами, но наиболее опасным является вироид веретеновидности клубней картофеля (ВВКК). В России это заболевание под названием «готика» известно с начала 40-х годов. Однако экономически значимые потери от него отмечались только в Поволжье. Такое положение изменилось, когда в стране было налажено массовое производство безвирусного картофеля, технология получения которого не предусматривала идентификации и освобождения картофеля от ВВКК. В результате во многих регионах посадочный материал оказался инфицирован этим патогеном. В настоящее время семеноводческие хозяйства не только несут большие потери от связанного с вироидом резкого снижения урожая, но и являются распространителями ВВКК в другие регионы (Можаева и др., 1994, 1997; Козлов, Крайн, 1995; Дрыгин и др., 2000; Мусин и др., 2001). Кроме картофеля ВВКК поражаются и другие растения сем. пасленовых, в частности томаты. Растения сем. пасленовых инфицируются и другими вироидами, например, вироидом экзокортиса цитрусовых (ВЭЦ), «планто мачо» томата. Вироиды обладают высокой устойчивостью к действию различных химических соединений и факторов окружающей среды, что исключает возможность излечения пораженных ими растений. Поэтому основные меры защиты должны быть направлены на исключение возможности заражения растений при селекции и промышленном семеноводстве.
5 В этой связи необходимо продолжить изучение свойств вироида, способов его передачи, а также влияния вироида на урожай и его структуру у различных сортов картофеля. Кроме того, необходимо усовершенствовать методы выделения и диагностики с целью более быстрого и надежного определения патогена.
Цель и задачи исследований
Цель исследований - изучение свойств ВВКК, распространения и сохранения патогена в различных условиях. Задачи исследований:
Усовершенствование методов выделения и диагностики вироида.
Исследование стабильности вироида при хранении in vivo и in vitro.
Изучение распространения и сохранения ВВКК в водной среде и в почве.
Изучение влияния ВВКК на продуктивность различных сортов картофеля и томатов.
Научная новизна исследований
Усовершенствована методика получения препаратов ВВКК, используемых при диагностике патогена.
Впервые получено изображение вироиднои РНК с помощью нанотехнологической установки «Луч - 2».
Изучена продолжительность сохранения инфекционности ВВКК и ВЭЦ в растворах РНК и в высушенных листьях.
Установлен срок сохранения вироидов в семенах томатов.
Изучена возможность передачи ВВКК с растительными остатками в почве и с питательным раствором.
Получены новые данные по пораженности, потерям урожая картофеля от ВВКК в зависимости от метеоусловий года, сорта картофеля и количества лет после инфицирования при искусственном заражении.
Практическая значимость работы
Для диагностики ВВКК отработан метод возвратного электрофореза.
Подобраны сорта томатов, которые могут быть использованы в качестве
растений -индикаторов.
Установлено, что передача ВВКК с питательным раствором является серьезной проблемой при выращивании растений на гидропонных установках.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации были представлены на совещании «Совершенствование методов фитосанитарного мониторинга вирусных болезней растений и методов учета сорняков - носителей вирусов», проходившем в ВИЗР 19-21 апреля 2000 г.; научной конференции молодых ученых и специалистов ТСХА в июне 2000 г.; Всероссийской конференции «Болезни основных сельскохозяйственных культур, вызывающие чрезвычайные ситуации: Мониторинг, прогноз, система защиты», проходившей во ВНИИФ в 2001 г.; «VIH-м Международном Симпозиуме по эпидемиологии вирусных болезней», проходившем в Германии в г. Ашерслебене 12-17 мая 2002 г.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, экспериментальной часги (4 главы), выводов и списка
литературы.
Материал изложен на 118 страницах машинописного текста, содержит 7
таблиц, 22 рисунка и 10 приложений. Список литературы включает 237
работы, некоторых 151 на иностранном языке.
Автор выражает благодарность старшим научным сотрудникам ВНИИФ кандидатам биологических наук Т.Б. КастапьевоЙ и Л.А. Щербаковой; сотрудникам Московского института нанотехнологий Международного фонда конверсии В,И. Кузькину, Н.Н, Балану; сотруднику кафедры сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева Ю.М Тикунову; сотруднику МГУ О.А. Кондаковой за помощь, оказанную в процессе выполнения работы.
Симптомы поражения и влияние вироидов на растения, штаммы ВВКК, круг растений-хозяев
Растения, пораженные вироидом веретеновидности клубней картофеля, характеризуются той или иной степенью угнетения роста, прямостоячим и вытянутым габитусом, обусловленным задержкой роста боковых побегов, малым количеством слабоколенчатых стеблей и тем, что уменьшенные листья отходят от стебля под более острым углом (Фомюк, 1953; Леонтьева, 1971; Singh, 1973; Diener, 1979). Перечисленные признаки не являются, однако, достоверным указанием на инфицирование вироидом: существует сорт картофеля Bamberger Hornli, здоровые растения которого имеют такую же форму ботвы, как и растения картофеля, инфицированные вироидом (Гросс, 1987). Цвет ботвы у пораженных растений картофеля в начале вегетации темно-зеленый, а затем желто-зеленый, мозаичность отсутствует. Листья отличаются от здоровых не только размерами, но и слабой рассеченностью. Они более узкие, менее эластичные, со слабо морщинистыми или деформированными долями. Наиболее характерным признаком является деформация конечных долей листа верхнего яруса, средние жилки первой пары долей изгибаются кругообразно, так что концы их нередко заходят один за другой, образуя характерную серповидность. Нередко усиливается плющелистность в сочетании с ассиметрией и деформацией за счет искривления жилок и стягивания краев долей, в результате чего они становятся неравномерно выпуклыми и складчатыми. Наличие некрозов на листьях, стеблях, жилках и черешках, а также отмирание листьев не типично, хотя иногда встречается. Бутоны часто засыхают и отмирают (Метод, указания, 1988, 1999). Клубни с пораженных кустов имеют различную форму: веретеновидную, цилиндрическую, грушевидную с выдающимися над поверхностью глазками и резкими "бровями". Иногда на клубнях образуются глубокие трещины. В годы с жарким и влажным летом симптомы болезни на клубнях усиливаются.
Обычно первое поколение растений, выросших из больных клубней, мало отличается от здоровых. У растений второй и последующей клубневой репродукции заметно отставание в развитии, имеются жесткие мелкие листовые пластинки. Отставание в росте и другие симптомы более заметны к моменту бутонизации. Обычно цветоносы укорачиваются, и бутоны на них не образуются, отсутствует ягодообразование.
Проявление симптомов вироидного поражения и вредоносность вироида зависят от штамма возбудителя, агроклиматических условий, а также возраста пораженного растения, и уменьшаются по мере старения зараженного растения (Леонтьева, 1980).
Сухая и жаркая погода (25 - 30 С), высокая обеспеченность марганцем и хлористым калием в первую половину вегетации усиливают симптомы на ботве, тогда как прохладная и влажная погода, малая интенсивность освещения, орошение, полное минеральное удобрение и азот в аммиачной форме ослабляют их (Метод, указания, 1988). Выдерживание зараженных растений при повышенной температуре в теплице увеличивает проявление симптомов. Удовлетворительные результаты получают, когда температура после заражения сохраняется на уровне выше 20 С, достигая 28 - 32 С в течение нескольких часов в день, или когда постоянно высокая температура поддерживается в течение десяти дней. При этом длина светового дня составляет 16-18 часов, а освещенность 4000 - 7000 люкс (Kryczynski et al., 1980; Метод, указания, 1999).
Появление симптомов при вироидном поражении связано с нарушением метаболизма фитогормонов. Например, значительное уменьшение концентрации гибберилинов было отмечено у Gynura aurantica в ответ на заражение вироидом экзокортиса цитрусовых (Hanks, Feldman, 1972).
Отклонения в структуре клеточной стенки и организации хлорогшастов характерно для растений, зараженных вироидами. Увеличение частоты пролиферации мембраны протоплазмы, так называемых плазмалеммосом или парамуральных тел, было описано для G. aurantica, зараженной вироидом экзокортиса цитрусовых, для томата, зараженного ВВКК, и авокадо, зараженного вироидом солнечного ожога авокадо (Semancik, Vanderwoude, 1976; Hari, 1980; Da Graca, Martin, 1981). Дезорганизация в структуре хлоропластов, искривление мембраны тилакоидов, малое количество гран, исчезновение тонопласта, развал наружной мембраны хлоропластов и освобождение содержимого хлоропластов в цитоплазму наблюдалось в тканях, зараженных вироидом бледности плодов огурца и вироидом карликовости хмеля, при этом разрушение хлоропластов также наблюдалось в растениях, не имеющих видимых симптомов поражения вироидами (Kojima et al., 1983). Под влиянием ВВКК в листьях картофеля и томатов уменьшалось содержание зеленых пигментов, а количество каротиноидов существенно увеличивалось. Листья инфицированных растений отличались большей толщиной, более рыхлой упаковкой клеток палисадной паренхимы, в черешках наблюдалось более раннее и сильное одревеснение проводящих тканей (Марковская, 1983). Фотосинтетическая активность каллусов и культуры клеточной суспензии, полученных из здоровых и зараженных ВВКК клеток томата, показали, что зараженные ВВКК клетки росли медленнее и принимали вид и размер плотной клеточной агрегации. ВВКК также влиял на накопление крахмала в хлоропластах и на деформацию оболочки хлоропластов (Stocker et al., 1993).
Способы распространения и сохранения патогена в природе. Транспорт в растении
Известно несколько способов передачи и распространения ВВКК. Еще в 1923 г. Schultz и Folsom указывали, что патоген, вызывающий веретеновидность клубней, передается соком, клубневыми и стеблевыми прививками и тлями. Goss (1926) смог заразить ВВКК 32,5% растений при резке ножом и при контакте свежих срезов клубней. Леонтьевой (1971) были испытаны различные способы передачи ВВКК. Согласно ее данным, успешнее всего (на 92%) готика передавалась "исхлестыванием" здоровых растений пучком ботвы больных. На втором месте (50-57%) - передача стеблевыми и клубневыми прививками, далее - инокуляция соком. На последнее место поставили передачу с помощью насекомых - 25,5%. Фомюк (1953, 1954) доказала передачу готики соком пораженных растений методом сближения и подсадкой больных растений. Bonde и Merrian (1951) получили достоверные данные о передаче веретеновидности клубней при заражении поврежденных ростков картофеля соком пораженных растений. Механически картофель лучше всего заражается ВВКК через этиолированные ростки, которые натирались инфекционным соком. Уже через год можно было определять ВВКК визуально на клубнях. ВВКК был обнаружен у 77% инокулированных растений, если заражали ростки; у 18% - при инокуляции клубней; у 65 - 70% - при инокуляции листьев (Kaczmarek, 1989). Была доказана возможность заражения картофеля во время движения трактора и других сельскохозяйственных машин за счет приставших к колесам зараженных тканей растений (Merriam, Bonde, 1954).
Goss (1928, 1930) сообщал о переносе патогена некоторыми видами листогрызущих насекомых (Melanoplus sp„ Epitrix cucumeric, Systena elongata, Lygus pratensis, Leptinotarsa decemlineata, Disonicha triangularis). Однако, перенос этими насекомыми осуществлялся при условии, что патоген накоплен в большом количестве в растении и передача производится механически при контакте. Такой тип переноса - неспецифический, и насекомые переносят патоген на "загрязненных" ротовых органах (Salazar, 1996). De Bokx и Piron (1981) продемонстрировали 5%-ную передачу ВВКК тлями Macrosiphum euphorbiae неперсистентным способом. ВВКК может передаваться личинками нематоды Meloidogyne incognita, при этом личинка нематоды является пассивным переносчиком (Salazar, 1996). Salazar с соавторами (1995) обнаружили 100% передачу ВВКК тлями Myzus persicae, когда растения картофеля были заражены ВВКК и ВСЛК. Передачи не было, если тля питалась на растениях, зараженных только ВВКК. Эти данные были подтверждены и другими авторами (Syller et al., 1997; Querci et al., 1997). Одной из особенностей ВВКК является его способность передаваться пыльцой и семенами картофеля и томатов (Singh, Finnie, 1973; Singh et al., 1991b). Hunter с соавторами (1969) отмечали 100%-ное инфицирование семян, когда оба родителя были заражены (картофель с. Katahdin). В то же время, Singh (1970) отмечал низкий процент передачи вироида у томата и картофеля: 11-12% - когда оба родителя были инфицированы, 6% - когда только мужское и 9% - когда только материнское растения были инфицированы. Процент семенной передачи не может быть предсказан. Это, вероятно, зависит от условий выращивания картофеля, условий окружающей среды и штамма вироида (Singh, Finnie, 1973; Singh et al., 1992). В экспериментах, проведенных на Solatium acaule, ВВКК передавался 23-35% семян, когда только один родитель был заражен, и 60 - 100% - когда оба родителя были заражены (Salazar, 1996). Экспериментально передача ВВКК пыльцой пораженных растений была доказана Fernow с соавторами (1970). По его данным перенос вироида при опылении достигает 31%, но может колебаться от 0 до 100%.
Было показано, что ВВКК способен сохраняться в семенах Solanum aculiatissium до четырех лет (McClean, 1948). После хранения при +4 С в течение 12 лет сохранялся в 100% семян картофеля (Grasmic, Slack, 1986). Вироид был также обнаружен в семенах картофеля, хранившихся в бумажных пакетах при комнатной температуре 21 год (Singh et al., 1991b). Корреляции между сроком хранения семян, сортом картофеля и передачей вироида обнаружено не было (Fernow et al., 1970). Томаты (с. Rutgers) могут заражаться ВВКК через корневую систему при совместном выращивании больных и здоровых растений в гидропонной культуре (Можаева и др., 1996). ВВКК способен также сохраняться в воде и питательном растворе в течение срока, достаточного для инфицирования растений этим патогеном через корневую систему. В проведенных опытах растения заражались уже через 7 дней после совместного выращивания больных и здоровых растений. Наличие ВВКК подтвердилось и с помощью растения-индикатора S. sinensis, и с помощью электрофореза в ПААГ (Можаева и др., 1997). Не удалось установить сохранение ВВКК в почве, хотя в 30-х годах XX века проводилась работа по выяснению возможности сохранения данного возбудителя в почве (Goss, 1931).
После заражения ВВКК накапливается в верхушечной части растения, и его количество сокращается сверху вниз (Stark-Lorenzen et al., 1997). В покоящихся клубнях концентрация вироида была больше в образцах, взятых из апикальной или базальной частей клубня, и меньше в образцах из средней его части (Weidemann, 1987). ВВКК не был определен в некоторых глазках и ростках инфицированных клубней, что свидетельствует о неравномерном распределение патогена по тканям растений (Kryczynski et al, 1999). Вироид достигает наибольшей концентрации в волосках листьев. Листья содержат почти вдвое больше вироида, чем пыльца, в пересчете на единицу веса (Singh et al., 1992). При проверке различных частей растений картофеля (пыльники, цветки, соцветия, листья, пестики, лепестки, корни, чашелистики, столоны, клубни) на наличие сурового и мягкого штаммов ВВКК выяснилось, что оба штамма были выявлены во всех частях растения, и только "мягкий" штамм еще и в пыльце. Истинные семена не имели двойного поражения, когда были получены от материнского растения, зараженного обоими штаммами и опыленного пыльцой со здорового растения.
Исследование вироидной РНК с помощью сканирующего туннельного микроскопа (СТМ)
Первый сканирующий туннельный микроскоп создали в 1981 году Г. Бинниг и Г. Рорер. Если два проводника, зонд и подложку свести на расстояние менее пяти ангстрем, то возникает туннельный эффект. Тогда, несмотря на отсутствие между проводниками механического контакта, возникает электрический ток, сила которого меняется на порядок при изменении расстояния на один ангстрем. Когда манипуляторы перемещают зонд над образцом, туннельный ток изменяется в зависимости от профиля поверхности, что и позволяет получать ее изображения, причем с точностью до отдельных атомов (Галлямов, Яминский, 1998, Комаров, 2000). Одно из направлений в развитии нанотехнологии с применением СТМ с нанометровой разрешающей способностью - это быстродействующая диагностика биологических объектов (Keller et al.3 1989; Бахтизин, 2000), Работа была сделана в Московском институте нанотехнологии Международного фонда конверсии. Выделение и очистку ВВКК из растений томата сорта Rutgers проводили по принятой во ВНИИФ методике, а вироидной РНК - с использованием препаративного электрофореза в ПААГ. В растворах суммарной низкомолекулярной РНК, выделенной из зараженных растений, после концентрирования содержится около 2% вироидной РНК (Васильева, 1985). Удаление растительных РНК, а также фрагментов ДНК из раствора суммарной РНК представляет основную трудность при получении очищенного препарата ВВКК. После электрофореза полосу геля, содержащую ВВКК, вырезали и элюировали ТКМ-буфером. НК осаждали 2%-ым ЦТМАБ, а затем переводили в натриевую соль и растворяли в 10 мМ ацетате аммония. 2 мкл раствора, содержащего около 1 мкг ВВКК, наносили на подложку, которая представляла собой поликоровую пластинку размерами 20 х 10 мм с нанесенной ионно-лучевым распылением пленкой золота толщиной 0,5 мкм. Полученные образцы исследовали на нанотехнологической установке «Луч-2» в режиме нормального сканирования и в режиме определения работы выхода электрона (так называемой туннельной спектроскопии). Размер поля сканирования 500x500 нм. На фото, полученном в режиме определения работы выхода электрона, видны линейные и кольцевые молекулы ВВКК (рис. 6). Их размеры совпадают с размерами, указанными в литературе. Так, размер денатурированной кольцевой молекулы равен 140 ± 10 нм, а ее линейной формы 110 ± 10 нм (McClements and Kaesberg, 1977). Несмотря на то, что в последнее время появились новые методы идентификации вироидов, обладающие высокой чувствительностью, метод растений-индикаторов остается одним из наиболее доступных и легко осуществимых.
По чувствительности он не уступает современным молекулярным методам. Известно, что различные сорта томатов по-разному отвечают на заражение ВВКК: одни имеют ярко выраженные симптомы заболевания, у других симптомы едва выражены (Леонтьева, 1980; Singh, O Brien, 1970). Традиционно в качестве растений-индикаторов используют томаты сорта Rutgers. Однако и другие сорта томатов, в том числе отечественные, могли бы быть использованы для этой цели. Четыре сорта томатов - Сибирский скороспелый, Сонато, Волгоградский 5/95, Эчмиадзинский - наряду с сортом Rutgers были инокулированы РНК, содержащей ВВКК, и выращивались в условиях теплицы. Заражение растений проводили в соответствии с методикой, приведенной в разделе 2.1. В опыте использовали по 10 растений (5 растений для заражения, 5 - для контроля) каждого сорта. Через каждые семь дней после заражения измеряли высоту растений и наблюдали за появлением симптомов заболевания. Степень проявления симптомов сравнивали с симптомами на растениях сорта Rutgers. Дневная температура в теплице во время проведения опыта была выше + 30 С, что способствовало накоплению вироида и проявлению симптомов на растениях.
Возможность сохранения и передачи вироида через почву и с растительными остатками
Являясь высоко устойчивым и контагиозным патогеном, ВВКК легко передается механически соком больных растений (Diener, 1979), при черенковании и прививке (Salazar, 1996), насекомыми, семенами и пыльцой (Fernow et al., 1970; Mink, 1993; Salazar, 1996), способен распространяться с водой и питательным раствором. О сохранении и распространении вироида с почвой однозначных данных нет, хотя в 30-х годах XX века проводилась работа по выяснению возможности сохранения данного возбудителя в почве (Goss, 1931). Одной из целей нашей работы было изучение возможности передачи ВВКК через почву. В пятилитровые вазоны высаживали по 2 - 3 клубня картофеля и выращивали в летней теплице. Для посадки использовали клубни, имевшие симптомы вироидного поражения. В качестве отрицательного контроля -безвирусные клубни, свободные от ВВКК. Через 2 месяца после посадки брали листья для диагностики на наличие ВВКК. Все вазоны с картофелем, имевшим положительную реакцию на ВВКК, оставили для дальнейшего проведения опыта. Вазоны с контрольными растениями, не имевшими вироида, выращивали в отдельном боксе. Схема проведения опыта представлена на рисунке 8. Являясь высоко устойчивым и контагиозным патогеном, ВВКК способен распространяться с водой и питательным раствором. В литературе имеются данные о том, что томаты могут заражаться ВВКК через корневую систему при совместном выращивании больных и здоровых растений в гидропонной культуре (Можаева и др., 1996). Целью нашей работы было установить минимальный промежуток времени необходимый для заражения, а также влияние возраста растения на скорость заражения при совместном выращивании больных и здоровых растений в питательном растворе. Растения томатов с. Rutgers выращивали в почве в теплице.
В соответствии со схемой опыта одну группу растений заражали раствором суммарной РНК, содержащей ВВКК. Другая группа растений оставалась неинокулированной. Через два месяца после посева растения извлекали из почвы, промывали корни и помещали в сосуды с питательным раствором № 30 (приложение 2) (Бентли, 1965). Повторность в опыте двукратная. В каждый сосуд помещали по два инокулированных растения, по два здоровых и по десять черенков, взятых со здоровых растений. В отдельном боксе в тех же условиях выращивали здоровые растения и черенки от здоровых растений. Стебли и листья здоровых и больных растений изолировали друг от друга, но корни их свободно соприкасались в растворе, Томаты выращивали в теплице, воду и питательный раствор доливали по мере испарения и потребления их растениями. Отбор черенков и растений проводили в соответствие со схемой опыта. С каждого варианта брали листья для анализа. Из отобранных образцов выделяли суммарную низкомолекулярную РНК, которой заражали томаты. Через два месяца проводили отбор листьев, выделяли суммарную РНК и определяли наличие вироида с помощью электрофореза в ПААГ. Схема опыта Опытные варианты: 1. Здоровое растение помещали в раствор одновременно с зараженным ВВКК растением на 5 дней; 2. Здоровое растение помещали в раствор одновременно с зараженным ВВКК растением на 10 дней; 3. Здоровое растение помещали в раствор одновременно с зараженным ВВКК растением на 15 дней; 4. Черенки поставили одновременно с зараженным растением и отбирали через сутки после начала опыта; 5. Черенки поставили одновременно с зараженным растением и отбирали через 3 суток; 6. Черенки поставили одновременно с зараженным растением и отбирали через 5 суток; 7. Черенки поставили одновременно с зараженным растением и отбирали через 10 суток; 8. Черенки поставили одновременно с зараженным растением и отбирали через 15 суток. Контрольные варианты: 1. Здоровое растение стояло в растворе 15 дней; 2. Черенки стояли в растворе сутки; 3. Черенки стояли в растворе 5 суток; 4, Черенки стояли в растворе 15 суток.
